Введение
Отравления остаются одной из главных причин насильственной смерти [1, 2]. В настоящее время отмечается большое число отравлений миорелаксантом баклофен (торговые названия Баклосан, Лиорезал). Этот препарат — бета-р-хлорфенильное производное гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), имеющее химическое сходство с производными гамма-оксимасляной кислоты: аминалоном и фенибутом. От фенибута препарат отличается наличием атома хлора в пара-положении фенильного ядра [3—5].
Механизм действия баклофена до сих пор изучен недостаточно. Известно, что этот препарат вызывает угнетение моносинаптических и полисинаптических рефлексов, снижает активность гамма-мотонейронов, чем и объясняется его миорелаксирующий эффект. Баклофен угнетает рефлекторные коллатерали, связывающие альфа-1-нервные волокна мышц и альфа-мотонейроны эфферентной части гамма-петли, что приводит к снижению выраженности мышечных спазмов. Препарат является селективным агонистом ГАМКб-рецепторов, стимуляция которых приводит к снижению выделения глутамата и аспартата, играющих важную роль в развитии спазма.
Баклофен быстро и полностью абсорбируется в желудочно-кишечном тракте с биодоступностью 70—80%. Его максимальная концентрация в плазме (0,3—0,6 мкг/мл) достигается примерно через 3 ч после перорального введения, а его основного метаболита (бета-[p-хлорфенил])-гамма-гидроксимасляная кислота) — примерно через 4,5 ч (менее 0,2 мкг/мл) [4, 5].
В экспериментах на животных было показано, что баклофен легко проникает во внутренние органы, например печень и почки, и медленно выводится из головного мозга и других структур нервной системы [6—8].
Показаниями к применению баклофена в пероральной форме являются рассеянный склероз с сильными мышечными судорогами, заболевания спинного мозга различного генеза, включая опухоли, инфекционные заболевания, травмы, острые нарушения мозгового кровообращения и менингит [3, 4]. Баклофен обладает выраженным обезболивающим действием [7, 8]. Препарат противопоказан при спазмах мышц, возникающих из-за ревматологических заболеваний. Если баклофен в пероральной форме недоступен или неэффективен, используют интратекальную форму [3, 4]. Были проведены исследования, в которых изучалась эффективность баклофена при лечении алкоголизма [9—11]. Авторы сделали вывод о необходимости дальнейших исследований на большей выборке пациентов для подтверждения его эффективности при лечении алкоголизма [9].
Баклофен обладает выраженным психоактивным эффектом и часто используется наркозависимыми людьми преимущественно молодого возраста [4]. При подозрении на отравление баклофеном необходима дифференциальная диагностика для определения оптимальных реабилитационных мероприятий. Понимание процессов, происходящих в организме на разных стадиях такого отравления, помогает своевременно оказывать помощь этой категории пациентов. В случае смертельного исхода важно выявить непосредственную причину смерти [12].
Морфологические изменения в легких при введении баклофена изучены недостаточно [3]. Тем не менее выявление структурных изменений, возникающих в легких, и изучение процессов, их вызывающих, является важным условием разработки эффективных лечебных мероприятий и будет полезно при установлении непосредственной причины смерти.
На современном этапе развития науки большое значение для решения многих задач имеет метод иммуногистохимии (ИГХ) [13]. Известно, что при его применении возможно установить точную локализацию в тканях разных клеток, их рецепторов, ферментов, иммуноглобулинов, компонентов клеточного цитоскелета (сократительные и промежуточные филаменты), а также отдельных генов. Патохимические мишени при различных отравлениях находятся на молекулярном уровне, а метод ИГХ дает возможность визуализировать происходящие процессы.
Гены Bax и Bcl-2 кодируют гомологичные белки, оказывающие противоположные эффекты на жизнедеятельность клетки. Bcl-2 пролонгирует выживание клеток, а Bax, наоборот, ускоряет апоптоз [14]. Было высказано предположение, что соотношение белков Bcl-2 и Bax может указывать на способность клетки к апоптозу. В 5`-UTR-области ген BAX содержит р53-респонсивный элемент, который, будучи помещен в векторе перед репортерным геном, значительно усиливает его транскрипцию [15]. Модель, построенная на основе этих данных, позволяет высказать предположение, что повышение активности p53 ДНК-повреждающими или какими-либо другими агентами может повышать восприимчивость клеток к сигналам входа в апоптоз через опосредованное p53 влияние на экспрессию генов Bax и Bcl-2. Такие p53-опосредованные изменения экспрессии генов Bax и Bcl-2 могут изменять соотношение белков Bax и Bcl-2, тем самым переводя клетку в состояние повышенной готовности к апоптозу.
Цель работы — изучение гистологических изменений в легких крыс, оценка их динамики и определение экспрессии генов Bax и Bcl-2 в эпителии бронхов, альвеолоцитах 1-го типа и в нейтрофилах в разные сроки после введения баклофена.
Материал и методы
Эксперименты проводили на 20 половозрелых (в возрасте 20 нед) крысах-самцах линии Wistar массой 290—350 г. Животных распределили на 4 группы (по 5 крыс в каждой). Эксперименты проводили в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [16]. Баклофен в дозе 85 мг/кг и комбинацию препарата вводили животным под общим наркозом (хлоролаза) через назогастральный зонд.
Выделили следующие группы животных:
— контрольная группа — животные, не получавшие баклофен;
— 1-я группа — животные, получавшие баклофен в дозе 85 мг/кг, длительность эксперимента составила 3 ч (время достижения максимальной концентрации препарата в крови);
— 2-я группа — животные, получавшие баклофен в дозе 85 мг/кг, длительность эксперимента — 4,5 ч (период полувыведения препарата и время достижения в крови максимальной концентрации основного метаболита препарата — бета-[p-хлорфенил])-гамма-гидроксимасляной кислоты);
— 3-я группа— животные, получавшие баклофен в дозе 85 мг/кг, длительность — 24 ч.
После введения баклофена крыс выводили из наркоза и оставляли в виварии со свободным доступом к воде, но без пищи. Через 3, 4,5 и 24 ч животных выводили из эксперимента путем смещения шейных позвонков под наркозом (хлоралгидрат). Грудную полость вскрывали, легкие извлекали, помещали в 10% нейтральный формалин, а затем заключали в парафин. Готовили срезы легких толщиной 5 мкм, наносили на предметные стекла, окраску гематоксилином и эозином проводили по общепринятой методике.
Наличие или отсутствие того или иного гистологического признака устанавливали, используя критерий Фишера. Наличие признака считали статистически значимым, если он появлялся в 4 или 5 случаях и не появлялся ни в одном случае.
ИГХ-окрашивание осуществляли с использованием кроличьих поликлональных антител против крысиного антигена Bcl-2 (AF6139) и Bax (AF0120), использовали систему детекции ab64261 — Rabbit Specific HRP/DAB (Abcam). Закрепленный формалином и залитый парафином участок легких депарафинизировали и регидратировали, добавляли достаточное количество перекиси водорода (по каплям), чтобы покрыть срезы, выдерживали в течение 10 мин, а затем дважды промывали в буфере, наносили несколько капель раствора для блокировки неспецифического связывания антител и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Далее образцы промывали 1 раз в буфере, наносили первичные кроличьи поликлональные антитела против крысиного Bcl-2 (AF6139) и Bax (AF0120), инкубировали в течение 10 мин, промывали 4 раза в буфере, а затем наносили достаточное количество биотинилированных козьих поливалентных антител, чтобы покрыть срезы тканей, инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали 4 раза в буфере. Далее наносили стрептавидинпероксидазу и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали 4 раза в буфере; добавляли 30 мкл (1 каплю) хромогена DAB к 1,5 мл (50 капель) субстрата DAB, перемешивали и наносили на образцы. Выдерживали в течение 5 мин, промывали 4 раза в буфере. Потом наносили гематоксилин Майера, обезвоживали и покрывали стеклом.
Оценивали выраженность экспрессии Bax и Bcl-2 в бронхиальном эпителии, альвеолоцитах 1-го типа и нейтрофилах («−» — экспрессия отсутствует; «+» — экспрессия слабо выражена; «++» — экспрессия умеренно выражена»; «+++» — экспрессия сильно выражена).
Полученные препараты изучали при увеличении ·100, ·200 и ·400. Использовали микроскоп Nikon E-400 с видеосистемой на основе камеры Watec 221S.
Данные, полученные при исследовании препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, согласовались с данными, полученными в исследовании, проведенном ранее [17]. В легких животных группы контроля патологических изменений не отмечали. После введения баклофена в легких экспериментальных животных наблюдали развитие комплекса патологических изменений, включавших в себя нарушения кровообращения (полнокровие венул, капилляров, кровоизлияния в межальвеолярные перегородки (МАП), в альвеолы, сладж), появление участков эмфиземы, чередующихся с участками дистелектазов, развитие клеточной реакции (скопление сегментоядерных лейкоцитов на территории МАП, утолщение МАП за счет отека и инфильтрации лейкоцитами). Наибольшей выраженности указанные патологические изменения достигали к 24-му часу (например, кровоизлияния в альвеолы наблюдали только через 24 ч после введения баклофена.
При проведении ИГХ-исследования бронхиального эпителия крыс группы контроля отмечали, что экспрессия Bax была слабо выражена (+), что свидетельствует о низком уровне апоптоза; экспрессия Bcl-2 была также слабо выражена (+). Экспрессия Bax и Bcl-2 в альвеолоцитах 1-го типа и нейтрофилах также была слабой (+) (рис. 1 на цв. вклейке).
Рис. 1. Легкое крысы группы контроля.
Слабая экспрессия Bax в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа (ув. 200).
При проведении ИГХ-исследования бронхиального эпителия и альвеолоцитов 1-го типа крыс 1-й группы (баклофен, 3 ч) экспрессия Bax была сильно выражена (+++), а экспрессия Bcl-2 была умерено выражена (++) (рис. 2 на цв. вклейке). Экспрессия Bax и Bcl-2 в нейтрофилах также была умеренной (++).
Рис. 2. Легкое крысы 1-й группы (баклофен, 3 ч).
Умеренная экспрессия Bcl-2 в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа (ув. 200.)
В бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа животных 2-й группы (баклофен, 4,5 ч) экспрессия Bax была сильно выражена (+++) (рис. 3 на цв. вклейке), что свидетельствует о высоком уровне апоптоза; экспрессия Bcl-2 также была сильно выражена (+++). В нейтрофилах экспрессия Bax была умеренной (++), а Bcl-2 — сильно выраженной (+++).
Рис. 3. Легкое крысы 2-й группы (баклофен, 4,5 ч).
Сильная экспрессия Bax в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа (ув. 200).
Экспрессия Bax в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа у животных 3-й группы (баклофен, 24 ч) была умерено выражена (++), что свидетельствует об умеренном уровне апоптоза. Экспрессия Bcl-2 в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа в этой группе была сильно выражена (+++) (рис. 4 на цв. вклейке). Экспрессия Bax в нейтрофилах была слабой (+), а Bcl-2 — сильно выраженной (+++).
Рис. 4. Легкое крысы 3-й группы (баклофен, 24 ч).
Сильная экспрессия Bcl-2 в бронхиальном эпителии (ув. 100).
Результаты проведенного ИГХ-исследования приведены в таблице.
Результаты ИГХ-исследования легких крыс
| Параметр | Контроль | 1-я группа (баклофен, 3 ч) | 2-я группа (баклофен, 4,5 ч) | 3-я группа (баклофен, 24 ч.) | ||||
| Экспрессия | ||||||||
| Bax | Bcl-2 | Bax | Bcl-2 | Bax | Bcl-2 | Bax | Bcl-2 | |
| Бронхиальный эпителий | + | + | +++ | ++ | +++ | +++ | ++ | +++ |
| Альвеолоциты 1-го типа | + | + | +++ | ++ | +++ | +++ | ++ | +++ |
| Нейтрофилы | + | + | ++ | ++ | ++ | +++ | + | +++ |
Обсуждение
Наиболее ранними гистологическими изменениями, выявленными в легких после введения баклофена, являлись расстройства микроциркуляции: полнокровие вен, артерий, капилляров; кровоизлияния в МАП, альвеолы, сладж-феномен.
Баклофен — селективный агонист ГАМКb-рецепторов. Он действует на уровне спинного мозга и угнетает моносинаптические и полисинаптические рефлексы, снижая активность гамма-мотонейронов. При введении баклофена отмечают снижение тонуса скелетных мышц, включая межреберные. Их чрезмерное расслабление приводит к затруднению дыхания с последующим развитием гипоксии. Являясь селективным агонистом ГАМКb-рецепторов, баклофен в высоких дозах вызывает стимуляцию и ГАМКa-рецепторов. В результате этого происходит сокращение гладкой мускулатуры бронхов и бронхиол, развивается спазм и затруднения дыхания, что также приводит к увеличению сосудисто-тканевой проницаемости [18, 19].
У животных экспериментальных групп (1—3-я) отмечали деформацию бронхов. В легких участки ателектаза и дистелектаза чередовались с участками эмфиземы. Эти изменения усугубляют гипоксию и способствуют повышению проницаемости сосудов микроциркуляторного русла, что, в свою очередь, приводит к развитию интерстициального и интраальвеолярного отека, что наблюдали в экспериментальных группах.
Одним из ранних признаков повреждения легких является также увеличение содержания сегментоядерных лейкоцитов и макрофагов в капиллярах, венулах, периваскулярной соединительной ткани, а также на территории МАП.
Семейство генов Bcl-2 регулирует апоптоз [20]. Гены Bax и Bcl-2 кодируют гомологичные белки, которые оказывают противоположное влияние на активность клеток. В то время как Bcl-2 пролонгирует выживание клеток, Bax ускоряет апоптоз. Проведенное исследование подтвердило, что клетки бронхиального эпителия, альвеолоциты 1-го типа и нейтрофилы экспрессируют Bcl-2 (слабая экспрессия) и Bax (слабая экспрессия). Это позволяет предположить, что экспрессия Bcl-2 и Bax может регулировать апоптоз в физиологическом состоянии. Через 3 ч после введения баклофена отмечали сильную экспрессию Bax (+++) и умеренную экспрессию Bcl-2 (++) в клетках бронхиального эпителия и альвеолоцитах 1-го типа. Полученные данные позволяют высказать предположение, что повышенная экспрессия Bax способствует апоптозу в очаге поражения. Через 4,5 ч после введения баклофена экспрессия Bax и Bcl-2 в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа была сильной (+++). Через 24 ч после введения баклофена экспрессия Bax в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах 1-го типа была умеренной (++), а экспрессия Bcl-2 — сильной (+++), что, возможно, отражает процесс регенерации.
Заключение
После введения баклофена в легких экспериментальных животных развивается комплекс патологических реакций, включающих в себя расстройства кровообращения (венулярное и капиллярное полнокровие, кровоизлияния в МАП, альвеолы, сладж), появление участков эмфиземы, чередующихся с ателектазами и дистелектазами. В условиях нарастающей гипоксии увеличивается сосудисто-тканевая проницаемость и развивается отек. Комплекс патологических изменений в легких, выявленный по результатам настоящего исследования, имел определенную динамику. Данные о морфологических изменениях в легких в совокупности с результатами химического исследования могут быть использованы для диагностики отравлений баклофеном и для установления времени, прошедшего с момента введения этого препарата.
Результаты, полученные в ходе проведенного ИГХ-исследования, позволяют предположить участие апоптоза в развитии поражения бронхиального эпителия и альвеолоцитах 1-го типа. Кроме того, экспрессия Bcl-2 в эпителиальных клетках может играть определенную роль в процессе его регенерации.
Исследование было проведено на средства государственного задания №122032100086-3.
The study was carried out at the expense of the state task No. 122032100086-3.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.