Проблемы идентификации и определения лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов в крови во многом определяются выбором методов пробоподготовки и анализа. Широкое использование в аналитических лабораториях газовой хроматографии с масс-спектрометрическим (ГХ/МС) детектированием как метода анализа позволило значительно повысить чувствительность и селективность при скрининге наркотических и лекарственных веществ. Последнее является важным моментом на фоне появления новых синтетических наркотических средств. Применение таких традиционных методов анализа, обладающих ограниченной чувствительностью и селективностью, как тонкослойная хроматография, газовая хроматография с пламенно-ионизационным или термоионным детектированием и высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектором, в современных условиях сохраняют значение при проведении частных исследований для узких групп соединений и их метаболитов.

Появление и развитие метода твердофазной экстракции (ТФЭ) в пробоподготовке образцов для анализа дало новый качественный толчок, в том числе за счет возможности подбора специфичных сорбентов.

Наилучшим выбором для скрининга лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов в биологических образцах на текущий момент являются типы зернистых сорбентов, имеющих смешанные фазы, такие как октил- или октодецил- и катионит [1]. Имеется незначительное количество работ, рассматривающих ТФЭ на патронах со смешанной фазой для пробоподготовки крови или ее компонентов (сыворотка, плазма), с целью анализа наркотических и лекарственных веществ [2—6].

Ранее уже освещалось проведение анализа крови с помощью ГХ/МС с применением ТФЭ [7—9]. Разнообразие подходов непосредственно в пробоподготовке крови методом ТФЭ требует оптимизации применяемых операций для гармонизации конечных результатов скрининга.

Цель работы — определение оптимальных условий пробоподготовки образцов крови методом ТФЭ с последующей ГХ/МС для скрининга лекарственных и наркотических веществ. Применяли моделирование Бокса—Бенкена, представляющее собой мультивариативный метод для подбора оптимальных значений исследуемых факторов.

Оборудование: газовый хроматограф Agilent 7820, масс-селективный детектор Agilent 5975 (фирма «Agilent», США), колонка капиллярная НР-5MS (внутренний диаметр 0,25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0,25 мкм), система с вакуумной камерой на 12 позиций («Supelco»), насос низкого вакуума AIR CADET, США, картриджи Sampli Q Evidex 200 мг — 3 мл (фирма «Agilent», США), термоблок ПЭ-4030, одноканальный испаритель ПЭ-2300, микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия); полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4—40, 40—200 мкл и 0,2—1,0 и 1—5 мл.

Материалы: кислота салициловая (ГФ X, ФС 21), кокаина гидрохлорид (ГФ X, ФС 167), изониазида (ГФ X, ФС 357), морфина гидрохлорид (ФС 413, ГФ X), амфетамина сульфат (ГФ X, ФС 513), фенобарбитал (ГФ X, ФС 517), реланиум (ампулы по 2 мл с содержанием диазепама 5 мг/мл (фирма «Polfa», Польша), метиндол (ампулы по 2 мл с содержанием индометацина 30 мг/мл (фирма «Polfa», Польша), субстанция кеторолака трометамина (фирма «Чемо Иберика С.А..», Испания); бензоилэкгонин (экгонин готовили из кокаина гидрохлорида согласно публикации E. Pinero и соавт. [10]), 2,2,3,3,3-пентафтор-1-пропанол (Sigma-ALDRICHCHEMI, Германия), метилйодид («Вектон», Шосткинский завод химреактивов, Россия). Буферные растворы: 1/15 М фосфатный буфер рН 6,0; 1/15 М фосфатный буфер рН 5,4; 1/15 М фосфатный буфер рН 4,8. Органические растворители: дихлорметан (х.ч.), пропанол-2 (х.ч.), 95% этанол (х.ч.), гексан (о.х.ч.), этилацетат (х.ч.), 99,6% метанол (х.ч.).

Прочие реактивы: аммиака раствор концентрированный 25% (ГФ XII), уксусная кислота ледяная (ГФ XII), азот (о.с.ч.), гелий (о.с.ч.).

Спиртовые растворы стандартов (№ 1— № 4): № 1 — индометацина 0,1 мг/мл, кеторолака 0,02 мг/мл, салициловой кислоты 0,1 мг/мл, фенобарбитала 0,2 мг/мл; № 2 — амитриптилина 0,02 мг/мл, амфетамина 0,02 мг/мл, диазепама 0,02 мг/мл, морфина 0,01 мг/мл; № 3 — изониазида 0,06 мг/мл; № 4 — кокаина гидрохлорида 0,01 мг/мл, бензоилэкгонина 0,01 мг/мл, экгонина гидрохлорида 0,005 мг/мл.

Интактную кровь до исследования хранили при температуре 18 ^оС.

Пробоподготовка.Во флакон вносили 0,5 мл крови, прибавляли по 50 мкл растворов стандартов (№ 1—№ 4), 2 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН в соответствии с кодированным уровнем). Флаконы плотно укупоривали и помещали в ультразвуковую баню на 5 мин. Содержимое флаконов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, центрифугат отделяли от осадка.

Процедура твердофазной экстракции (базовый уровень, все факторы имеют уровень 0).Кондиционирование сорбента проводили путем последовательного пропускания через картридж 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН 5,4). Далее загружали образец со скоростью 1 мл/мин. Промывку осуществляли последовательно со скоростью 2—3 мл/мин по 1 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН 5,4), 0,01 М раствора уксусной кислоты и 10% этанола. Сушили патрон под вакуумом в течение 20 мин.

Элюат I. Элюировали 2 раза по 2 мл смеси н-гексан-этилацетат (3:1). Промывку осуществляли 1 мл 50% раствора метанола.

Элюат II. Элюировали 2 раза по 2 мл смеси дихлорметан-изо-пропанол-25% аммиак (3:1:0,1).

Процедура твердофазной экстракции (после оптимизации). Кондиционирование сорбента проводили путем последовательного пропускания через картридж 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН 4,8). Далее загружали образец со скоростью 1 мл/мин. Промывку осуществляли последовательно со скоростью 2—3 мл/ мин: 1 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН 4,8), 1 мл 10% этанола. Сушили патрон под вакуумом в течение 20 мин.

Элюат I. Элюировали 2 раза по 2 мл смеси н-гексан-этилацетат (2:1). Элюат II. Элюировали 2 раза по 2 мл смеси дихлорметан-изо-пропанол-25% аммиак (2:1:0,1).

Для оценки эффективности экстракции к элюатам I и II добавляли по 50 мкл спиртового раствора 1 мг/мл динонилфталата (ДНФ). Далее элюаты I и II испаряли в токе азота при температуре 40 °C.

Метилирование.К сухому остатку элюата I добавляли 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и 20—25 мг безводного карбоната калия, герметично закрывали и нагревали при температуре 60 °C в течение 1 ч в термоблоке. Флакон охлаждали, отбирали жидкую фазу реакционной смеси, переносили в виалу и испаряли в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в инжектор ГХ/МС.

Стадия 1 (ацетилирование). К сухому остатку элюата II добавляли 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида, замывая стенки флакона; флакон плотно укупоривали и выдерживали 30 мин при температуре 80 °С. После охлаждения флакон вскрывали и выпаривали избыток реагентов в токе азота (до температуры 40 °С).

Стадия II (этерификация).К сухому остатку добавляли 20 мкл 2,2,3,3,3-пентафтор-1-пропанола и 60 мкл уксусного ангидрида, замывая стенки флакона; флакон плотно укупоривали и выдерживали 30 мин при температуре 60 °C. После охлаждения флакон вскрывали и выпаривали избыток реагентов в токе азота (до температуры 40 °С). Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в инжектор ГХ/МС.

Режим работы газового хроматографа с масс-селективным детектором. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1,5 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 15:1, с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задавалась 250 и 280 °C. Температура колонки начальная 70 °C в течение 2 мин и прогрев до 280 °C со скоростью программирования 20 °С/мин, выдержка при конечной температуре 12,5 мин. Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали равной величине автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров для метильных и ацетильных производных в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42—450 а.е. Обработку хроматограмм для идентификации компонентов проб проводили с использованием программы ChemStation G1701DA.

Процедура оптимизации. Оптимизацию условий проведения ТФЭ выполняли с помощью математического планирования эксперимента с применением многофакторного трехуровневого моделирования Бокса—Бенкена. Результаты обрабатывали с помощью программы Statistica6.1.

Выбор и построение плана проведения экспериментальных исследований. Применен 7-факторный (для соединений основного характера) и 5-факторный (для соединений кислотного характера) 3-уровневый план Бокса—Бенкена, позволяющий минимизировать число экспериментов, что ведет соответственно к сокращению временных и материальных затрат.

Разработка математической модели (функции), отражающей зависимость ключевого параметра оптимизации — эффективность экстракции (ЭЭ), от значений влияющих факторов, описывается функцией ω=f (x₁, x₂, x₃, x₄, x₅, x₆, x₇ ) для соединений основного характера ифункцией ω=f (x₁, x₂, x₃, x₄, x₅ ) для соединений кислотного характера. В табл. 1 приведены матрицы планирования факторного эксперимента с реальными и кодированными величинами.

Исследование ЭЭ (в %) модельных соединений проводили по схеме трехфакторного планирования экспериментов с применением плана Бокса—Бенкена (7/1/15 — 7 факторов, 1 блок, 62 опыта). Для получения математической модели процесса ТФЭ реализовали две повторности плана Бокса—Бенкена после его рандомизации.

Для проверки качества аппроксимации полученных уравнений регрессии рассчитали: коэффициент множественной корреляции r, коэффициент детерминации r², фактический критерий Фишера (F_факт), уровень значимости критерия Фишера (p) и стандартную ошибку (SS). Полученные данные приведены в табл. 2.

Значение коэффициента множественной корреляции r<0,3 для изониазида, салициловой кислоты указывает на отсутствие прямой связи между ЭЭ и рассмотренными факторами, а вычисленный для моделей морфина, амитриптилина, амфетамина, кокаина, фенобарбитала и индометацина 0,3 <r< 0,5 свидетельствует о слабой прямой зависимости ЭЭот изменений варьируемых в исследовании факторов. Для модели кеторолака +0,5 ≤r≤+0,7 соответствует прямой умеренной взаимосвязи, для моделей бензоилэкгонина и диазепама +0,7<r<+1 свидетельствует о прямой существенной (сильной) связи между результативным показателем эффективности экстракциии набором факторных показателей.

Коэффициент детерминации r²показывает, какая доля вариации результативного показателя (ω) связана с вариацией факторных показателей. Этот коэффициент принимает значения от 0 до 1, и чем ближе значение коэффициента к 1, тем сильнее зависимость, причем при r²>0,5 модель можно считать приемлемой. Как видно из данных табл. 2, значения r²для бензоилэкгонина и диазепама интерпретируются как хорошее соответствие модели полученным данным, что соответствует высокой точности аппроксимации.

Статистическую надежность множественной регрессии оценивали с помощью общего F-критерия (критерий Фишера), который проверяет нулевую гипотезу (Н0) о статистической незначимости параметров регрессионных уравнений. Сравнивали фактические значения F-критерия (F_факт), представленных в табл. 2, с табличным значением F-критерия (F_табл), определенным с использованием таблицы [11] по заданным уровню значимости (α=0,05, т. е. 5%) и числу степеней свободы. Для соединений основного характера (df1= 7 и df2=54), F_табл=2,23. Для соединений кислотного характера (df1= 5 и df2=56), F_табл=2,41.

В регрессионном анализе для бензоилэкгонина, диазепама, фенобарбитала, кеторолака и индометацина F_факт >F_табл, поэтому с вероятностью более 95% принимается гипотеза, что полученные значения не случайны и сформированы под влиянием существенных факторов. Таким образом, признается статистическая значимость регрессионных уравнений и их параметров для перечисленных модельных соединений.

Оценка полученных результатов регрессионного анализа для морфина, амитриптилина, амфетамина, кокаина, изониазида, салициловой кислоты по критерию Фишера сводится к выводу о том, что для этих анализируемых соединений вероятность случайного формирования F-критерия больше принятого стандарта α=0,05 (5%), F_табл >F_факт и соответственно полученные значения могли появиться случайно, т. е. сформироваться под влиянием несущественных факторов.

Полученные коэффициенты регрессии (β) для модельных соединений приведены в табл. 3.

Из приведенных данных (см. табл. 2 и 3) видно, что для модельных соединений влияние большинства исследованных факторов на ЭЭ отсутствует или оно незначительное. Выраженное влияние для некоторых соединений на ЭЭ имеют факторы x₃ и x₄.

Факторы и их сочетание, приводящие к наибольшим значениям полученных величин ЭЭ для исследованных веществ, представлены далее.

Бензоилэкгонин. Изменение значений факторов x₁ и x₃ ведет к значимому влиянию на величину ЭЭ бензоилэкгонина (рис. 1). Из контурной диаграммы следует, что выраженное значение имеет фактор x₃, и с увеличением концентрации уксусной кислоты растет ЭЭ бензоилэкгонина. Фактор x₁ имеет меньшее влияние, оптимальное значение показателя кислотности в диапазоне pH 4,8—5,4.

Диазепам. Изменение значений факторов x₃ и x₄ ведет к значимому влиянию на величину ЭЭ диазепама (рис. 2). Как следует из диаграмм, выраженное значение имеет фактор x₃. С увеличением концентрации уксусной кислоты ЭЭ диазепама для элюента I резко снижается, при этом растет ЭЭ диазепама для элюента II. Применение уксусной кислоты для промывки патронов приводит к перераспределению диазепама между элюатами I и II. Фактор x₄ имеет меньшее влияние, и с ростом концентрации этанола в растворе для промывки сорбента снижается ЭЭ диазепама.

Морфин. Изменение значения фактора x₇ значительно влияет на величину ЭЭ морфина (рис. 3).

Следует отметить, что результаты оценки регрессии показали высокие значения стандартной ошибки (33%) для модели морфина, что является следствием наличия фактора или факторов, которые выбранной моделью не учитываются, но влияют на оценку адекватности и достоверности модели.

На диаграмме маргинальных средних видно, что увеличение полярности элюента II (фактор х₇) ведет к возрастанию ЭЭ морфина. Аналогичное влияние полярности элюента II наблюдали при изучении ТФЭ золпидема и его метаболитов [8].

Фенобарбитал. Величина Э.Э. фенобарбитала зависит от факторов х₃ и х₄ (рис. 4). Наибольшее влияние имеет фактор x_4. Так, по мере увеличения концентрации этанола в растворе для промывки сорбента ЭЭ фенобарбитала снижается. Фактор x₃ незначительно повышает ЭЭ фенобарбитала с ростом концентрации уксусной кислоты в растворе для промывки.

Кеторолак. На величину ЭЭ кеторолака влияют факторы х₁ и х₃ (рис. 5). Под влиянием фактора x₃ значительно увеличивается ЭЭ кеторолака по мере роста концентрации уксусной кислоты в растворе для промывки. Некоторое влияние на ЭЭ кеторолака оказывает фактор x₁, рост водородного показателя (pH) в буферном растворе повышает ЭЭ.

Рассмотренные факторы ТФЭ в пределах исследованных величин не имеют значимого влияния на ЭЭ амфетамина, амитриптилина, кокаина.

Наиболее выраженное влияние, согласно полученным данным, оказывает фактор x₃ (использование раствора уксусной кислоты) для бензоилэкгонина, диазепама, кеторолака. Уксусная кислота (ее наличие и концентрация) подавляет ионизацию карбоксильных групп бензоилэкгонина, кеторолака, что способствует увеличению эффективности их экстракции. Промывка раствором уксусной кислоты как дополнительный этап ведет к экстракционным потерям гидрофильных соединений (морфин, изониазид, салициловая кислота) [7]. Удаление указанного этапа для промывки патронов приводит к более полному извлечению диазепама в элюат I.

Влияние фактора x₄ выражено для фенобарбитала и диазепама: увеличение концентрации этанола на стадии промывки значительно снижает их ЭЭ.

Изменение полярности элюента I (фактор x₅) в данном исследовании не выявило связи фактора x₅ и ЭЭ модельных соединений. В то же время изучение ТФЭ некоторых нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) показало, что увеличение полярности элюента I ведет к росту ЭЭ НПВС [9].

Поведение салициловой кислоты и изониазида в процессе ТФЭ указывает на то, что в исследованных условиях ЭЭ определяется не характером факторов, а вероятно, градиентом концентрации указанных соединений в биологическом материале.

Экгонин в указанных условиях вариации факторов и с используемым типом патронов не определяется. Последнее следует учитывать при выборе метода исследования, если известно, что анализируемые вещества имеют гидрофильный характер.

В табл. 4 приведены оптимальные и рекомендуемые значения факторов.

В результате факторы x₃ и x₆ исключены из стадии пробоподготовки, фактор x₁ выбран в значении рН 4,8, объем промывки буферным раствором минимизирован и увеличена полярность элюентов I и II (факторы x₅ и x₇).

Показано влияние изученных факторов ТФЭ на ЭЭ модельных соединений, имеющих различные физико-химические свойства (константы диссоциации и липофильность). Приведены условия ТФЭ, отвечающие условиям скрининга широкого круга веществ, имеющих токсикологическое и судебно-химическое значение.

На основе проведенного статистического анализа полученных математических моделей разработаны оптимальные условия для проведения скрининга наркотических и лекарственных веществ в крови с использованием методов ТФЭ и ГХ/МС, которые могут оптимизировать деятельность химико-токсикологических и судебно-химических экспертных подразделений.

Конфликт интересов : авторы статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки/конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.