В современной литературе [1—3] активно обсуждаются вопросы, касающиеся посмертных изменений в органах и тканях человеческого организма, обусловленных патологическими состояниями. С развитием инструментальных методов диагностики в медицине такие изменения стало возможным оценить с помощью методов компьютерной и магнитно-резонансной томографии (МРТ) [3]. При исследовании мягкотканных образований наибольшей информативностью обладает МРТ. По мере усовершенствования аппаратов МРТ появилась возможность количественно оценить степень посмертных изменений в органах и тканях. Диффузионно-взвешенная (ДВ) МРТ позволяет оценить состояние ткани путем мониторинга движения свободных молекул воды на клеточном уровне. При этом степень диффузии таких молекул можно оценить с помощью количественной характеристики в виде измеряемого коэффициента диффузии (КД). Множество значений КД для определенной биологической структуры представляет собой функциональную карту диффузионно-взвешенных изображений (ДВИ). Карта ДВИ позволяет оценить минимальные изменения ткани, которые не обнаруживаются на рутинных Т1- или Т2-взвешенных изображениях МРТ [4]. Однако по-прежнему актуальным остается вопрос о правильной интерпретации полученных данных не только на обычных МРТ, но и на картах ДВИ [5]. При этом морфологическое и иммуногистохимическое исследования остаются единственными достоверными и надежными диагностическими методами, позволяющими подтвердить или опровергнуть полученные изменения на картах ДВИ [6, 7].

Межпозвонковый диск (МПД) представляет собой непрерывные хрящевые соединения, занимающие промежуточное положение между синхондрозами — малоподвижными прочными соединениями и истинными суставами. МПД человека относится к аваскулярным структурам, его питание осуществляется путем диффузии через краевые отделы фиброзного кольца и замыкательных пластинок [7, 8]. В доступной отечественной и зарубежной литературе мы не встретили работ, посвященных комплексной оценке посмертных изменений в МПД с помощью ДВ МРТ и последующих морфологических и иммуногистохимических исследований. Учитывая вышеизложенное, представляется актуальным комплексное изучение посмертных изменений в МПД в разные сроки посмертного периода.

Цель исследования — анализ посмертных изменений в поясничных МПД в разные сроки (через 12, 24 и 36 ч) посмертного периода с помощью ДВ МРТ, морфологического и иммуногистохимического исследований.

Получение аутопсийного материала МПД (7 позвоночно-двигательных сегментов — ПДС) пояснично-крестцового отдела позвоночника от трупов 5 мужчин и 2 женщин) осуществляли на базе Иркутского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. Исследование проводили с разрешения этического комитета Иркутского научного центра хирургии и травматологии (протокол № 10 от 31.08.15). Умершие были в возрасте от 25 до 47 лет (средний возраст 37,2±7,4 года). От момента наступления смерти до забора ПДС для исследования прошло в среднем 6,7±0,9 ч. Причины смерти: ишемическая болезнь сердца (3), алкогольная кардиомиопатия (1), механическая асфиксия (1), отравление наркотическим веществом (1) и этиловым алкоголем (1).

Выделяли ПДС на уровне верхнего края тела L_II и нижнего края тела L_IV, в одном случае на уровне верхнего края тела L_II и нижнего края тела L_V. Извлеченные ПДС включали тела позвонков со спиленными ножками дуг и сохраненными передними и задними продольными связками, смежными МПД и замыкательными пластинками. Из исследования исключили следующие случаи: 1) травмы и перенесенные оперативные вмешательства на пояснично-крестцовом отделе позвоночника; 2) применение химиотерапевтических препаратов; 3) проведение радиотерапии в области позвоночника; 4) наличие анкилозирующего спондилоартрита (болезнь Бехтерева).

Извлеченные ПДС помещали в термоконтейнер с изотоническим раствором натрия хлорида комнатной температуры для транспортировки в лабораторию. Далее ПДС извлекали и переносили в пластиковый контейнер для его полной заливки агар-агаром в вертикальном положении. Полученные таким методом модели ПДС были разделены на три группы: до 12 ч с момента наступления смерти, 12—24 ч и спустя 24—36 ч. При этом модели ПДС с агар-агаром 1-й группы сразу же исследовались в режиме ДВ МРТ для построения карт ДВИ с использованием аппарата МРТ «Siemens Magnetom Essenza 1,5 Т (Германия). С помощью программного обеспечения OsiriX Lite получили КД для каждого МПД (рис. 1). После построения карт ДВИ и определения значений КД ПДС извлекали из контейнера для последующего морфометрического исследования. МПД препарировали с иcпользованием бинокулярной лупы Eye Mag ProS («Carl Zeiss», Германия) с сохранением целостности замыкательных пластинок.

Из 7 ПДС выделили 14 поясничных МПД. Каждый МПД с замыкательными пластинками разделили на три части: передний отдел фиброзного кольца (ФК), область пульпозного ядра (ПЯ) и задний отдел Ф.К. Из каждого анализируемого отдела МПД получили фрагменты ткани размером 0,5×0,5 см для гистологических препаратов (окраска гематоксилином и эозином). Для исследования моделей ПДС 2-й и 3-й групп контейнеры хранили при комнатной температуре до достижения указанных сроков посмертного периода (2-я группа — 12—24 ч, 3-я —24—36 ч).

Морфометрический анализ клеточной плотности осуществляли с помощью программного обеспечения Automatic Cell Counting Java Image J при общем увеличении 400. Рассчитывали плотность клеток в ПЯ, замыкательной пластинке и ФК — число клеток в 1 мм³.

Оценку иммуногистохимических изменений в МПД проводили в зависимости от давности наступления смерти на основе качественной оценки интенсивности окраски препаратов. Для этого фрагменты ткани фиксировали 4% параформальдегидом («Sigma-Aldrich», США). Компоненты внеклеточного матрикса МПД выявляли с помощью панели первичных антител («Abcam», США): мышиные антитела к коллагену I [COL-1] (ab90395) (1:200), кроличьи к коллагену II (ab34712) (1:200), мышиные к коллагену X [COL-10] (ab49945) (1:200), кроличьи к колллагену XI alpha 2 (ab196613) (1:200) и кроличьи антитела к аггрекану [EPR14664] (ab186414) (1:200), которые окрашивались вторичными антителами, мечеными AlexaFluor 594 («Abcam», США) к кроличьим (ab150080) или мышиным (ab150080) IgG. Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342 («LifeSciences», США). Препараты, заключенные в PROLONG gold («LifeSciences», США), сканировали на лазерном конфокальном микроскопе LSM-710 («Carl Zeiss», Германия). Анализ полученных Z-стеков проводили с помощью пакета программ Imaris 7.2.3 («Bitplane AG», Швейцария) и ZEN («Carl Zeiss», Германия).

Для статистической обработки данных использовали программу Microsoft Excel 2010; применяли описательную статистику (среднее значение, стандартное отклонение, процентное распределение). Полученные значения КД для всех МПД были анализированы с помощью теста Стьюдента—Ньюмана—Кейлса. Корреляционную зависимость количества клеток в разных отделах МПД и замыкательной пластинки и значений КД рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона (r), порог значимости р=0,05.

Средние значения КД для каждого МПД в трех группах представлены в табл. 1. При сравнении значений КД между МПД в 1-й и 2-й группах отметили достоверные различия (p<0,01), а при сравнении значений КД во 2-й и 3-й группах статистически значимых различий не выявили (p=0,64).

Анализ клеточной плотности в структурах МПД, представленной в табл. 2, выявил достоверное снижение количества клеток ПЯ, замыкательной пластинке и ФК во всех группах МПД (p<0,01). Выраженную положительную корреляционную зависимость клеточной плотности в структурах МПД и значений КД в 1-й группе отметили только для замыкательной пластинки (коэффициент корреляции Пирсона составил 0,913; p<0,01 (рис. 2, а—в), во 2-й — замыкательной пластинки и ПЯ (коэффициент Пирсона составил 0,881 и 0,893 соответственно; р<0,01) (см. рис. 2, г—е). В 3-й группе не установили зависимости клеточной плотности и значений КД для всех отделов МПД (см. рис. 2, ж—и).

При качественном иммуногистохимическом исследовании полученных препаратов МПД методом конфокальной микроскопии была выявлена сохранность компонентов его внеклеточного матрикса (аггрекана и коллагенов I, II, X, XI типов) в 1-й группе (рис. 3, а). Трехмерная структура окрашивания этих компонентов имела диффузную либо упорядоченную волокнистую форму, ориентированную в различном порядке. В части препаратов присутствовал коллаген X и XI типов, что соответствует антигенному спектру матрикса дегенерированного МПД. Сохранность компонентов внеклеточного матрикса во 2-й и 3-й группах была резко нарушена. Это подтверждалось малой интенсивностью их окрашивания по сравнению с 1-й группой (см. рис. 3, б, в).

Процессы аутолиза, протекающие после смерти, представляют собой особое свойство биологических объектов разлагать гидролитическим путем собственные молекулярные и клеточные структуры. При этом аутолитический процесс принято делить на несколько этапов в зависимости от времени наступления смерти: этап начальных изменений (0—12 ч), выраженных изменений (12—24 ч) и этап поздних аутолитических изменений (24—72 ч). Для каждого этапа характерны определенные биохимические, биофизические, морфологические и иммуногистохимические изменения [9].

На этапе начальных изменений метаболические и энергетические процессы в клетке резко ингибируются, что связано с частичным разрушением органелл и угнетением активности ферментных систем, участвующих в синтезе макроэнергетических молекул [10]. Снижение уровня макроэнергетических соединений приводит к нарушению работы ионных каналов и, как следствие, изменению трансмембранных ионных градиентов. В ответ на изменяющиеся условия (нарушение ионного баланса, снижение рН, повышение осмотического и онкотического давления) мембраны увеличивают свою проницаемость, но при этом все еще сохраняют свою структуру и функцию [11]. Следует отметить, что характер указанных изменений имеет строгую органную и тканевую специфичность.

Процессы аутолиза в структурах поясничных МПД в специализированной литературе подробно не описаны. Это затрудняет сравнение полученных нами данных с результатами других исследований. L. Kerttula и соавт. [12] продемонстрировали, что в группе здоровых ПД добровольцев (I степень по Pfirmann) КД составил в среднем 1124 мм²/c. Проведенный K. Tomaszewski и соавт. [13] гистологический анализ нормальных МПД (I степень по Thompson) показал, что в среднем клеточная плотность для ФК, ПЯ и замыкательной пластинки составляют 2333, 1894, 1061 клеток/мм³ соответственно. Сопоставляя эти данные с результатами нашего исследования, можно предположить, что на этапе начальных аутолитических изменений МПД его структуры практически полностью сохранны. Это подтверждается данными равномерного окрашивания препаратов при иммуногистохимическом исследовании.

Этап выраженных изменений характеризуется нарастанием деструктивных процессов в органах и тканях. Интенсифицируются процессы катаболизма в клетке: распад нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и белков [14, 15]. Происходит фрагментация цитоплазматической, ядерной и митохондриальной мембран, а также вакуолизация цитоплазмы. Результатом указанных изменений является лизис клеток и выход содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство [16—18]. Полученное нами достоверное снижение значения КД и клеточной плотности всех структур МПД на этапе выраженных изменений (12—24 ч) позволяет предположить наличие лизиса клеток, что также подтверждается данными морфометрии и иммуногистохимии. Вероятно, уменьшение величины КД связано с аутолизом клеток и выходом содержимого цитоплазмы (в первую очередь продуктов деградации биополимеров) во внеклеточную среду, что является прямым барьером на пути движения свободных молекул воды. При иммуногистохимическом исследовании препаратов определяются признаки их неравномерного окрашивания.

Для периода поздних аутолитических изменений в тканях характерно практически полное прекращение процессов, поддерживающих постоянство внутренней среды [19]. Происходит дальнейшее разрушение клеточных органелл, в том числе и лизосом, что сопровождается выходом ферментов в межклеточное пространство из разрушенных клеток [20]. Ферменты, воздействуя на специфические субстраты, расщепляют их до олиго- и мономеров. Указанные процессы, вероятно, можно связать с полученными значениями КД в широких пределах. По нашему мнению, высокие значения КД, полученные в 3-й группе наблюдения (24—36 ч), объясняются тем, что при деградации белковых молекул лизосомальными ферментами возрастает диффузия свободных молекул воды в определенных структурах МПД, так как последние не встречают барьеров на своем пути. С другой стороны, низкие значения КД, по всей видимости, объясняются прогрессирующим снижением клеточной плотности во всех отделах МПД. При иммуногистохимическом исследовании МПД 3-й группы также отмечается скудное окрашивание препаратов, что, вероятно, также связно с действием лизосомальных ферментов на белки межклеточного матрикса.

В исследованные группы включено незначительное количество МПД и только пояснично-крестцового отдела позвоночника. При исследовании и сравнении МПД в различных группах не учитывали влияние факторов внешней среды, причин смерти, половые и возрастные особенности умерших. Также не принимали во внимание факт воздействия магнитного поля высокой индукции на динамику посмертных изменений МПД.

Проведенное исследование показало, что методика ДВ МРТ с определением значения КД МПД может служить методом установления давности наступления смерти, что подтверждается данными морфометрии и иммуногистохимического анализа.

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (№ 15–15–30037).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.