Известно множество способов определения биологического возраста трупа по изменениям костной и хрящевой тканей, а также по состоянию зубов [1—5]. Большинство этих методов дают не совсем точные результаты при нарушении процессов созревания хрящевой ткани эпифиза, остеопорозе и деформации костей скелета [6—8]. Возможны также погрешности определения возраста при выраженных изменениях дентина, пульпы и тканей периодонта [9, 10]. В подобных ситуациях определить биологический возраст трупа могут помочь морфологические изменения кожи. Наиболее разработанными «биомаркерами», характеризующими возрастные изменения морфофункционального состояния кожи, являются показатели содержания коллагеновых и эластических волокон в папиллярной дерме [11]. Возрастные изменения эпидермального слоя изучены недостаточно.

Цель исследования — иммуногистохимическое исследование возрастной динамики апоптоз-ассоциированных белков в эпидермисе кожи человека.

Изучали ткани кожи, полученные при судебно-медицинском исследовании 100 трупов лиц, погибших от острой кровопотери (56 мужского и 44 женского пола в возрасте от 5 до 85 лет, не имеющих повреждений и патологических изменений кожи). Забор участков кожи производили из 6 областей тела: шея, грудь, спина, ягодицы, передневнутренняя поверхность бедра, передняя поверхность предплечья. На шее кусочек кожи вырезали с ее передней поверхности на 0,5 см ниже проекции нижнего края щитовидного хряща, на груди — по срединной линии на уровне четвертого межреберья, на спине — в межлопаточной области, в проекции остистых отростков IV—V грудных позвонков по срединной линии, на ягодице — с центральной ее части, на бедре — в области передневнутренней поверхности, на границе верхней и средней трети, на предплечье — на передней поверхности, на середине расстояния между проекцией локтевого и лучезапястного суставов.

Кусочки фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч. Микроскопическое исследование проводили по традиционным методикам: приготовленные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином по методам Вейгерта, Ван-Гизона [12]. Часть срезов подвергали антигенной демаскировке в 0,1 М цитратном буфере pH 6,0 в течение 30 мин [13]. Далее срезы обрабатывали первичными антителами Monoclonal Mouse a Hu Ki-67 Clone MM1 фирмы «Novocastra» (Германия), Monoclonal Mouse a Hu bcl-2 Clone bcl-2/100/D5 той же фирмы, Monoclonal Rb a Hu p53 Clone 318−6-11 фирмы «Dako» (США), реагентами системы визуализации EnVision+System-HRP (DAV), code K4010 фирмы «Dako» (США).

Экспрессию иммуногистохимических маркеров Ki-67, p53 и bcl-2 определяли в базальном слое эпидермиса неповрежденной кожи путем подсчета общего количества клеток в каждом поле зрения светового микроскопа при увеличении 100—200 (не менее 50 на один гистологический препарат), клеток, меченных МКА к указанным белкам, с последующим вычислением индекса Ki-67, p53 и bcl-2 позитивных клеток в процентах. Полученные данные в большинстве наблюдений подчинялись нормальному распределению, что позволило использовать для статистического анализа параметрический критерий Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ [14]. Результаты сравнений считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

У детей базальный слой был очень тонкий, с высокой митотический активностью клеток. Зернистый и блестящий слои в большинстве областей тела визуализировались слабо, роговой слой за исключением подошвенной области состоял из 2—3 рядов кератиноцитов. Базальная мембрана эпидермиса слабо развита; в сосочковом слое дермы — тонкие волокнистые структуры коллагена. Коллагеновые волокна сетчатого слоя состояли из тонких коротких, рыхло расположенных пучков. Определялись густые и клубочковидные сплетения эластических волокон. В базальном слое эпидермиса трупов лиц 5—10 лет индекс пролиферации Ki-67 составил 22,0±4,2% (18,3—24,7%) Количество базальных клеток, экспрессирующих маркер апоптоза р53, равнялось 0,2±0,05% (0,1—0,3%). В большом количестве эпителиоцитов базального слоя экспрессировался маркер bcl-2 — 15,3±1,2% (12,2—17,1%) (рисунок, а—в).

В возрастной группе 35—45 лет толщина эпидермиса уменьшалась за счет шиповатого слоя и частичного или полного исчезновения зернистого слоя. В базальном слое эпидермиса участки гиперплазии чередовались с очагами атрофии, в которых были значительно снижены митотическая активность клеток и пигментообразование. Отмечалось истончение дермы со снижением числа эластических волокон. Коллагеновые волокна определялись в большом количестве в виде толстых и грубых пучков. В базальном слое эпидермиса трупов лиц 35—45 лет индекс пролиферации Ki-67 составил 9,1±2,2% (7,3—11,6%). Количество базальных клеток, экспрессирующих маркер апоптоза р53, равнялось 1,8±0,6% (1,0—2,3%). В умеренном количестве эпителиоцитов базального слоя экспрессировался маркер bcl-2 – 4,7±2,1% (2,5–7,5%) (см. рисунок,

В возрастной группе 70—85 лет отмечалось значительное истончение эпидермиса с перинуклеарной вакуолизацией его клеток. Наблюдалась атрофия сосочкового слоя дермы, граница между эпидермисом и дермой нередко выглядела в виде ровной линии. В дерме, особенно в ее сосочковом слое, было меньше клеточных элементов. Эластические волокна подвергались атрофии. Дерма и подкожная основа замещалась грубыми коллагеновыми волокнами. В базальном слое эпидермиса трупов лиц 70—85 лет индекс пролиферации Ki-67 составил 1,7±0,6% (0,3—2,8%). Количество базальных клеток, экспрессирующих маркер апоптоза р53, равнялось 6,2±1,9% (5,5—7,8%). В умеренном количестве эпителиоцитов базального слоя экспрессировался маркер bcl-2 — 0,4±0,1% (0,1—0,5%) (см. рисунок, ж—и).

Белок Ki-67 является общепризнанным и широко используемым маркером пролиферации, напрямую связанным с делением клетки. Он выявляется во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2, митозы) [15]. Самый глубокий слой эпидермиса, расположенный непосредственно под дермой, называется базальным (герминативным). Кератиноциты этого слоя — цилиндрические, имеют крупное овальное, хорошо окрашивающееся ядро, нередко митотически делящееся. В цитоплазме клеток — большое количество тонофиламентов, собирающихся в пучки — тонофибриллы. Базальные кератиноциты характеризуются двумя основными функциональными особенностями: максимальной митотической активностью и активным синтезом фибриллярного белка. Митотическая активность кератиноцитов базального слоя эпидермиса детей значительно выше, чем у взрослых [16, 17]. Имеется указание на достижение максимума данного показателя к возрасту 19—21 год и удержание его на одном уровне до 25—45 лет. В проведенном исследовании данный показатель не имел столь четкой тенденции. Тем не менее установленная взаимосвязь результатов гистологического исследования эпидермиса и индекса Ki-67 отражает общую тенденцию возрастных изменений. Следовательно, данный признак можно оценивать количественно, подсчитывая индекс пролиферации Ki-67 в различных возрастных группах.

Белок р53 — продукт гена-супрессора опухоли TP53. При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК активируется [17]. С возрастом увеличивается количество мутаций в кератиноцитах базального слоя эпидермиса нормальной кожи [18, 19], при этом повышается активность р53, из пула реплицирующихся клеток удаляются те клетки, которые являются потенциально онкогенными [20, 21]. В связи с этим в старческой нормальной коже наблюдается большее количество кератиноцитов, экспрессирующих маркер р53.

Одновременно уменьшается активность белка bcl-2, который подавляет апоптоз во многих клеточных системах, в том числе и с мутациями [15]. С возрастом в кератиноцитах базального слоя эпидермиса нормальной кожи увеличивается количество клеток с признаками апоптоза и снижается частота экспрессии bcl-2 [18].

Полученные результаты доказывают возможность использования иммуногистохимических маркеров Ki-67, bcl-2, p53 в качестве количественных параметров комплексной оценки биологического возраста человека.

Авторы статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: pigolkin@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5370-4931;