Одной из наиболее значительных проблем в судебной антропологии является идентификация возраста человеческих останков. Большинство существующих методов оценки возраста костных останков основаны на исследовании дегенеративных изменений в скелете, которые сильно зависят от образа жизни, здоровья и питания человека. Возраст детей легко определяется по развитию и количеству прорезавшихся постоянных и молочных зубов. Хронологический возраст взрослого человека можно установить по данным анализа степени рацемизации аминокислот в твердых тканях зубов, который считается в настоящее время одним из самых надежных [1—3]. Известно, что количественное соотношение L- и D-энантиомеров аминокислот изменяется в процессе жизнедеятельности организма. При старении происходит рацемизация L-аминокислот с переходом их в D-форму в белках, причем в наибольшей степени подвержена этому процессу аспарагиновая кислота. Содержание D-Asp в эмали увеличивается на 0,1% в год и после 60 лет может составлять до 8% от всего количества аспарагиновой кислоты [4].

Здоровая эмаль содержит минеральной компоненты 95—97, воды 2—3 и органических веществ 1,0—2,0 мас.%, из которых на белок приходится около 0,01—1,0 мас.% [5]. Согласно данным А. Veis [6], содержание белка в зрелой эмали составляет 1—2%. Следует отметить, что такая разница объясняется неоднородностью распределения белка: его концентрация увеличивается к области эмалево-дентинного соединения. Основная масса органической составляющей дентина — это белок, содержащийся в количестве 20—25%. По соотношению к аминокислотам белок дентина является типичным коллагеном.

P. Helfman и J. Bada [4] впервые в 1975 г. определили соотношение энантиомеров в белках эмали зубов и показали существование зависимости между соотношением D/L Asp и возрастом зубов человека. В настоящее время анализ содержания D-Asp в долго живущих органоминеральных агрегатах (зубы, кости) считается надежным методом оценки возраста для идентификации неизвестного физического лица в судебной практике [2, 3, 7].

Цель работы — анализ степени рацемизации аминокислот в биоапатите зубов человека и выявление зависимости количественного соотношения L/D аминокислот от его возраста и патологических изменений в физиогенных биоминеральных образованиях.

Материал и методы

Объектами исследования служили эмаль кариозных молочных моляров (n=4), эмаль без признаков кариеса постояных зубов (n=8) человека и корневой дентин с цементом (n=4) зубов, удаленных в стоматологических учреждениях по ортодонтическим показаниям и в связи с различными патологическими процессами в тканях пародонта. Возраст предоставивших биоматериал составил от 11 до 78 лет. Предварительной деминирализации биоапатита не проводили. Сколы эмали и дентина растирали в агатовой ступке, для аминокислотного анализа использовали 100 мг вещества.

Для извлечения аминокислот из белковой составляющей применяли кислотный гидролиз в 6 М HCl при температуре 105 °С в течение 12 ч. Выделенные из гидролизата аминокислоты очищали от примесей и переводили в N-пентафторпропионовые изопропиловые эфиры соответствующих аминокислот. Разделение, идентификацию и количественное определение содержания энантиомеров аминокислот проводили на газовом хроматографе GC-17A (Shimadzu, капиллярная колонка Chirasil-L-Val) по методу, описанному С.Н. Шаниной и Е.А. Голубевым [8]. С помощью данной методики анализировали L- и D-изомеры 13 аминокислот: аланин (Ala), валин (Val), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), треонин (Thr), серин (Ser), фенилаланин (Phe), тирозин (Tyr), пролин (Pro), лизин (Lys), метионин (Met). Все используемые реагенты имели высокую степень чистоты (компаний Sigma, Aldrich, Fluka). Для приготовления растворов использовали бидистиллированную и деионизированную воду. Чтобы исключить попадание аминокислот из реагентов, параллельно с образцами проводили «холостой опыт».

Результаты и обсуждение

Анализ аминокислотного состава твердых тканей зубов показал, что глицин, пролин, глутаминовая кислота и аланин являются доминирующими аминокислотами, что согласуются с данными литературы [5, 9]. В трех образцах биоапатита эмали выявили более высокое содержание Ile, Ala и Asp.

В изученных образцах зубов D-формы обнаружили для трех аминокислот: аспарагиновой, глутаминовой и аланина. Наиболее высокое значение соотношений D/L Asp получили для биоапатита эмали пародонтитного зуба и корневого дентина зубов мудрости с ретенцией (см. таблицу). Независимо от возраста человека наблюдали разброс в значениях показателей D/L Asp в твердых тканях зубов при аномалиях в пародонте. Кроме того, прослеживалось увеличение содержания D-Asp в эмали молочных зубов, пораженных кариесом.

Следует отметить, что для эмали зубов с воспалительными и дегенеративными процессами в пародонте высоким значениям D-Asp, как правило, соответствует повышенное значение D-Glu. Не обнаружили какой-либо закономерности в степени рацемизации аланина в биоапатите зубов в зависимости от патологических процессов в тканях пародонта. В зубах, удаленных по ортодонтическим показаниям, отметили низкие значения D/L Asp, Glu, Ala, что может указывать на фактический возраст человека.

Согласно исследованиям [1], наиболее сильная зависимость наблюдается между возрастом зуба и степенью рацемизации Asp в зубной эмали, являющейся более устойчивой к воздействию внешних факторов, а у большей части подвергнутых анализу постоянных зубов, пораженных кариесом, не зафиксировали увеличения значения D/L Asp.

Как следует из данных таблицы, эмаль молочных моляров, пораженная кариесом и отличающаяся степенью рацемизации аминокислот, вероятно, характеризуется индивидуальным энантиомерным «портретом метаболизма». Полагаем, что на концентрацию D-изомеров аминокислот в эмали влияет жизнедеятельность микроорганизмов в кариозной полости, способных продуцировать и метаболизировать D-аминокислоты.

Таблица. Соотношение D/L энантиомеров в составе органической составляющей биоапатита эмали и корневого дентина зубов человека

Table. The ratio of D/L enantiomers in the organic component of bioapatite enamel and root dentin of human teeth

Примечание. * — ММ — молочный моляр; ** — зубная формула по международной номенклатуре.

Ранее проведенные исследования 64 образцов коронкового и корневого дентина, удаленных из человеческих останков, выявили очень высокую корреляцию между метрическим возрастом зубов и значением соотношений D/L Asp [3]. Результаты, полученные на основе метода линейной регрессии, позволили авторам высказаться о перспективности применения способа рацемизации Asp в твердых тканях зубов для идентификации личности в судебной медицине.

Сравнительный анализ [10] степени рацемизации Asp как в образце целого зуба, так и дентина показал, что отношения D/L Asp в биоапатите цельного зуба выше, чем у дентина. Авторы отметили, что использование целых зубов упрощает метод рацемизации и может послужить для стандартизации подготовки образцов, анализируемых на содержание D- и L-энантиомеров аминокислот. При исследовании эмали пяти типов зубов с различных позиций от одного индивида выявили, что степень рацемизации Asp в молярах выше, чем в резцах [11].

Известно, что значительные изменения баланса L- и D-аминокислот наблюдаются при различных патологических процессах в органах и тканях человека независимо от хронологического возраста [12]. В нашем исследовании отсутствие представительной выборки зубов не позволяет достоверно судить о влиянии возраста на степень рацемизации Asp в биоапатите твердых тканей. Следует, однако, отметить, что в изученных образцах самые низкие отношения D/L Asp также установлены у людей, чей возраст составляет 14 и 20 лет.

Таким образом, при использовании степени рацемизации аспарагиновой аминокислоты для определения точного хронологического возраста неопознанных трупов требуется разработка единого стандарта при выборе образцов биоапатита зубов человека. Эталоном может служить или эмаль, или коронковый либо корневой дентин зуба с учетом его позиции в полости рта без признаков кариеса и патологических изменений в пародонте.

Вывод

Высокие показатели соотношений D/L Asp в белках эмали без признаков кариеса и дентина зависят от наличия патологических процессов в тканях пародонта независимо от хронологического возраста человека. Кариозные процессы в молочных молярах также способствуют повышению количества D-Asp. Низкие показатели соотношений D/L Asp, Glu и Ala определяются в зубах, удаленных по ортодонтическим показаниям.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.