Количество людей, употребляющих наркотические вещества (НВ), возрастает с каждым годом. В мире число страдающих наркозависимостью превышает 3,5 млн, из них каждый год умирают 30—40 тыс. Особенно тревожной представляется ситуация в молодежной среде [1, 2]. В связи с этим остается актуальной разработка новых точных, быстрых и недорогих тест-систем для выявления людей, употребляющих наркотики.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) является одним из биоаффинных методов, использующих высокую специфичность лиганд-рецепторного связывания, характерную для процессов биохимического распознавания с участием природных рецепторов, в данном случае антигенов и антител [3—5]. Преимущество ИХА в отличие от других методов иммунохимического исследования — отсутствие необходимости в каких-либо дополнительных реактивах, поскольку все необходимые реагенты уже иммобилизованы на поверхности тест-панели. Кроме того, метод прост в исполнении, не требует высокой квалификации исполнителя, малозатратен при анализе больших партий образцов [6, 7].

Цель исследования — оптимизация определения морфина и амфетамина в биообъектах (синтетическая и натуральная моча) с помощью ИХА с использованием новых тест-систем и выбор оптимальных условий для проведения массовых анализов.

Материал и методы

1. Экспериментальная часть

Использовали тест-панели на морфин и амфетамин; растворы калибраторов НВ; механические дозаторы вместимостью 1—20, 50, 100, 500, 1000 мкл; микропробирки вместимостью 1,5 мл; баночки вместимостью 15 и 20 мл для биообразцов; боратный буферный раствор pH 8,5; синтетическую мочу pH 7,0 (приготовление см. далее).

Биологическими образцами служили образцы мочи различных групп населения, полученные из химико-токсикологической лаборатории наркологической клинической больницы №17 Департамента здравоохранения Москвы; контрольные образцы мочи, заведомо не содержащие никаких наркотических и психотропных веществ. Все биологические образцы и калибраторы хранили в холодильнике при температуре 4 °C.

1.1. Приготовление синтетической мочи

Синтетическую мочу (СМ) использовали в качестве буфера для проведения ИХА. Готовили СМ из следующих реагентов: мочевина — 22 г; натрия хлорид — 8,25 г; калия хлорид — 5,2 г; креатинин — 1,5 г; натрия дигидрофосфат — 1,1 г; натрия гидрофосфат — 1,4 г; натрия азид — 1 г; тартразин — 10 мг. Раствор доводили дистиллированной водой до 1 л; pH полученного раствора 7,0.

1.2. Приготовление стандартных растворов НВ для анализа

Для приготовления раствора с концентрацией антигена 0 нг/мл взяли калибратор А с концентрацией НВ 0 нг/мл.

Получение стандартных растворов НВ концентрации 25 и 50 нг/мл: из эппендорфов с 0,2 мл боратного буфера (ББ) или СМ отобрали соответственно 17 и 33 мкл ББ или СМ, затем добавили 17 мкл калибратора C (концентрация 300 нг/мл) и 33 мкл калибратора B (концентрация 150 нг/мл). Использовали также калибраторы E и F с концентрацией 1000 и 3000 нг/мл соответственно.

У тест-панелей, которые применяли в данной работе, минимально определяемая концентрация НВ (CUT-OFF) составляет 300 нг/мл для амфетамина и морфина. В связи с этим по соответствующим схемам приготовили стандартные растворы с концентрациями НВ, указанными в табл. 1.

Таблица 1. Приготовление стандартных растворов НВ для анализа

Перед началом исследований провели осмотр и проверку герметичности и комплектности тест-систем фирмы-поставщика. Панель извлекли из упаковки непосредственно перед применением.

Использование СМ необходимо для выявления образования перекрестных реакций в натуральной моче. В данном исследовании СМ представляла образец натуральной мочи, но заведомо не содержащей НВ, т.е. служила контрольным образцом.

Результаты и обсуждение

За последние несколько лет количество граждан всех возрастов, употребляющих наркотики, увеличилось, по данным разных авторов, в 9—12 раз [1, 2]. Для работы в качестве целевых выбрали различные группы населения. Объектами исследования служили опиат (морфин) и психостимулятор (амфетамин), вызывающие наркотическое привыкание.

Морфин — это основной алкалоид опия, количество которого составляет в среднем 10%, что значительно больше, чем других алкалоидов. Он содержится в маке снотворном и других видах мака.

Основным действием амфетамина является стимуляция деятельности органических гормонов — норадреналина и адреналина. Это приводит к скачкам давления, сужению сосудистого просвета, повышению содержания глюкозы в крови и др. Главные и тяжелейшие последствия злоупотребления амфетамином — увеличение вероятности инсульта, гипертония, аритмия, параноидальные психозы, шизофрения [8, 9].

При химико-токсикологическом анализе и допинг-контроле используют инструментальные и неинструментальные методы. Например, наличие морфина и амфетамина определяют с помощью ГХ/МС, ВЭЖХ, ВЭЖХ/МС, ТСХ, ИФА, ПФИА, УФ-спектроскопии [9—11].

ИХА является методом предварительного скрининга для выявления искомых веществ. Метод широко применяется в химико-токсикологических лабораториях; в качестве метки иммунокомплексов хорошо себя зарекомендовало коллоидное золото [6, 7, 12—15].

Интерпретация результатов анализа представляет очень сложную задачу. Это связано с тем, что иногда невозможно отличить запрещенные соединения и разрешенные лекарственные препараты из-за сходства структуры веществ. Возможен отрицательный результат, если проба была взята слишком поздно после приема наркотических и психотропных веществ: приблизительный период выявления морфина составляет 24 ч, амфетамина — 2—3 сут [16].

Таким образом, для более эффективной работы химико-токсикологических лабораторий необходимы новые качественные скрининговые тесты, позволяющие однозначно определить в пробах наличие или отсутствие наркотических и психотропных веществ.

В данном исследовании использовали тест-панели на морфин и амфетамин. Время пробега фронта жидкости (моча) по тест-панели, начиная с момента погружения тест-панели в образец, составило 5—7 с, что характеризует впитывающую способность панели. При массовых обследованиях этот показатель играет важную роль, так как напрямую влияет на производительность анализов. Данные тест-панели показали отличные результаты по сравнению с панелями других фирм, при использовании которых требуется гораздо больше времени (50 с — 1 мин 40 с), что затрудняет проведение массового контроля.

ИХА образцов на содержание НВ с помощью тест-систем

На тест-панели несколько зон (рисунок на цв. вклейке): впитывающая зона, зона протекания иммунных реакции и зона использования тест-панели.

Все зоны закреплены на подложке. Над впитывающей зоной располагается граница MAX, ниже которой для получения правильных результатов полоску опускать в образец мочи не следует. Над этой границей нанесены первичные антитела (Ab) на определяемый антиген (Ag), меченные наночастицами золота. Зона, на которой протекают иммунные реакции, делится на две части: тестовую (T), на которой иммобилизованы Ag, и контрольную с иммобилизованными вторичными Ab против первичных.

Методика проведения анализа: тест-панель, на которой протекают иммунные реакции, погружали в образец на определенное время. Затем панель извлекали и помещали на сухую, не впитывающую поверхность в горизонтальном положении и по наличию образующихся полосок определяли результат.

Проба жидкости, впитывающаяся мембраной, переносит частицы коллоидного золота с иммобилизованными первичными Ab до зоны T. Если определяемое вещество Ag в пробе отсутствует, то в зоне T иммобилизованные первичные Ab, меченные коллоидным золотом, связываются с коньюгатом Ag—бычий сывороточный альбумин, иммобилизованным на мембране. В результате этого в зоне T образуется полоса, окрашенная коллоидным золотом.

После этого оставшиеся несвязанные комплексы коллоидного золота с Ab с потоком перемещающейся жидкости достигают контрольной зоны и реагируют с иммобилизованными там вторичными Ab, т.е. Ab, специфичными к первичным Ab. В молярном отношении первичных Ab больше, чем иммобилизованного Ag, поэтому оставшиеся Ab реагируют со вторичными Ab в контрольной зоне, в результате чего там образуется окрашенная полоса (окраска комплекса коллоидного золота с Ab).

Если образования окрашенной полосы не произошло, такой тест считается неправильным, и его необходимо повторить, используя другой тест-панель. Оставшиеся комплексы коллоидное золото — Ab с потоком жидкости достигают впитывающей мембраны. Таким образом, появление двух полосок свидетельствует об отрицательном результате анализа (см. рисунок а, на цв. вклейке).

Принцип работы тест-систем.

а — антиген отсутствует в пробе, результат отрицательный; б — антиген присутствует в пробе, результат положительный.

Если в пробе имеется определяемое вещество (Ag), то при погружении тест-панели в пробу жидкости присутствующие в пробе Ag вместе с жидкостью поднимаются по пористой мембране и затем соединяются с иммобилизованными первичными Ab, меченными коллоидным золотом.

Фронт жидкости перемещает образовавшийся иммунный комплекс Ag — меченые Ab до зоны T. Если количество Ag в пробе очень велико, то все комплексы Ab — коллоидное золото связываются с ним, не давая комплексам Ab — коллоидное золото связаться с коньюгатом Ag — бычий сывороточный альбумин в зоне T. Таким образом, соответствующая полоса в зоне T отсутствует (см. рисунок б, на цв. вклейке).

При всей простоте исполнения ИХА достаточно сложен с точки зрения механизмов, происходящих в тест-системах, и является наглядным примером наукоемкой технологии, позволяющей удобно и быстро определять искомые соединения — антигены.

Качественное определение НВ с помощью тест-панелей в стандартных образцах на примере амфетамина

Методика проведения анализа: тест-панель погружали в образец, содержащий известную концентрацию амфетамина (калибратор), на определенное время. (Приготовление калибраторов — см. раздел 1.2.)

Анализ проводили согласно инструкциям, приложенным к тест-панелям. Панель погружали в образец мочи строго вертикально, следя за тем, чтобы фронт растворителя не пересек черту МАХ. Время погружения составляло 5—7 с. Растворитель должен пройти ¹/₃ мембраны, на которой располагаются иммобилизованные вещества. После этого панель извлекали и помещали на сухую, не впитывающую поверхность в горизонтальном положении. Результат регистрировали через 3—4 с визуально (табл. 2). Интерпретацию полученных данных выполняли, как описано в разделе 2.

Таблица 2. Качественное определение амфетамина в синтетической моче

Примечание. T/C — тестовая и контрольная зоны.

Чувствительность, указанная в прилагаемой к тест-системам инструкции, — 300 нг/мл. Из данных табл. 2 следует, что с помощью тест-панелей в образце можно определять более низкие (от 75 нг/мл) концентрации НВ (амфетамин), чем заявлено в инструкции.

Качественный анализ реальной биологической жидкости в составе модельных растворов на содержание НВ на примере амфетамина

Для проведения качественного анализа биологической жидкости на содержание амфетамина готовили модельные стандартные растворы (см. раздел 1.2). Вместо СМ в качестве биологической жидкости использовали образцы реальной мочи, заведомо не содержащей НВ. В реальной моче растворяли нужное количество калибратора (см. раздел 1.2), а затем в полученный образец опускали тест-панель.

В данном исследовании использовали образцы мочи детей и подростков (13—16 лет) мужского и женского пола без выявленных заболеваний.

Работу и интерпретацию полученных данных выполняли, как описано ранее. Вид тест-панелей в данном случае аналогичен приведенному на рисунке. Экспериментально установили, что, начиная с концентрации 75 нг/мл, при которой наблюдается исчезновение второй полосы, возможно определение амфетамина вместо заявленной в инструкции концентрации 300 нг/мл. Таким образом, с помощью тест-системы можно успешно детектировать амфетамины в натуральной и синтетической моче.

Качественное определение наркотических веществ с помощью тест-панелей в стандартных образцах и реальной биологической жидкости в составе модельных растворов на примере морфина

Методика проведения анализа: тест-панель погружали в образец, содержащий известную концентрацию морфина (калибратор), на определенное время. (Приготовление калибраторов — см. раздел 1.2.)

Ход работы и интерпретацию полученных данных выполняли как описано ранее. Из результатов, представленных в табл. 3, следует, что с помощью тест-панелей можно определять НВ (морфин) в образце в концентрации от 100 нг/мл (более низкая, чем заявленная в инструкции 300 нг/мл).

Таблица 3. Качественное определение морфина в синтетической моче

Для проведения качественного анализа биологической жидкости на содержание морфина готовили модельные стандартные растворы (см. раздел 1.2). Вместо СМ в качестве биологической жидкости использовали образцы реальной мочи, заведомо не содержащей НВ. В реальной моче растворяли нужное количество калибратора (см. раздел 1.2), а затем в полученный образец опускали тест-панель. Ход работы и интерпретацию полученных данных выполняли, как описано ранее.

Вид тест-панелей в данном случае аналогичен приведенному на рисунке. Экспериментально установили, что, начиная с концентрации 100 нг/мл, при которой наблюдается исчезновение второй полосы, возможно определение морфина вместо заявленной в инструкции концентрации 300 нг/мл. Следовательно, с помощью тест-системы можно успешно детектировать морфин в натуральной и синтетической моче.

Таким способом проведены оптимизация условий ИХА морфина и амфетамина, анализ реальных образцов мочи. Установили, что с помощью тест-панелей можно определять НВ в концентрации ниже заявленной в приложенной к тест-системе инструкции (300 нг/мл), а именно менее 75 нг/мл для амфетамина и менее 100 нг/мл для морфина (табл. 4).

Таблица 4. Аналитические характеристики методики определения амфетамина и морфина с помощью ИХА

ИХА с использованием тест-панелей является оптимальным для проведения скрининговых массовых анализов биожидкости на содержание наркотиков у различных слоев населения, особенно в условиях экспресс-анализа и при необходимости экстренной проверки образцов в биохимической лаборатории, наркологических диспансерах и при допинг-контроле. Тест-системы позволяют проводить анализ большого количества образцов биожидкостей без предварительной сложной пробоподготовки. Преимущества этого анализа — высокие чувствительность и селективность, экспрессность, доступность и простота выполнения.

Аналитические характеристики методики определения амфетамина и морфина с помощью ИХА

Для определения специфичности провели опыты с помощью ИХА на выявление наличия перекрестных реакций тест-систем на амфетамин с использованием структурного аналога амфетамина — адреналин 1000 и на морфин структурного аналога — кодеин 300. В исследовании не выявили ложноположительных результатов на данные молекулы с помощью предложенных тест-систем.

Ложноотрицательных результатов в ходе исследования также не выявили.

Для определения сходимости результатов провели по 4 повторения при определении каждой концентрации в процессе анализа.

Для определения промежуточной прецизионности провели анализ одних и тех же образцов в различное время в течение 3 дней.

Истинность доказывали с использованием заведомо положительных образцов.

Данный ИХА полуколичественный, но несомненно лучший для экспресс-анализов, когда необходимость знать точное содержание НВ в моче отсутствует. Для получения более точных данных о концентрации веществ в моче следует использовать дополнительные методы исследования, например ВЭЖХ-МС.

И.А. Шанин и соавт. [14] предложили методику ИХА для определения амфетамина и метамфетамина в моче с использованием тест-полосок. Из статьи авторов очевидно, что заявленный в инструкции предел обнаружения тест-систем на амфетамин составляет 800 нг/мл, что гораздо выше того предела обнаружения, который представлен в данном исследовании — 300 нг/мл. Это свидетельствует о более высокой чувствительности использованных нами тест-панелей, а следовательно, и о более точных результатах.

Предел обнаружения амфетамина в работе И.А. Шанина и соавт. [14] составил 100 нг/мл, что значительно выше, чем достигнутый предел обнаружения в разработанной нами методике — 75 нг/мл.

Выводы

1. Разработана методика определения НВ с помощью ИХА на примере морфина и амфетамина с использованием тест-панелей. Для цветной регистрации результатов анализа применяли наночастицы коллоидного золота.

2. Получены и оценены аналитические характеристики данной методики: предел обнаружения, прецизионность, истинность и специфичность.

3. С помощью тест-панелей можно определять НВ в концентрации ниже заявленной в инструкции, приложенной к тест-панелям: менее 300 нг/мл для амфетамина и морфина). Реальный установленный предел обнаружения амфетамина составил 75 нг/мл, а для морфина 100 нг/мл.

4. Определение НВ с помощью ИХА с использованием приведенных в данной работе тест-панелей является оптимальным для массовых исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.