Актуальность темы исследования обусловлена необходимостью установления давности наступления смерти практически в каждом случае гибели на месте происшествия (особенно в случаях неочевидности) [1, 2], неизученностью и противоречивостью критериев ее определения, особенно в поздние сроки посмертного периода [3], сложившейся практикой ограниченного использования нетрадиционных методов определения давности наступления смерти, в частности, микробиологических [4—8]. Это побуждает к подробному изучению динамики постмортальных изменений с привлечением как традиционных судебно-медицинских подходов, так и биологических методов оценки физиологической активности микрофлоры, энтомофауны и позвоночных-падальщиков.

Цель исследования — интегративная микробно-зоологическая оценка посмертного периода и определение способов установления его продолжительности при производстве судебно-медицинской экспертизы.

Материал и методы

Исследования проводили на территории Северо-Запада РФ: в городах Беломорск, Костомукша, Мончегорск, Петрозаводск, Сортавала, поселениях — Лососинное и Шелтозеро. Во время экспериментов соблюдали соответствующие этические нормы и рекомендации правовых документов (заключение Комитета по медицинской этике при МЗ и СР РК и Петрозаводском государственном университете №35 от 6 ноября 2015 г.).

Изучили особенности микрофлоры трупа и его ложа: определили качественное и количественное разнообразие гетеротрофной группы бактерий. Фенотипические признаки выделенных культур выявляли с помощью стандартных методов микробиологических исследований, а генотипические — с привлечением ПЦР-анализа, выполненного методом секвенирования ДНК по Сэнгеру в лаборатории молекулярной диагностики ЦКП «Биоинженерия» (на базе ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии»). Для исследования некрофильных насекомых использовали энтомологический метод, включающий сбор насекомых, видовую диагностику, определение морфометрических параметров развития и эколого-биологических особенностей. Повреждения от некоторых позвоночных животных изучали традиционными методами их анализа.

Использовали трупы людей, свиней, кур, мышей и некоторых других представителей класса млекопитающих. Всего собрали материал со 125 объектов, массой от 100 г до 100 кг, на различных сроках разложения (от ранних трупных изменений до скелетирования). Выделили и изучили более 1000 изолятов микроорганизмов, более 32 000 особей насекомых и более 100 повреждений, причиненных грызунами, собаками, кошками и птицами. Провели серии натурных экспериментов на трупных приманках животных в различных типах экосистем, апробировали методы сбора и обработки микробиологических данных [9].

Для зоологических исследований разработали несколько оригинальных устройств с целью изучения некрофильных насекомых на трупах крупных животных, видового и количественного состава мух на эфемерных субстратах, разложения трупов в воде, также укладку для сбора и транспортировки энтомологических образцов с места обнаружения трупа и др. [10].

Результаты и обсуждение

Для установления основных тенденций микробного разложения трупов с участием гетеротрофных бактерий проанализировали морфологические, физиологические и биохимические признаки гетеротрофов в динамике. Установили, что ведущим фактором в смене микробных сообществ является эколого-физиологический. По этому параметру выделили группы микроорганизмов (прототрофы, протеолитики, целлюлозолитики, сульфатредукторы и азотфиксаторы), которые появляются на трупе в различное время и проявляют разную биохимическую активность.

С учетом значимости аммонификаторов в процессах гниения трупов основное внимание уделили изучению протеолитически активных групп бактерий. Протеолитики обнаружили в составе посмертной микрофлоры свиней, кур и мышей — 10, 8 и 8 протеолитически активных штаммов соответственно. К доминантным видам отнесены Bac. mycoides, Bac. subtilis, Cl. sporogenes, Cl. putrificum и Pseudomonas sp. Провели качественный и количественный анализ их протеолитической активности на примере гидролиза казеина [11] и сравнительной коллагеназной активности.

При генотипировании бактерий, выделенных в чистую культуру из микрофлоры трупа, детектированы ПЦР фрагменты генов 16S рРНК с бактериальными парами универсальных праймеров. Генотипировано 14 видов рода Bacillus, из которых два вида филогенетически близкородственной группы — Bac. cereus и Bac. Subtilis; три подвида Bac. subtilis: Bac. subtilis subsp. subtilis, Bac. subtilis subsp. inaquosorum и Bac. subtilis subsp. spizizenii. Полученные данные доказывают, что в процессе разложения тканей трупа представители рода Bacillus занимают лидирующее положение, что связано с большим спектром вариабельности их морфологических и физиолого-биохимических свойств.

При изучении особенностей разложения трупа насекомыми проанализировали биологию конкретных таксонов некрофилов, место и роль в утилизации органического вещества животного происхождения, влияние средовых факторов на их жизнедеятельность.

В наземной среде квалифицировали разложение и энтомокомплекс трупов крупных животных и человека в естественных биоценозах [12]. С момента закладки трупа на протяжении месяца доминировала Protophormia terraenovae (мясная муха новоземельская). Со второй половины 1-го месяца увеличилось биоразнообразие некробионтов, к доминирующим видам добавились представители семейства Piophilidae (пиофилиды), через 2 мес доминировали Piophilidae и жуки-кератофаги N. violacea (синий костоед), через 4 мес увеличилось число жуков-кератофагов и резко снизилось общее количество видов. Эти данные согласуются с результатами исследований, характеризующими стадии разложения трупа и соответствующий им определенный видовой состав некробионтов [13—15].

Установили 9 видов из 4 семейств некрофильных двукрылых, отмеченных на трупах людей. Наибольшее судебно-медицинское значение из них имеют Calliphora vicina, Lucilia caesar и Protophormia terraenovae. Статистически выделены четыре значимые главные компоненты, характеризующие направление изменчивости комплекса некрофильных мух при формировании населения трупов: условия нахождения трупа, общая структура доминирования, сезонные особенности населения трупа и различные стадии разложения [16].

Изучили динамику изменения температуры трупов в поздние сроки постмортального периода. Зафиксировали факты существенного повышения их температуры, связанные с активной жизнедеятельностью микроорганизмов и личинок мух [17]. Можно сделать вывод, что термодинамика трупа изучена еще недостаточно. Труп — это и биологическая субстанция, а не только физическая, как написано во многих учебниках.

Исследовали особенности повреждений трупов наиболее типичными представителями экосистем городов: грызунами, кошками, собаками и птицами. Установили, что морфологическая картина повреждений мягких тканей и костей, причиненных грызунами, кошками, собаками и птицами, имеет характерную картину [18—20]. Например, к особенностям травмирования трупов грызунами можно отнести преимущественное объедание мягких тканей тела, поверхностное повреждение костей, не характерное для «домашних» грызунов проникновение в полости тела и поедание внутренних органов.

Повреждения от воздействия разных животных заметно отличаются. Их можно свести в дифференциально-диагностическую таблицу, по которой с учетом условий поедания тканей трупа, наличия повреждений мягких тканей и костей можно определить, какое животное причинило посмертные повреждения. Это особенно значимо в случаях, если вблизи тела не обнаружено непосредственно самого животного.

На основании полученных данных доказана значимость микробно-зоологических критериев для оценки конкретного постмортального интервала и определены способы их установления при производстве судебно-медицинской экспертизы. Важность микробиологического анализа для проведения такой экспертизы заключается в том, что ферментативная активность гетеротрофных групп бактерий является наиболее прогностически значимым показателем для определения давности наступления смерти. С помощью анализа специфики субстратно-ферментных взаимоотношений бациллярно-клостридиального комплекса установили, что на начальных стадиях разложения трупа активно экспрессируются гены бактерий, контролирующие биосинтез протеаз, фосфатаз и гликолитических ферментов, а на поздних — нитрогеназ, декарбоксилаз, нитратредуктаз и сульфатредуктаз.

Зоологическая характеристика разложения складывается из энтомологического компонента и особенностей посмертных повреждений трупа позвоночными-падальщиками. Энтомологический компонент позволяет установить продолжительность постмортального интервала двумя основными способами.

Первый способ — определение возраста самых зрелых индивидов, обнаруженных на трупе. При изучении размерно-весовых характеристик личинок некрофильных мух выявили численную зависимость их возраста и составили формулы для определения возраста личинок по их массе или длине.

Второй способ — анализ сукцессии некрофильных насекомых на трупе. При разложении на воздухе на трупах можно выделить несколько волн последовательного заселения, всего до 8 волн в течение 3 лет после наступления смерти, при разложении в воде — 3 волны заселения на протяжении 1 мес нахождения трупа в воде.

При сравнении сукцессии на трупах, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию высоких температур, выявили общие черты: первыми трупы обнаруживали Calliphoridae (мясные мухи). Отличие состояло в том, что группа жуков-кератофагов при обычных условиях появлялась на трупах на 10—15-й день, а на обгорелых — уже на 2-й день [21].

Предложен метод ретроспективного определения давности наступления смерти по дате заселения трупа некробионтами. Он основан на применении эффективных температур: количество тепла, затраченного видом на развитие от яйца до взрослой особи. Для расчета использовали формулу: C=(t-t₁)n, где C — сумма эффективных температур (°C), t — наблюдаемая температура среды (°C), t₁ — нижний порог развития вида (для основных видов имеются табличные значения температуры, °C), n — дни наблюдения.

Для практической апробации результатов исследования выполнили эффективную экспертную реконструкцию постмортального интервала, которая базируется на совокупности анализа результатов традиционных методов судебной медицины и биологических методов с использованием микробиологических и зоологических объектов. Провели более 20 комплексных судебно-медицинских и энтомологических экспертиз за период 2016—2019 гг. Во всех экспертизах следственные данные полностью подтвердили экспертные выводы о рассчитанных датах наступления смерти и стали важным звеном в доказательной базе [22, 23]. Полученные результаты связаны с разработкой комплекса практических рекомендаций для судебно-медицинских экспертов. Комплекс состоит из методических основ забора некрофильных насекомых при осмотре трупа на месте происшествия и тактике производства экспертиз с привлечением энтомологов.

Выводы

1. Исследованы три фактора, влияющие на разрушение трупа. Полученные результаты доказывают наличие тесной взаимосвязи между воздействием позвоночных-падальщиков и некрофильных насекомых и микробными процессами, происходящими при разложении трупа, что следует учитывать при определении давности наступления смерти.

2. Выявлена численная зависимость размерно-весовых характеристик личинок некрофильных мух от их возраста.

3. При активных процессах разложения температура трупа может существенно повышаться, что связано с активной жизнедеятельностью микроорганизмов и личинок мух.

4. Постмортальная микробиология является новой областью исследований и требует проведения более тщательной экспериментальной работы для полного анализа структуры микробного сообщества как инструмента объективной оценки давности наступления смерти. Дальнейшие исследования микрофлоры костных останков позволят выйти за рамки эмпирического подхода и получить объективно измеряемые переменные, что справедливо как для ретроспективных, так и для экспериментальных исследований в области судебной медицины.

Благодарности

Статья подготовлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках исполнения государственного задания. Выполнено в рамках реализации Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017—2021 гг.

Коллектив авторов благодарит д-ра биол. наук, доцента кафедры зоологии и экологии ИБЭАТ ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» С.Н. Лябзину за участие в реализации идеи, помощь в определении насекомых-некробионтов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.