Одним из основных требований при проведении судебно-химической экспертизы является апробация метода количественного определения на биологической матрице, аналогичной экспертному материалу, пределов обнаружения, диапазона концентраций, а также параметров воспроизводимости, селективности и выхода вещества из пробы [1, 2]. Соблюдение этих требований — важный элемент полноценной реализации химиками-экспертами методик количественного анализа биологических объектов [3].
Верапамил (α-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]метиламино]пропил]-3,4-диметокси-α-(1-метиэтил)бензолацетонитрил) — лекарственный препарат группы блокаторов кальциевых каналов, имеющий токсикологическое значение. При диагностике острых отравлений и в судебно-химической экспертизе для количественного определения верапамила используют ряд хроматографических методов, в том числе с масс-спектрометрическим детектированием, а также спектрофотомерию в УФ-диапазоне [4—7].
Цель исследования — апробация теоретического прогнозирования метрологических характеристик методик количественного определения в судебно-химическом анализе на примере методики выявления верапамила в крови методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с компьютерной денситометрией.
Материал и методы
Использовали стандартный образец верапамила в форме гидрохлорида (LGC Standards, Великобритания). Модельные образцы крови готовили путем добавления расчетного количества стандартного образца (в виде метанольного раствора концентрации 10 мкг/мл в пересчете на основание) к образцам крови, не содержащим наркотических, психотропных и лекарственных веществ. Диапазон концентрации верапамила в пробах крови составлял 100—5000 нг/мл.
Экспериментальным путем определяли метрологические характеристики методики количественного выявления верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией (с применением абсолютной квадратичной градуировки) [8].
Правильность и прецизионность устанавливали в соответствии с рекомендациями «Руководства по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала» [9].
Статистическую обработку аналитических данных осуществляли методами вариационной статистики с применением компьютерных программ Chem Metr Evaluation 1.0 [10], Statistica 6.0 («Stat soft Inc.», США) [11].
Расчет теоретической величины предела сходимости RSD_r исследуемых методик количественного определения осуществляли по уравнению Горвица [12]:
RSD_r=0,67·RSD_R;
RSD_R=21–0,5·logC ;
C=w/100,
где w — концентрация анализируемого вещества в пробе, % (мас.); RSD_R — предел воспроизводимости, %.
Расчет теоретических величин стандартного отклонения Sсред и относительной ошибки среднего значения εсред, исходя из величины предела сходимости RSD_r методики, осуществляли по формулам:
Sсред=(RSD_r · xсред)×100 ;
∆x=Sсред · t (P, f);
εсред=(∆x/xсред)×100,
где xсред — среднее значение содержания анализируемого вещества в пробе; t(P, f) — критерий Стьюдента; ∆x — полуширина доверительного интервала среднего значения содержания анализируемого вещества.
Относительную ошибку (погрешность) εсред методики количественного анализа верапамила рассчитывали по формуле:
где σx1, σx2, σxn — значения абсолютных погрешностей измерений отдельных этапов методики количественного определения; x1 , x2 , xn — значения измеряемых величин при реализации методики количественного определения.
Результаты и обсуждение
Для экспериментальной оценки правильности и прецизионности (сходимости) методик анализировали образцы крови с известными количествами верапамила трех уровней концентрации в пределах рабочих диапазонов каждой методики. Определяли сходимость результатов измерений (относительное стандартное отклонение), полученных в пяти различных аналитических циклах — между сериями параллельных определений в разные дни (табл. 1).
Таблица 1. Результаты экспериментальной оценки правильности и прецизионности количественного определения верапамила в крови методами ТСХ с компьютерной денситометрией
| Уровень концентрации в образцах крови, нг/мл\ | Правильность, % | Сходимость между сериями параллельных определений, % |
| Нижний 500,0 | 16,4 | 24,3 |
| Средний 2000,0 | 14,8 | 10,5 |
| Высокий 4000,0 | 20,2 | 5,8 |
Относительные погрешности определения количества верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией, используемые для оценки правильности методики, для всех уровней концентрации не превышали ±20%.
Разброс результатов, выраженный в форме относительного стандартного отклонения RSD_r, уменьшался от 24,3% для нижнего уровня концентрации до 5,8% для высокого.
Любая методика количественного определения представляет собой совокупность взаимосвязанных измерений различных величин, которые в итоге формируют суммарную погрешность выявления количества анализируемого вещества в пробе.
Недостоверность или отсутствие информации о погрешности методики количественного определения установили с помощью следующих прогностических алгоритмов, основанных на теоретических оценках:
— на оценке погрешности измерения отдельных этапов аналитической методики;
— на оценке погрешности на основании величины концентрации анализируемого вещества в пробе исследуемого объекта (по уравнению Горвица).
Раздельно не рассматривали вклад в итоговую (общую) погрешность методик количественного определения систематических и случайных ошибок.
Нами разработана компьютерная программа Chem Metr Evaluation 1.0 для IBM PC-совместимых персональных компьютеров. Программа предназначена для автоматического расчета величины относительной погрешности с помощью методик количественного определения в фармацевтическом анализе и судебно-химической экспертизе. Можно применять программу для оценки погрешности определения на этапах разработки и использования методики анализа, а также для априорной метрологической экспертизы методов количественного определения в практической деятельности химиков-экспертов при судебно-химических исследованиях.
В табл. 2 приведены основные этапы методики анализа содержания верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией с оценкой погрешности измерения.
Таблица 2. Теоретическая оценка погрешности методики количественного определения верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией
| № | Этап анализа | Абсолютная погрешность σX | Относительная погрешность (σX/x)×100, % |
| 1 | Взятие навески 10 мл | 0,1 | 1,0 |
| 2 | Дозирование пробы 50 мкл (дозатор полуавтоматический) | — | 5,0 |
| 3 | Степень извлечения верапамила | — | 7,0 |
| 4 | Измерение площади пятна (ТСХ-менеджер) | — | 5,0 |
| 5 | Погрешность градуировки | — | 10,0 |
| Относительная погрешность расчетная εсред, % (программа «Chem Metr Evaluation 1.0») | 14,1 | ||
| Предел сходимости расчетный RSD_r, % (уравнение Горвица): для 300 нг/мл/для 5000 нг/мл/среднее значение для рабочего диапазона | 9,1/5,9/7,5 | ||
| Относительная погрешность расчетная εсред, % (уравнение Горвица): для 300 нг/мл/для 5000 нг/мл/среднее значение для рабочего диапазона | 27,3/16,5/21,9 | ||
| Сходимость RSD_r (%), заявленная разработчиком: для 300 нг/мл/для 5000 нг/мл/среднее значение для рабочего диапазона | 24,3/5,8/15,1 | ||
| Относительная ошибка εсред (%), заявленная разработчиком: для 300 нг/мл/для 5000 нг/мл/среднее значение для рабочего диапазона | 67,5/16,1/41,8 | ||
Из данных табл. 2 видно, что погрешность данной методики, заявленная нами как разработчиками, имеет среднее значение для рабочего диапазона методики 41,8%.
Погрешности, рассчитанные с помощью программы Chem Metr Evaluation 1.0 и уравнения Горвица, составляют 14,1 и 21,9% соответственно. Минимальный уровень погрешности извлечения верапамила из проб крови установлен на основании экспериментальных данных.
Разброс значений содержания верапамила в пробах крови, оцениваемый только как функция его концентрации по уравнению Горвица, не превышал 7,5% (среднее значение для рабочего диапазона).
Таким образом, все варианты теоретического прогноза погрешности методики денситометрического определения верапамила в крови не превышали значений погрешности, полученных нами экспериментальным путем.
В ходе определения погрешности методики экспериментальным путем максимальный уровень погрешности 14,1%, обусловленный систематическими ошибками, превышен в 3 раза за счет вклада случайного разброса результатов только в условиях сходимости.
Предложенный нами алгоритм применения компьютерной программы Chem Metr Evaluation 1.0 представлен на схеме (см. рисунок).
Рис. Алгоритм применения компьютерной программы Chem Metr Evaluation 1.0 в судебно-химической экспертизе.
Выводы
1. На примере методики анализа содержания верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией показаны возможности теоретического прогнозирования метрологических характеристик для методик количественного определения.
2. На основе применения компьютерной программы Chem Metr Evaluation 1.0 предложен алгоритм прогностического определения относительной погрешности для методик количественного анализа в судебно-химической экспертизе.
3. В основе реализации алгоритма лежит детальный анализ оценок погрешностей измерений на этапах пробоподготовки, измерения величины аналитического сигнала.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.