Ненаправленный скрининг — наиболее востребованный подход в современных реалиях анализа биологических объектов при химико-токсикологическом и судебно-химическом исследованиях. Условия скрининга являются компромиссными, так как ставят своей целью охват широкого круга токсикантов, что обусловливает использование универсальных фаз сорбентов (например, C8/SCX) при использовании твердофазной экстракции. Частный анализ применяется для более специфичной и точной оценки конкретного соединения или определенной группы веществ, что позволяет в ряде случаев сократить временные рамки исследования и трудозатраты.
Каннабиноиды, природные и синтетические, являются распространенной группой наркотических средств. Для установления их употребления используют частные методы исследования мочи. Особенности метаболизма синтетических каннабимиметиков с образованием основных маркеров кислотного характера [1] позволяют предположить возможность применения для их выделения методом твердофазной экстракции (ТФЭ) сорбентов ионообменного характера, а именно анионообменного или смешанного типа (SAX или C8/SAX).
Анионообменная фаза (SAX) содержит химически связанную с диоксидом кремния функциональную группу — четвертичный амин. Смешанный тип сорбента (C8/SAX) подразумевает бимодальный, неполярный и анионообменный режимы связывания целевых аналитов. Фазы на основе сильных анионитов идеально подходят для экстракции карбоксильных кислот. Ионообменную фазу SAX используют для извлечения и очистки экстрактов из различных матриц и поиска многообразных веществ при токсикологических исследованиях, а также исследованиях кинетики лекарственных препаратов и их метаболитов.
В литературе описано применение данного типа фаз (SAX и C8/SAX) для извлечения из биологического материала соединений кислотного характера: гамма-гидроксимасляной кислоты [2], некоторых нестероидных противовоспалительных средств кислотного характера [3], основного маркера употребления каннабиноидов в моче — 11-нор-D9-тетрагидроканнибинол-9-карбоновой кислоты [4], салициловой кислоты и ее метаболитов [5], этилглюкуронида [6, 7].
Цель работы — изучение возможности применения патронов с сорбентом смешанного типа C8/SAX на примере метаболитов синтетического каннабимиметика MDMB(N)-073F для выделения их из мочи после ферментативного гидролиза в сравнении с типом сорбента C8/SCX.
Материал и методы
Оборудование: газовый хроматограф Agilent 7820 (капиллярная колонка НР-5MS, внутренний диаметр 0,25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0,25 мкм); масс-селективный детектор Agilent 5975; система с вакуумной камерой (12 позиций); насос низкого вакуума KNFlabLABOPORT; термоблок ПЭ-4030; одноканальный испаритель ПЭ-2300; микровстряхиватель ПЭ-2; бытовая микроволновая печь SupraMWS-1824SW; патроны для ТФЭ: с фазой C8/SCX —SampliQ EVIDEX (200 мг/3 мл), с фазой C8/SAX — Bond Elut Certify II (200 мг/3 мл); полуавтоматические пипетки-дозаторы (для отбора объемов жидкостей: 4—40, 40—200 мкл и 0,2—1,0, 1—5 мл).
Материалы: β-глюкуронидаза, Type HP-2, FromHelixPomatia, 100000 ЕД/мл. Реактивы и растворители марки «х.ч.».
Объекты. В исследовании использовали 6 проб мочи от лиц, проходивших медицинское освидетельствование. Пробы мочи до исследования хранили в замороженном виде при температуре –18 °C.
Подготовка проб. Для ферментативной деконъюгации образцов мочи к пробе 1 мл мочи добавляют 250 мкл 1/15М фосфатного буфера pH 6,0 и 50 мкл β-глюкуронидазы, выдерживают при температуре 45 °C 2 ч.
Подготовку образцов мочи и последующую дериватизацию полученного экстракта с использованием патронов для ТФЭ SampliQ EVIDEX проводят аналогично описанным в работе С.С. Катаева и соавт. [8].
Подготовка образцов мочи с использованием патронов для ТФЭ SampliQ EVIDEX (200 мг/3 мл) со смешанной фазой. К образцам мочи без гидролиза и после гидролиза добавляют 2 мл 1/15 М фосфатного буфера pH 4,8. Содержимое флаконов центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, центрифугат отделяют от осадка. Кондиционирование сорбента: последовательное пропускание через картридж 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15М фосфатного буфера pH 4,8. Далее загружают образец со скоростью 1 мл/мин. Промывка: 1 мл 1/15М фосфатного буфера pH 4,8, затем 1 мл 10% этанола. Сушат патрон под вакуумом 20 мин. Элюат I получают двукратным пропусканием через патрон 2 мл смеси н-гексан — этилацетат (2:1), элюат II — двукратным пропусканием через патрон 2 мл смеси дихлорметан-2-пропанол — 25% аммиак (2:1:0.1). Оба элюата испаряют в токе азота при температуре 45 °C
Дериватизация элюатов I и II.
Метилирование. К сухому остатку элюата I добавляют 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодида метила и 20—25 мг безводного карбоната калия, герметично закрывают и нагревают при температуре 60 °C в течение 60 мин в термоблоке. После охлаждения отбирают жидкую фракцию реакционной смеси в чистую виалу и испаряют в токе азота при температуре 45 °C. Сухой остаток растворяют в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводят в испаритель газового хроматографа.
Ацетилирование. К сухому остатку элюата II или элюата I (последний после процедуры метилирования) добавляют 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида (замывая стенки виалы), виалу плотно укупоривают и обрабатывают микроволновым излучением в СВЧ-печи мощностью 560 Вт в течение 5 мин. После охлаждения флакон вскрывают, выпаривают избыток реагентов в токе азота при температуре 45 °C; сухой остаток растворяют в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводят в испаритель ХМС.
Подготовка образцов мочи с использованием патронов для ТФЭ Bond Elut Certify II (200 мг/3 мл). К образцам мочи после гидролиза добавляют 2 мл 0,1 М раствора натрия ацетата pH 7,0, содержимое флаконов центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, центрифугат отделяют от осадка.
Кондиционирование сорбента патрона: через картридж пропускают 2 мл 95% этанола и 2 мл 0,1 М раствора натрия ацетата pH 7,0. Загрузка образца происходит со скоростью 1—2 мл/мин. Промывка: 1 мл 0,1 М раствора натрия ацетата pH 7,0 и 2 мл 50% метанола. Сушка под вакуумом в течение 10 мин. Получение элюата: двукратное пропускание через патрон по 2 мл смеси н-гексан—этилацетат (3:1), содержащей 1% ледяной уксусной кислоты, со скоростью 1—2 мл/мин. К полученному элюату добавляют 50 мкл спиртового раствора гексенала (0,2 мг/мл) в качестве внутреннего стандарта. Элюат испаряют в токе азота при температуре 45 °C.
Дериватизацию проводят с использованием метилирования: к сухому остатку элюата добавляют 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодида метила и 20—25 мг калия карбоната безводного, герметично закрывают и нагревают при температуре 60 °C в течение 60 мин в термоблоке. Жидкую фракцию реакционной смеси после охлаждения переносят в чистую виалу и испаряют в токе азота при температуре 45 °C. Сухой остаток растворяют в 100 мкл этилацетата безводного, 1 мкл вводят в испаритель газового хроматографа.
Режим работы газового хроматографа с масс-спектрометрическим детектором. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1,5 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 15:1 с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задают 250 и 280 °C. Температура колонки: начальная 70 °C в течение 2 мин, прогрев до 280 °C со скоростью программирования 20°/мин, выдержка при конечной температуре 8 мин.
Напряжение на умножителе масс-спектрометрического детектора устанавливают равной величине автоматической настройки детектора. Регистрацию масс-спектров проводят в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42—450 Да.
Программное обеспечение исследований и расчеты. Обработку хроматограмм для идентификации компонентов проб проводят с помощью программ MSD ChemStation E.02.01.1177 (Agilent) и AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST).
Относительное содержание метаболитов MDMB(N)-073F (рис. 1) рассчитывают для их метиловых эфиров по отношению площади пиков иона с величиной m/z: М1 и артефакт М4 — 219, M2.1 и М2.2 — 249, М3 — 159, М5 — 245, М6.1 и М6.2 — 235, М7, М9.1 и М9.2 —189, М8 — 217 и площади пика иона m/z 235 для N-метилгексенала в элюате. Содержание М1 принято за 100%, значение прочих метаболитов рассчитывают по соотношению площади пиков характеристических ионов, имеющих интенсивность 100% в масс-спектре метаболитов.
Рис. 1. Химическая структура метаболитов каннабимиметика MDMB(N)-073F.
Для расчета физико-химических констант (LogP, Koc) используют пакет программ ACD/Labsv.6,00 (Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada).
Результаты и обсуждение
Десять метаболитов фазы I синтетического каннабимиметика MDMB(N)-073F были ранее идентифицированы нами [8] в моче потребителей (на рис. 1 приведены их структуры).
Большинство метаболитов (кроме М10) имеют карбоксильную функциональную группу. Это свидетельствует о том, что одним из основных процессов биотрансформации фазы I является образование соединений кислотного характера.
В табл. 1 приведены результаты расчетов некоторых физико-химических констант: логарифм коэффициента распределения октанол-вода (LogP) и коэффициенты адсорбции (Koc) при двух использованных в ТФЭ значениях pH среды для каннабимиметика MDMB(N)-073F и его метаболитов.
Из данных табл. 1 видно, что большинство метаболитов MDMB(N)-073F являются низкогидрофобными соединениями, за исключением метаболитов М9.1 и М9.2, которые гидрофильные. Учитывая направленность биотрансформации MDMB(N)-073F в организме человека на образование более гидрофильных соединений, использование в ТФЭ анионитов для извлечения из мочи метаболитов фазы I позволяет предполагать более полное их извлечение из объекта исследования.
Таблица 1.Физико-химические характеристики каннабимиметика MDMB(N)-073F и его метаболитов
| Соединение | LogP | Koc (pH 4,8) | Koc (pH 7,0) |
| MDMB(N)-073F | 2,89 | 893,54 | 893,54 |
| М1 | 2,39 | 19,05 | ~1 |
| М2.1, М2.2 | 1,65 | 6,05 | ~1 |
| М3 | 1,29 | 4,70 | ~1 |
| М4 | 1,44 | 3,74 | ~1 |
| М5 | 1,32 | 8,88 | ~1 |
| M6.1, M6,2* | 1,13—1,28 | 3,90—4,57 | ~1 |
| M7 | 2,39 | 27,04 | ~1 |
| M8 | 1,23 | 4,51 | ~1 |
| M9.1, M9.2 | 0,55 | 1,66 | ~1 |
| М10 | 2,09 | 324,71 | 324,68 |
Примечание. * — величины LogP и Кос варьируют в зависимости от местоположения гидроксильной группы в алкильной цепи.
Изучили возможность использования более селективных, чем скрининговые, условий для выделения метаболитов синтетического каннабимиметика MDMB(N)-073F из мочи его потребителей. Применяли патроны со смешанной фазой С8/SAX (октил/анионит) и сравнили относительный выход метаболитов MDMB(N)-073F на патронах для твердофазной экстракции двух типов из мочи.
Для ТФЭ использовали также патроны со смешанной фазой С8/SCX (октил/катионит), позволяющие выделять из биологического материала широкий круг лекарственных, наркотических веществ, их метаболитов [9, 10], в том числе маркеры синтетических каннабимиметиков и природных каннабиноидов.
В 6 пробах мочи у лиц, употреблявших синтетические каннабимиметики, определили относительное содержание метаболитов синтетического каннабимиметика MDMB(N)-073F при использовании патронов Bond Elut Certify II (С8/SAX) (табл. 2) и SampliQ EVIDEX (С8/SCX) (табл. 3).
Таблица 2. Относительное содержание метаболитов MDMB(N)-073F, полученное при использовании патронов Bond Elut Certify II (С8/SAX)
| Метаболит | Проба мочи | Медиана | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| М1* | 0,196 | 0,088 | 0,066 | 0,796 | 0,643 | 0,177 | 0,186 |
| М2.1 | 1,86 | 1,41 | 0,46 | 0,51 | 0,67 | 0,22 | 0,591 |
| М2.2 | 0,29 | 0,37 | 0,42 | 0,30 | 0,33 | 0,28 | 0,316 |
| М3 | 4,49 | 10,69 | 14,43 | 10,55 | 10,75 | 11,11 | 10,717 |
| М4 | 2,86 | 5,72 | 10,51 | 2,26 | 4,07 | 8,09 | 4,894 |
| М5 | 14,00 | 4,49 | 6,01 | 6,58 | 7,14 | 5,33 | 6,294 |
| М6.1 | 0,80 | 0,46 | НО | 0,69 | 0,71 | 0,39 | 0,572 |
| М6.2 | 0,17 | НО | » | 0,09 | 0,07 | НО | 0,035 |
| М7 | 2,00 | 0,60 | » | 0,71 | 0,48 | 0,86 | 0,652 |
| М8 | 0,59 | НО | » | 0,40 | 0,52 | 0,81 | 0,460 |
| М9.1 | 0,70 | 0,28 | 9,83 | 0,90 | 0,79 | 0,71 | 0,750 |
| М9.2 | 0,48 | НО | НО | 0,35 | 0,29 | НО | 0,143 |
Примечание. * — для М1 приведено абсолютное значение соотношения площади пика к площади пика внутреннего стандарта, для М2—М9 — отношение к М1 в процентах. Здесь и в табл. 3: НО — не обнаружено.
Таблица 3.Относительное содержание метаболитов MDMB(N)-073F, полученное при использовании патронов SampliQ EVIDEX (С8/SCX)
| Метаболит | Проба мочи | Медиана | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| М1* | 0,213 | 0,095 | 0,066 | 0,781 | 0,63 | 0,174 | 0,194 |
| М2.1 | 2,14 | 1,76 | 0,52 | 0,22 | 0,15 | 0,13 | 0,370 |
| М2.2 | 0,26 | 0,68 | 0,51 | 0,19 | 0,15 | 0,14 | 0,225 |
| М3 | 2,96 | 9,60 | 9,31 | 5,74 | 4,84 | 7,59 | 6,665 |
| М4 | 3,23 | 10,00 | 10,11 | 1,66 | 1,81 | 7,13 | 5,180 |
| М5 | 12,77 | 8,38 | 9,17 | 3,28 | 1,47 | 3,89 | 6,135 |
| М6 | 1,25 | 0,92 | 0,58 | 0,44 | 0,18 | 0,38 | 0,510 |
| М7 | 0,98 | 0,60 | НО | 0,29 | 0,21 | 0,49 | 0,490 |
| М8 | 0,74 | НО | « | 0,14 | НО | 0,36 | 0,360 |
| М9 | 0,49 | 0,49 | 6,06 | 0,36 | 0,26 | 0,27 | 0,425 |
Примечание. * — для М1 приведено абсолютное значение соотношения площади пика к площади пика внутреннего стандарта, для М2—М9 — отношение к М1 в процентах.
Результаты сравнительного исследования полученных соотношений относительного содержания метаболитов MDMB(N)-073F в моче с использованием фаз С8/SAX и С8/SCX (значение медианы для найденного количества метаболитов с применением фазы С8/SCX принято за 100%) приведены на диаграмме (рис. 2).
Рис. 2. Сравнение относительного содержания метаболитов MDMB(N)-073F (М2 — М9) в моче с использованием фаз С8/SAX и С8/SCX.
Из представленных данных следует, что использование смешанной фазы С8/SAX с анионитом показывает сравнимую либо более высокую эффективность экстракции большинства идентифицированных метаболитов каннабимиметика MDMB(N)-073F из образцов мочи (от 103 до 176% в сравнении с С8/SCX), особенно метаболитов М3 и М9 (161 и 176% соответственно). Данный факт может быть обусловлен тем, что ионно-обменный механизм удерживания аналитов при твердофазной экстракции является более сильным, чем гидрофобные взаимодействия с сорбентами фазы С8.
В случае применения фазы С8/SCX в приведенных условиях анализа метаболит М4 определяется как сумма метаболитов М4 и М10, в то время как при использовании фазы С8/SAX в описанных условиях проведения твердофазной экстракции извлекается только метаболит М4.
Выводы
1. Полученные результаты исследования позволяют рекомендовать патроны для ТФЭ с фазой С8/SAX при проведении направленного исследования на наличие метаболитов каннабимиметиков, имеющих в качестве основных метаболитов соединения карбоксильного характера.
2. Использование фазы С8/SAX показывает более высокую эффективность экстракции в отношении низкогидрофобных и гидрофильных соединений кислотного характера (для большинства метаболитов MDMB(N)-073F от 103 до 176% в сравнении с патронами типа С8/SCX).
3. Применение патронов для ТФЭ с сорбентами на основе сильных анионитов (SAX,С8/SAX) может быть использовано для выделения метаболитов каннабимиметиков из биологического материала при проведении целевого скрининга в практике химико-токсикологического анализа и судебно-химических исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.