В последние годы высокоэффективная жидкостная хроматография—тандемная масс-спектрометрия (ВЭЖХ-ТМС) успешно применяется в клинической и судебной токсикологии в качестве надежного, селективного и чувствительного метода для скрининга, идентификации и количественной оценки малых молекул [1]. A.G. Helfer и соавт. [2] описали технологию Orbitrap для комплексного скрининга мочи на основе метаболитов.
Опубликованы различные методы LC-HR-MS для скрининга лекарственных средств в биологических объектах с использованием масс-анализаторов времени полета (TOF) [1, 3]. Приводим впервые разработанный комплексный метод ВЭЖХ-ТМС с высоким разрешением (ВР) с использованием технологии Orbitrap для качественного и количественного определения залеплона и клобазама в аналитических пробах для целей и задач судебно-медицинской экспертизы.
Клобазам — противосудорожное, анксиолитическое средство, производное 1,5-бензодиазепина. Химическая формула 7-хлор-1-метил-5-фенил-1H-1,5-бензодиазепин-2,4(3H,5H)-дион; молекулярная формула C16H13ClN2O2; торговое название на территории РФ — «Фризиум». Лекарственная форма — таблетки по 10 мг [4]. Клобазам входит в перечень лекарственных средств для медицинского применения, подлежащих предметно-количественному учету [5], и в список психотропных веществ, оборот которых в Российской Федерации ограничен и в отношении которых допускается исключение некоторых мер контроля в соответствии с законодательством РФ и международными договорами РФ (список III) [6].
Залеплон — снотворное средство пиразоло-пиримидинового ряда, не относится к производным бензодиазепина, но является агонистом бензодиазепиновых рецепторов. Химическая формула — N-[3-(3-цианопиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)фенил]-N-этилацетамид; молекулярная формула C17H15N5O; торговое название на территории РФ — «Соната» и «Анданте». Лекарственная форма — капсулы по 5 и 10 мг [7]. Как снотворное лекарственное средство является рецептурным. Для залеплона риск лекарственной зависимости и синдром отмены был и остается достаточно высоким. Отсутствие ряда мер контроля со стороны действующего законодательства за оборотом залеплона предопределяет потенциальную возможность злоупотребления этим препаратом [8].
Проблема наступления острого и летального отравления клобазамом и залеплоном до настоящего времени остается актуальной задачей судебно-медицинской экспертизы. Механизм действия на организм человека и побочные эффекты этих препаратов схожи, что затрудняет установление отравления токсикантом по клинической картине. Важную роль играют результаты химико-токсикологического и судебно-химического исследований биологических объектов.
Цель исследования — разработка методики качественного и количественного определения агонистов бензодиазепиновых рецепторов (залеплон и клобазам) с учетом разной химической структуры методом ВЭЖХ-ТМС с ВР с использованием технологии Orbitrap для целей и задач судебно-медицинской экспертизы.
Материал и методы
Исследовали действующее вещество клобазам лекарственного препарата «Фризиум» (ЛП-006422-240820) и действующее вещество залеплон лекарственного препарата «Соната Адамед» (ЛП-004877-040620) после очистки от вспомогательных веществ. Полученные рабочие образцы (РО) — спиртовой раствор с содержанием 1 мг/мл исследуемого вещества.
Для исследования использовалась ВЭЖХ-ТМС с высоким разрешением с использованием технологии Orbitrap на приборе.
Условия хроматографирования при ВЭЖХ-ТМС ВР. Программное обеспечение — Termo Scientific Xcalibur 4.4; колонка TF Accucore PhenylHexyl column (100 × 2,1 мм, 2,6 мм), температура колонки 30 °C.
Подвижная фаза представлена в градиентном режиме и состоит из подвижной фазы A — 2мM раствор аммония формиата 0,1% муравьиной кислоты (pH 3,0) в воде и подвижной фазы B — 2мM раствор аммония формиата 0,1% муравьиной кислоты в смеси ацетонитрил-метанол (1:1). Скорость потока 0,5 мл/мин. Градиент по скорости подачи подвижной фазы может негативно сказаться на чувствительности анализа, поскольку параметры температурного источника ионизации, напряжения на капилляре и расхода газов на распыление напрямую зависит от скорости ее потока. Градиентный режим представлен в табл. 1.
Таблица 1. Градиент подвижной фазы
| Время, мин | Скорость потока подвижной фазы, мл/мин | Фаза A, % | Фаза B, % |
| 0 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 1,0 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 10,0 | 0,5 | 1,0 | 99,0 |
| 11,5 | 0,5 | 1,0 | 99,0 |
| 12,0 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 13,5 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 15,5 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
Детектирование проводили в режиме информационно зависимой фрагментации.
Параметры сканирования: разрешение Orbitrap — 60 000; диапазон сканирования — 100—1000 m/z; RF Lens 60%. Автоопределение времени инжекции ионов в ловушку. Порог интенсивности для фрагментации 1.0e4. Режим исключения ионов осуществлялся после получения одного спектра за 6 с, что при оптимизации метода на быстрое разделение могло привести к возникновению ложноотрицательных результатов из-за низкой скорости сканирования, в то время как ее существенное повышение могло привести к значительному падению интенсивности сигналов. Применение данного режима сканирования позволило добиться максимальной чувствительности (ввиду отсутствия потерь в процессе соударительной ионизации), что важно при оценке временных окон обнаружения.
Фрагментация: окно изоляции 2 m/z; энергия диссоциации — 15, 30 и 45%; разрешение для фрагментов 30 000. При оптимизации условий качественного и количественного анализа уточнение окон обнаружения проводили рутинным для лаборатории методом.
Система оснащена источником ионизации с параметрами: тип ионного источника H-ESI; напряжение электроспрея положительная ионизация 3500 V; напряжение электроспрея отрицательная ионизация 2500 V. Распыляющий газ азот 50 отн. ед., вспомогательный газ азот 13 отн. ед. Температура капилляра 280 °C; температура испарителя 350 °C. Встроенная подстройка массы — EASY-IC (флуорантрен).
Для надежной идентификации по результатам анализа использовали следующее программное обеспечение и библиотеки масс-спектрометрической информации: TRACEFINDER 5.1 SP1; TOXFINDER 1.0; EFS_HRAM_Compound_Database; Toxicology_HRAM_Compound_Database; Thermo Scientific mzVault HRAM MS/MS spectral library; COMPOUND DISCOVERER 3.1; MzCloud.
Результаты и обсуждение
Подобранные условия позволяют достигать оптимальных результатов хроматографирования (табл. 2).
Таблица 2. Теоретические и наблюдаемые массы залеплона и клобазама, полученные с применением ВЭЖХ-ТМС ВР
| Вещество | Элементная композиция | Теоретическая масса протонированного иона, m/z | Наблюдаемая масса протонированного иона, m/z | Ошибка определения массы, ppm | Время удерживания, мин |
| Залеплон | C17H15N5O | 306,1349 | 306,1348 | 0,32 | 6,11 |
| Клобазам | C16H13ClN2O2 | 301,0739 | 301,0738 | 0,33 | 6,90 |
На повышение экспрессности анализа, а также уменьшение ширины хроматографических пиков влияет градиент по составу подвижной фазы и изменение скорости ее подачи. Подобранная развертка градиента позволила уменьшить количество коэлюирующихся соединений и обеспечить лучшую работу масс-спектрометра.
Время удерживания (n=6) для залеплона составило 6,11±0,04 мин (±0,65%), а для клобазама 6,90±0,05 мин (±0,72%), при этом коэффициент разделения 1,13, что достаточно для точной визуальной идентификации исследуемого вещества экспертом [9]. Как видно на рис. 1, характерные ионы для залеплона 306,1348 m/z, а для клобазама 301,0738 m/z.
Рис. 1. Хроматограмма РО залеплона (а) и клобазама(б).
Полученные полные спектры исследованных веществ с диссоциацией масс-спектров ионов, характерных для фрагментов молекулы в различных функциональных группах, позволяют выделить по 6 характерных ионов, представленных на рис. 2.
Рис. 2. Масс-спектр ионов залеплона (а) и клобазама (б).
Для количественного определения строили калибровочные графики на залеплон и клобазам в диапазоне концентраций 1—1000 нг/мл (рис. 3). Пробу вводили в количестве 3 мкл исследуемого раствора. Коэффициент корреляция в данном диапазоне концентраций для залеплона составил 0,9999, а для клобазама — 0,9998, линейные уравнения — Y=2,962e5X+3,663e5 и Y=2,089e5X-3,266e5 соответственно. Изученная концентрация удовлетворяет потребность в количественном определении исследованных веществ для экспертов судебно-химических и химико-токсикологических подразделений. Провели статистическую обработку полученных данных и валидационную оценку [10] по параметрам «правильность», «прецизионность», «сходимость» методом постколоночного введения аналита — параметр «подавление/повышение ионизации».
Рис. 3. Калибровочный график РО залеплона (а) и клобазама (б) в интервале концентраций 1–1000 нг/мл.
Выводы
1. Разработана методика с оптимальными параметрами с повышенной экспрессностью для идентификации и количественного определения залеплона и клобазама методом ВЭЖХ-ТМС с высоким разрешением с использованием технологии Orbitrap.
2. Установлена возможность использования данных параметров для одновременного обнаружения залеплона и клобазама с коэффициентом разделения 1,13.
3. Проведена валидационная оценка предложенной методики по параметрам «правильность», «прецизионность», «сходимость», «подавление/повышение ионизации».
4. Предложенная методика идентификации может быть использована для формирования базы отечественных масс-спектров на сильнодействующие и наркотические вещества.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.