ВИЧ-инфекция продолжает оставаться глобальной проблемой современного общества. К сожалению, лечение этого заболевания не обходится кратковременной терапией, а предполагает ежедневный прием медикаментов. Одним из препаратов, применяемых с целью лечения ВИЧ-инфекции, является эмтрицитабин. Антиретровирусная терапия этим препаратом показана, как правило, в течение всей жизни [1].
При пероральном приеме всасывание эмтрицитабина из желудочно-кишечного тракта происходит достаточно быстро. Эмтрицитабин в большей степени выводится почками в нативном виде (около 86%). Приблизительно 13% введенной дозы лекарственного препарата было обнаружено в виде метаболитов.
Комбинированная антивирусная терапия, включающая эмтрицитабин, может стать причиной серьезного отравления. При этом в источниках литературы отсутствуют данные об условиях изолирования эмтрицитабина с целью дальнейшего химико-токсикологического анализа, в связи с чем изучение данного вопроса является как никогда актуальным.
Цель исследования — изучить возможность экстракции эмтрицитабина из биологического материала и разработать методики химико-токсикологического анализа эмтрицитабина при остром отравлении.
Материал и методы
Экспериментальные исследования выполняли с помощью следующего оборудования: спектрофотометр СФ-2000 (Россия), жидкостной хроматограф «Милихром А-02» с ультрафиолетовым (УФ) детектором (Россия).
Исследование проводили с использованием капсул эмтрицитабина по 0,2 г (АО «Фармасинтез», Россия), воды очищенной, хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М, натрия гидроксида раствор 0,1 М, 25% раствора аммиака, органических растворителей (трихлорметан «х.ч.», дихлорметан «х.ч.», эфир «х.ч.», этилацетат «х.ч.», бензол «х.ч.», изопропанол «х.ч.», гексан «х.ч.»), растворов электролитов (20% раствор NaCl «х.ч.», насыщенный раствор NaCl «х.ч.», 5% раствор Na2SO4 «х.ч.», насыщенный раствор Na2SO4 «х.ч.», 20% раствор (NH4)2SO4 «х.ч.» и насыщенный раствор (NH4)2SO4 «х.ч.».
Эмтрицитабин изолировали методом жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ): готовили водный раствор эмтрицитабина концентрации 0,05 г/мл, доводили pH от 2,0 до 11,0 с помощью хлористоводородной кислоты раствора 0,1М либо аммония гидроксида раствора 10%. Для получения нужного значения pH требовалось несколько капель соответствующего реактива, увеличение объема учитывали в расчетах. Экстрагирование проводили однократно порциями по 3 мл разными органическими растворителями, которые испаряли при комнатной температуре досуха.
В качестве биообъектов использовали слюну в количестве 5 мл, мочу — 35 мл, плазму — 10 мл, которые отбирали у здоровых добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение 7 сут.
Для приготовления модельных смесей биологических объектов использовали водный раствор, содержащий 0,02, 0,04 и 0,06 г/мл эмтрицитабина соответственно. Модельные образцы биожидкостей готовили, добавляя к 15 или 10 мл водного раствора эмтрицитабина в разных концентрациях 0,06, 0,04, или 0,02 г/мл соответственно 5 мл предварительно замороженной на 24 ч слюны, 15 мл плазмы или 35 мл мочи. Смеси выдерживали в течение суток при комнатной температуре. Затем в модельных смесях слюны осаждали белки трихлоруксусной кислоты раствором 50%, центрифугировали и отделяли от осадка, модельные смеси плазмы крови центрифугировали и далее использовали надосадочную жидкость, модельные смеси мочи фильтровали.
Модельные смеси печени готовили, прибавляя к 25 г органа, измельченного до размера 0,5×0,5×0,5 см3, 15 мл водного раствора препарата в вышеописанных концентрациях и оставляли на сутки при комнатной температуре. Последующую пробоподготовку осуществляли согласно методикам А.А. Васильевой, В.Ф. Крамаренко и Стаса—Отто [2].
Далее применяли разработанную методику: 1 мл извлечения из модельной смеси переносили в пробирку, доводили pH до 9 аммония гидроксида раствором 10% и экстрагировали этилацетатом троекратно в течение 7 мин.
Для обнаружения эмтрицитабина в извлечениях использовали хроматографию в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография, ТСХ), УФ-спектрофотометрию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Для идентификации аналита методом ТСХ наносили извлечения на хроматографические пластинки «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ 10×15 см, высушивали. Хроматографировали восходящим методом, используя систему этанол-аммиака раствор концентрированный 25% (40:1). В качестве способа проявления применяли облучение в УФ свете (254 нм).
Обнаружение эмтрицитабина выполняли с помощью метода УФ-спектрофотометрии в растворах сухих остатков, приготовленных по следующей методике: к сухому остатку добавляли 10 мл воды очищенной, 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, объем раствора доводили до метки хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М. Снимали УФ-спектры на приборе СФ-2000 в кювете с толщиной слоя 10 мм в диапазоне длин волн 200—400 нм. Раствором сравнения выступал хлористоводородной кислоты раствор 0,1 М.
Обнаружение и количественное определение эмтрицитабина в извлечениях методом ВЭЖХ проводили по следующей методике [6]: обращенная фаза ProntoSIL 120-5C18AQ («Bischoff», Германия), режим элюирования — линейный градиент (3700 мкл 5—70% Б) в системе: элюент A: 0,2 M лития перхлорат — 0,005 M раствор хлорной кислоты (pH 2,8); элюент Б: ацетонитрил. Скорость потока элюента составляла 100 мкл/мин; температура колонки — 40 °C; объем пробы — 2 мкл, длина волны — 280 нм. Количественное содержание эмтрицитабина в извлечениях рассчитывали по стандартному образцу. Линейность метода оценивали, анализируя растворы модельных образцов с разными концентрациями эмтрицитабина. Было установлено, что зависимость площади пика эмтрицитабина от его концентрации линейна и подчиняется уравнению y=78,59x, R2=0,999. Аналитическая область методики находится в пределах 0,2—1,0 мкг/мл. Предел обнаружения составляет 2 мкг/мл.
Для проведения апробации методики изолирования на модели острого отравления использовали лабораторных животных (2-месячные крысы линии Wistar массой 180 г, из которых были сформированы 5 опытных групп и одна контрольная, в каждой по 5 особей). Каждой особи, относящейся к опытным группам, вводили в желудок с помощью зонда суспензию эмтрицитабина в терапевтической (2,86 мг/кг) и токсической (17 мг/кг) концентрациях, рассчитываемых для средней массы человека 70 кг и соответствующих TD50. Введение TD50 было доказано в эксперименте и гарантированно приводило к проявлению токсического эффекта у особей. Далее животных вводили в наркоз через 5 ч, декапитировали и проводили у них забор плазмы крови и мочи [3—5].
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета программ для Windows XP (Microsoft Excel) и с применением t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при доверительной вероятности p<0,05.
Результаты и обсуждение
С целью разработки методики изолирования эмтрицитабина использовали метод ЖЖЭ. Изучили влияние нескольких факторов; природы органического растворителя, pH среды, электролита, времени и кратности экстракции на изолирование эмтрицитабина из водных растворов. Разработанные на водных растворах условия применили при изолировании препарата из модельных смесей мочи, слюны, плазмы крови, печени [2—4].
На первом этапе исследования изучили влияние pH среды и органического растворителя на степень экстракции.
Наибольшая степень извлечения эмтрицитабина из растворов наблюдалась при экстрагировании его этилацетатом (pH=9) (рис. 1).
Рис. 1. Зависимость степени извлечения эмтрицитабина от pH среды и природы органического растворителя.
Результаты исследования показали, что выбранные электролиты не оказывают влияния на степень экстракции эмтрицитабина; в связи с чем при разработке дальнейших методик анализа эмтрицитабина добавление электролита не проводили.
На следующем этапе экспериментальных исследований было рассмотрено влияние времени и кратности экстрагирования на степень изолирования эмтрицитабина. На основании полученных результатов было установлено, что при двукратной экстракции выход составлял 66%, а наибольший выход эмтрицитабина (80%) был зарегистрирован при троекратной экстракции в течение 7 мин.
Разработанная методика была апробирована на модельных смесях мочи, слюны и плазмы крови, а также на твердых биообъектах (печень).
Идентифицировали эмтрицитабин после изолирования из модельных образцов с использованием методов ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.
На предварительном этапе исследование проводили с помощью метода ТСХ с использованием системы этанол: 25% раствор аммиака (40:1) восходящим методом. Значение Rf пятна извлечения эмтрицитабина из биологического материала соответствовало значению Rf стандартного образца свидетеля эмтрицитабина (0,53±0,01).
УФ-спектр стандартного образца эмтрицитабина в растворе хлористоводородной кислоты 0,1 М характеризовался максимумом поглощения при длине волны 291±1 нм (рис. 2), что соответствовало максимуму поглощения эмтрицитабина в извлечениях, полученных из биологических объектов.
Рис. 2. Спектр поглощения 0,001% раствора эмтрицитабина в хлористоводородной кислоте растворе 0,1 М.
При обнаружении эмтрицитабина методом ВЭЖХ на хроматограмме стандартного образца наблюдали один пик с временем удерживания 26 мин (рис. 3), что совпадало со временем удерживания эмтрицитабина, полученного после извлечения из биологических объектов.
Рис. 3. Хроматограмма стандартного раствора эмтрицитабина в метаноле с концентрацией 0,5 мг/мл.
Степень экстракции эмтрицитабина из мочи, плазмы крови, слюны и печени в терапевтической (0,2 г), токсической (1,2 г) и летальной (9,6 г) дозах оценивали методом ВЭЖХ. Статистически обработанные результаты представлены в табл. 1, 2.
Таблица 1. Степень извлечения эмтрицитабина из мочи, плазмы крови и слюны
| Биологический объект | Метрологические характеристики, n=6, P=0,95% | ||
| 0,2 г | 1,2 г | 9,6 г | |
| Моча | x=55,91%; Sx=1,76; ΔX=3,67; ε=8,53%; CV=2,14% | x=61,37%; Sx=0,42; ΔX=0,89; ε=1,45%; CV=2,12% | x=68,83%; Sx=0,46; ΔX=0,97; ε=1,41%; CV=2,14% |
| Плазма крови | x=67,80%; Sx=2,76; ΔX=5,79; ε=3,87%; CV=5,76% | x=74,60%; Sx=0,37; ΔX=0,78; ε=1,04%; CV=2,14% | x=75,70%; Sx=0,32; ΔX=0,68; ε=0,91%; CV=2,13% |
| Слюна | x=43,70%; Sx=0,67; ΔX=1,40; ε=3,22%; CV=2,14% | x=47,84%; Sx=1,07; ΔX=2,24; ε=4,69%; CV=4,49% | x=46,36%; Sx=0,46; ΔX=1,11; ε=2,40%; CV=2,14% |
Таблица 2. Степень извлечения эмтрицитабина из печени
| Метод | Метрологические характеристики, n=6, P=0,95% | ||
| 0,2 г | 1,2 г | 9,6 г | |
| Васильевой | x=44,30%; Sx=0,39; ΔX=0,80; ε=1,83%; CV=3,29% | x=46,40%; Sx=0,65; ΔX=1,35; ε=2,91%; CV=3,38% | x=49,96%; Sx=0,46; ΔX=0,35; ε=1,47%; CV=3,64% |
| Крамаренко | x=40,20%; Sx=0,33; ΔX=0,70; ε=1,74%; CV=4,13% | x=46,446,4%; Sx=0,65; ΔX=1,77; ε=3,72%; CV=3,69% | x=45,80%; Sx=0,45; ΔX=0,94; ε=2,05%; CV=3,67% |
| Стаса—Отто | x=31,70%; Sx=1,57; ΔX=3,28; ε=10,34%; CV=2,14% | x=31,50%; Sx=0,29; ΔX=0,60; ε=1,91%; CV=2,15% | x=33,00%; Sx=0,45; ΔX=0,94; ε=2,85%; CV=2,14% |
Из табл. 1 и 2 видно, что с помощью разработанной методики изолирования из модельной смеси плазмы крови удается извлечь 67,8—75,7% эмтрицитабина; из модельной смеси мочи — 55,91—68,83%, из модельной смеси слюны — 43,70—47,84%, из модельной смеси печени — 33,00—49,96%, что достаточно для установления факта отравления. Следует отметить, что были получены сопоставимые результаты при изолировании эмтрицитабина из модельных образцов печени по модифицированным методам А.А. Васильевой, В.Ф. Крамаренко и Стаса—Отто.
Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям «прецизионность» и «правильность» [6]. Относительное стандартное отклонение (RSD,%) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышала 3,8% для плазмы крови, 5,7% для мочи, 3,6% для слюны, 5,4% для печени.
Разработанные методики были апробированы на лабораторных животных (крысы линии Wistar массой 180 г) после создания модели острого отравления [7].
Результаты количественного определения эмтрицитабина в моче и крови взятых от отравленных животных приведены в табл. 3.
Таблица 3. Содержание эмтрицитабина в организме теплокровных животных (крысы)
| Биологическая жидкость | Найдено эмтрицитабина мкг в 1 мл биологического объекта | Метрологические характеристики |
| Терапевтическая концентрация | ||
| Моча | 6,85 6,50 6,45 6,73 6,68 | X=6,65 S=0,1657 RSD%=2,49 Е%=3,10 |
| Кровь | 3,15 2,85 2,76 2,84 2,93 | X =2,91 S=0,1492 RSD=5,13 Е%=6,37 |
| Токсическая концентрация | ||
| Моча | 35,80 34,46 36,45 35,76 36,58 | X =35,81 S=0,8408 RSD=2,35 Е% =2,92 |
| Кровь | 18,12 16,56 16,23 16,69 16,81 | X =16,88 S=0,7252 RSD=5,134,30 Е%=5,34 |
Из табл. 3 видно, что с помощью разработанной методики удалось обнаружить эмтрицитабин в извлечении из мочи с терапевтической дозой 6,65±2,21 мкг/мл, с токсической дозой 35,81±1,05 мкг/мл, в извлечении из плазмы с терапевтической дозой 2,91±0,19 мкг/мл, с токсической дозой 16,88±0,90 мкг/мл [7].
Выводы
1. Подобраны условия изолирования эмтрицитабина (экстрагент, pH среды, время и кратность экстракции) с помощью ЖЖЭ этилацетатом при pH 9,0 трехкратно в течение 7 мин.
2. Оптимизированы методики изолирования эмтрицитабина из биологических объектов: мочи, слюны и печени — с помощью ЖЖЭ. Валидационная оценка свидетельствует о пригодности предложенных методик. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышала 3,8% для модельной смеси плазмы крови, 5,7% для модельной смеси мочи, 3,6% для модельной смеси слюны, 5,4% для модельной смеси печени.
3. Оптимизированы методики идентификации и количественного определения эмтрицитабина в извлечениях из плазмы, мочи, слюны и печени методами УФ-спектрофотометрии с максимумом поглощения при λ=291±1 нм и ВЭЖХ (пик с временем удерживания 26 мин).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.