Лерканидипин (синонимы: метил-[2-(3,3-дифенилпропилметиламино)-1,1-диметилэтил]-2,6-диметил-4-(3-нитрофенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксилат; 1-[(3,3-diphenylpropyl)(methyl)amino]-2-methylpropan-2-ylmethy]-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate; 5-O-[1-[3,3-дифенилпропил (метил)амино]-2-метилпропан-2-ил] 3-O-метил 2,6-диметил-4-(3-нитрофенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксилат (IUPAC)) является вазоселективным дигидропиридиновым антагонистом кальция, который вызывает системную вазодилатацию, блокируя приток ионов кальция через кальциевые каналы L-типа в клеточных мембранах. Лерканидипин — антигипертензивное средство, применяемое у больных с повышенным артериальным давлением, при хронической стабильной стенокардии и вариантной стенокардии Принцметала [1, 2].

Лерканидипин представляет собой кристаллы желтого цвета, практически не растворимые в воде и хорошо растворимые в диметилформамиде, метаноле и хлороформе. Длительность действия этого соединения в организме обусловлена высокой липофильностью (в сравнении с другими дигидропиридинами) [3—5].

Лерканидипин, как и другие представители блокаторов кальциевых каналов, проявляет токсические свойства. Отравления этими веществами взрослых и детей можно отнести к наиболее опасным в связи с отсутствием специфических антидотов [6, 7]. За последние 20 лет по всему миру зафиксированы многочисленные отравления производными дигидропиридина, в том числе и лерканидипином, которые зачастую приводили к летальному исходу [8, 9].

Методики исследования лерканидипина в биологических матрицах при экспертизах отравлений этим веществом в доступной литературе отсутствуют. Описаны в основном отдельные способы качественной и количественной оценки присутствия лерканидипина в биожидкостях.

Так, при анализе лерканидипина в плазме человеческой крови применяется ультраэффективная жидкостная хроматография (ЖХ) в колонке Waters AcquityTM UPLC C18 (2,1×100 мм) при элюировании смесью 0,1% метановой кислоты и метанола (20:80). Методом пробоподготовки при этом является жидкостно-жидкостная экстракция с использованием смеси н-гексан—этилацетат (50:50) [10]. Лерканидипин может быть изолирован из плазмы с помощью твердофазной экстракции (Phenomenex Strata-X) с добавлением формиата аммония в воде и дальнейшим анализом методом ЖХ с масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) [11]. Описан способ извлечения лерканидипина из плазмы карбинолом, очистки на предколонке и определения с помощью ЖХ-МС/МС в колонке Hedera ODS-2 [12].

Таким образом, вопросы судебно-химического анализа лерканидипина в научной литературе до сегодняшнего дня не нашли должного отражения. В частности, не описан характер распределения этого вещества у теплокровных организмов.

Цель исследования — изучение распределения лерканидипина у теплокровных животных (крысы).

Материал и методы

Исследуемый объект — лерканидипин (5-O-[1-[3,3-дифенилпропил (метил)амино]-2-метилпропан-2-ил] 3-O-метил 2,6-диметил-4-(3-нитрофенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксилат) (ФСП 42-9597-08).

Модель теплокровного организма — крысы линии Wistar.

В опытах с лерканидипином использовали 6 групп крыс (5 групп — опытные, одна группа — контрольная), каждая из которых включала 5 половозрелых самцов 3-месячного возраста (масса 220—240 г) для обеспечения более однородных результатов.

Лабораторным животным вводили среднесмертельную дозу выбранного аналита (890 мг/кг), рассчитанную с помощью метода Г.Н. Першина с использованием ряда Фульда. Введение проводили в водно-суспензионной форме в просвет желудка крыс через зонд (диаметр внутренний 1,8 мм).

Через заданный промежуток времени продолжительностью 2 ч крыс погружали в состояние общей анестезии путем ингаляционного воздействия эфиром и умерщвляли в соответствии с международными стандартами доклинических исследований [13, 14].

После гибели животных, получавших полулетальные дозы аналита, вскрывали. Органы, содержимое полых органов или кровь изымали из трупов, объединяли, при необходимости измельчали и искали в них аналит. Аналогично поступали с животными группы контроля, которым вводили только воду [15—17].

Для извлечения лерканидипина из биологического материала был изучен вариант настаивания с ацетоном, показавшим наилучшие результаты изолирования для 1,4-дигидропиридинов.

После извлечения лерканидипина осуществляли очистку в макроколонке.

Для предварительной идентификации применяли тонкослойную хроматографию (ТСХ) (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ).

Для подтверждающей идентификации аналита использовали электронную спектрофотометрию (в качестве растворителя брали этанол; фрагмент спектра, в котором проводили определение, составлял 190—400 нм). В дальнейшем этот метод применяли и при количественном анализе лерканидипина [18].

В качестве арбитражного метода для подтверждающей идентификации аналита использовали газовую хроматографию с масс-спектрометрией (ГХ-МС) (прибор «Agilent Technologies» 6890 Network с МС-детектором 5973 Network, разрушение молекул электронным ударом (70 эВ), форма регистрации по полному ионному току, область сканирования 40—650 m/z) [19—21].

Результаты и обсуждение

Методика изолирования заключалась в следующем: отобранную массу органов, подвергнутых измельчению, или кровь дважды по 30 мин настаивали с ацетоном, при этом масса изолирующей жидкости в 2 раза превосходила массу биоматериала. Вытяжки объединяли в фарфоровой чашке и испаряли в токе воздуха комнатной температуры. Аналит, присутствующий в остатке, подвергали очистке колоночной хроматографией. С этой целью его обрабатывали 1,6 мл ацетонитрила, затем прибавляли 0,4 мл воды. Раствор вводили в колонку.

Для очистки лерканидипина брали колонку (15×1 см) сорбента «Силасорб С-18», а в качестве элюента применяли смесь ацетонитрил—вода (8:2).

Элюат собирали по 2 мл. Наличие лерканидипина во фракциях доказывали методом ТСХ (пластины «Сорбфил», элюент бутанол—ацетон (5:5), проявление — в ультрафиолетовом (УФ) свете).

Наличие пятен с Rf 0,45±0,03 доказывало нахождение лерканидипина в определяемых фракциях.

Фракции с 8 по 12 (15—24 мл), где обнаруживался лерканидипин, сливали в фарфоровую чашку и испаряли. Остаток растворяли в 5 мл этанола (исходный раствор). По 0,5—2,5 мл раствора вносили в чашки №1 и №2 и испаряли в токе воздуха комнатной температуры.

Для обнаружения методом ТСХ применяли систему бутанол—ацетон (5:5). К остатку в чашке №1 несколько раз прибавляли по 0,2 мл этанола, нанося полосой раствор на линию старта хроматографической пластины. Рядом наносили 5 мкл 0,2% этанольного раствора лерканидипина-стандарта. После прохождения элюента от линии старта до линии финиша проводили облучение хроматограммы УФ-светом (λ=254 нм). Проявляющийся лерканидипин (в виде пятен лилового цвета) идентифицировали по значению Rf (0,45±0,03), соответствующему Rf стандарта.

Лерканидипин 15 мин элюировали из сорбента 5 (10) мл органического растворителя (этанола). После отделения элюата исследовали поглощение им УФ- и видимого излучения. Выявляли совпадение спектральных кривых извлеченного аналита и лерканидипина-стандарта.

В контрольных образцах биоматриц было зафиксировано отсутствие лерканидипина. Поглощение контрольных элюатов (обусловлено эндогенными веществами из 0,5 г матрицы в 1 мл элюата) составляло 0,028 и менее при исследовании органов и 0,022 и менее при исследовании крови.

Для достижения оптимальных условий определения методом ГХ-МС использовали колонку DB-1MS (размер 30 м × 0,25 мм, толщина стационарной фазы (диметилполисилоксана) 0,25 мкм). Были выбраны следующие температурные режимы: для нагрева инжектора — 280 °C, интерфейса — 300 °C, динамика нагрева колонки — от 80 °C (выдержка 120 с) со скоростью 40 °C/мин до 250 °C (выдержка 360 с). Подвижная фаза представляла собой гелий, ее скорость составляла 23,4 м/мин. Остаток в чашке №2 растворяли в 2 мл дихлорметана; 4 мкл этого раствора без деления потока вводили в хроматограф (задержка 180 с).

На рис. 1 и 2 представлены хроматограммы и масс-спектры лерканидипина-стандарта и этого же аналита, выделенного из биоматриц.

Рис. 1. Хроматограммы (метод ГХ-МС) лерканидипина.

а — исследование стандартного образца; б — вещества, изолированного из крови; в — вещества, изолированного из печени.

Рис. 2. Масс-спектры лерканидипина.

а — исследование стандартного образца; б — вещества, изолированного из крови; в — вещества, изолированного из печени.

При идентификации высокочувствительным методом ГХ-МС время удерживания изолированного лерканидипина и его стандарта практически совпадали и находились в пределах 9,40—9,50 мин.

В полученных контрольных хроматограммах для времени удерживания 8,5—10,5 мин не было зарегистрировано присутствия пиков и изменения формы базовой линии.

В масс-спектрах извлеченного из биологического материала аналита имелись свойственные структуре лерканидипина ионы с массами (m/z): 55, 98, 115, 165, 193, 222, 279 (основной ион — 98 m/z).

Количество лерканидипина определяли спектрофотометрическим методом по оптической плотности этанольного раствора в области 357 нм. Разработанные методики количественного определения лерканидипина в биоматрицах на основе УФ-спектрофотометрии соответствовали валидационным критериям линейности, правильности, прецизионности, стабильности.

Пределы обнаружения (ПО) лерканидипина в твердых матрицах и крови определяли путем последовательного снижения добавляемого в матрицу аналита до уровня, соответствующего минимально достоверному значению аналитического сигнала. ПО оказались равными 2,0 и 1,6 мкг/1 г соответственно. Пределы количественного определения (ПКО) имели соответственно величины 3,0 мкг/1 г и 2,4 мкг/1 г.

О характере локализации аналита в организме отравленных крыс можно судить по данным таблицы.

Результаты изучения распределения лерканидипина в организме теплокровных (крысы)

Из таблицы видно, что лерканидипин присутствовал как в органах, так и в крови отравленных особей. Наибольшие количества лерканидипина (мг в 100 г биоматериала) были обнаружены в содержимом желудка (198,183±29,541), желудке (195,312±21,579), тонком кишечнике (47,096±3,947), селезенке (38,952±3,532) и печени (26,211±2,232), несколько меньшие — в крови (9,801±0,488), сердце (9,728±0,700), почках (3,816±0,300), мышцах (3,748±0,359) и легких (0,928±0,110) отравленных животных.

Выводы

1. Изучена локализация лерканидипина у теплокровных (крысы) после введения им полулетальной (890 мг/кг) дозы токсиканта в водно-суспендированной форме.

2. Как изолирующий агент рекомендован ацетон. Извлечение лерканидипина из биоматриц проводилось двукратно по 30 мин при массовом отношении «ацетон/биоматериал» 2:1.

3. Для достижения эффективной очистки аналита применена колонка сорбента «Силасорб С-18». Идентификацию лерканидипина проводили методами ТСХ, спектрофотометрии и ГХ-МС. Для количественного определения предложены спектрофотометрические методики, валидированные по показателям линейности, правильности, прецизионности, стабильности.

4. Наибольшие количества (мг/100 г) лерканидипина обнаружены у крыс в содержимом желудка (198,183±29,541), желудке (195,312±21,579), тонком кишечнике (47,096±3,947), селезенке (38,952±3,532) и печени (26,211±2,232).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.