Введение
Производные 1,4-дигидропиридина — амлодипин, нифедипин, нимодипин и фелодипин — относятся к лекарственным средствам, которые влияют на внутриклеточную концентрацию кальция за счет изменения потока кальция через клеточные мембраны, воздействуют на различные внутриклеточные сигнальные процессы. В качестве блокаторов кальциевых каналов они давно и широко используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (эссенциальной гипертензии и стенокардии) [1, 2].
Лекарственные средства этой группы представляют собой белые (амлодипин), кремоватые (фелодипин) или желтые (нифедипин, нимодипин) порошки, мало растворимые в воде, хорошо растворимые в ацетонитриле, ацетоне, умеренно — в этаноле и метаноле [3, 4].
В отношении организмов человека и животных представители 1,4-дигидропиридина проявляют токсические свойства. Полулетальные дозы варьируют от 340 до 700 мг/кг [5, 6]. Для человека разовые терапевтические дозы, как правило, составляют 100—180 мкг/кг, летальные — в среднем 400—3500 мкг/кг [7—10].
Выбор для исследования этой группы соединений обусловлен их широким применением в медицинской практике для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, а также приводимыми в отечественных и зарубежных источниках научной литературы данными о многочисленных отравлениях блокаторами кальциевых каналов у людей, ряд из которых завершился летальным исходом. Согласно базе данных Американской ассоциации токсикологических центров, кардиотоксиканты представляют собой основную причину смерти, связанной с приемом лекарств. Летальные отравления блокаторами кальциевых каналов занимают 6-е место среди зарегистрированных смертельных случаев, связанных с приемом лекарств [3, 11—14].
В доступной литературе имеется относительно мало системной информации об особенностях определения в трупном материале представителей группы 1,4-дигидропиридина, включающей вопросы их изолирования, очистки, идентификации и оценки количественного содержания. В основном приводятся данные по определению этих веществ в лекарственных формах, плазме и моче [2, 15]. При летальных исходах вследствие приема нифедипина и амлодипина их концентрации в крови зафиксированы соответственно на уровне 0,27—0,669 и 0,78—3,40 мг/кг [16—18].
Цель работы — изучение особенностей определения производных 1,4-дигидропиридина в биологическом материале при химико-токсикологических исследованиях.
Материал и методы
Объектами исследования являлись лекарственные вещества из группы производных 1,4-бензодиазепина компании Sigma-Aldrich (США): амлодипин (2-[(2-аминоэтокси)-метил]-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидро-6-метил-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты 3-этил 5-метиловый эфир в виде безилата) (содержание 98% и более); нифедипин (1,4-дигидро-2,6-диметил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты диметиловый эфир) (≥97%); нимодипин (1-метилэтиловый эфир 2-метоксиэтил-1,4-дигидро-2,6-диметил-4-(3-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты) (≥97%); фелодипин (4-(2,3-Дихлорфенил)-1,4-дигидро-2,6-диметил-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты этилметиловый эфир) (≥97%).
В ходе проведения эксперимента изучали особенности извлечения производных 1,4-дигидропиридина из биоматериала 13 изолирующими жидкостями разной химической природы [19—21].
При этом в каждом случае модельную смесь того или иного определяемого соединения с мелкоизмельченной печенью (концентрация аналита 0,1%) выдерживали 1,5 ч при температуре 20—22 °C и проводили двукратное изолирование аналита, настаивая при соотношении изолирующего агента и биоматериала 2:1 по массе. Извлечения объединяли, часть объединенного извлечения хроматографировали на пластинках «Сорбфил» с ультрафиолетовым (УФ) индикатором. Хроматограммы детектировали, облучая их УФ-светом (254 нм). Аналит идентифицировали по величине Rf (отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному за это же время элюентом), совпадающей с таковой вещества-свидетеля, и элюировали из сорбента 95% этанолом. Исследовали поглощение элюата в УФ-части спектра (спектрофотометр «СФ-2000») и оценивали количество извлеченного вещества, используя уравнение градуировочного графика.
Оптимальный изолирующий агент определяли по наибольшему значению степени извлечения.
Моделируя первый этап очистки производных 1,4-дигидропиридина от эндогенных веществ биоматриц, исследовали экстракцию аналитов в молекулярной форме из гидрофильного (водно-ацетонитрильного) слоя рядом гидрофобных органических растворителей (гексан, толуол, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат).
При поиске возможностей дополнительной очистки исследуемых 1,4-дигидропиридинов исследовали характер их хроматографической активности в полупрепаративной (150×10 мм) колонке неподвижной фазы «Силасорб С-18» 30 мкм. Элюировали при обычном давлении индивидуальными органическими гидрофильными растворителями или их смесями с водой. Введение аналита в колонку происходило в виде 0,5% раствора в подвижной фазе (объем 2 мл). То или иное производное 1,4-дигидропиридина обнаруживали во фракциях элюата (объем каждой 2 мл) методом электронной спектрофотометрии, предварительно разбавив их в 20—100 раз элюентом.
Проводили исследование подвижности аналитов в тонком слое сорбента «СТХ 1-А» с УФ-индикатором (254 нм) на пластинах «Сорбфил». В качестве элюентов рассматривались двух- и трехкомпонентные комбинации органических растворителей, включающие компонент с полярностью 0,1—2,8 и один или два компонента с полярностью 3,9—6,0.
Исследовали характер хроматографической активности производных 1,4-дигидропиридина методом газожидкостной хроматографии (капиллярная колонка с активным жидким сорбентом; инертная газообразная подвижная фаза) и особенности масс-спектров аналитов с использованием хроматографа Agilent Technologies (США) модели 7890В GC System с масс-селективным детектором модели 5977А в условиях ионизации электронным ударом (70 эВ) и регистрации сигнала по полному ионному току [22].
Результаты и обсуждение
При сравнительном изолировании установлено, что оптимальным изолирующим агентом для извлечения производных 1,4-дигидропиридина из биоматериала является смесь ацетон-ацетонитрил (7,5:2,5). Значения степени извлечения амлодипина, нифедипина, нимодипина и фелодипина этой смесью составили соответственно 84,5±3,8, 87,3±4,5, 88,4±3,3 и 86,2±4,34%.
Оптимальными условиями изолирования смесью ацетон-ацетонитрил (7,5:2,5) являлось двукратное по 30 мин настаивание в режиме помешивания при соотношении масс изолирующего агента и биоматрицы 2:1.
Результаты изучения экстрагируемости рассматриваемых производных 1,4-дигидропиридина из водно-ацетонитрильных растворов показали, что переход нифедипина, нимодипина и фелодипина в гидрофобный экстрагент не зависит от pH гидрофильного слоя. Наилучшие условия перехода этих аналитов из гидрофильного слоя в гидрофобную органическую фазу в условиях равенства объемов контактирующих фаз (r=1) были достигнуты при экстракции этилацетатом (степень однократной экстракции — до 94,5% при pH 2—12 во всем указанном диапазоне). Экстрагируемость амлодипина зависела от pH гидрофильного слоя. Лучше всего вещество переходило в гидрофобную фазу при щелочных значениях pH гидрофильной фазы. При этом наибольшая степень однократной экстракции (r=1) достигалась этилацетатом (до 92,24%) при pH 8—12, где колебания значений составляют не более ±0,6%. Увеличить на 2—3% степень однократной экстракции производных 1,4-дигидропиридина из водно-ацетонитрильной среды этилацетатом удавалось, применяя высаливание растворимыми сульфатами и галогенидами.
Данные табл. 1 отражают результаты изучения особенностей хроматографирования производных 1,4-дигидропиридина в колонке сорбента «Силасорб С-18». На основе оценки полученных результатов в дальнейшем для очистки аналитов в полупрепаративной колонке применяли элюент ацетонитрил-вода (7:3) (Р′=7,12). Выбранная хроматографическая система обеспечивала элюирование амлодипина, нифедипина, нимодипина и фелодипина соответственно во фракциях 11—12 (21—24 мл), 7—9 (13—18 мл), 8—10 (15—20 мл), 9—11 (17—22 мл).
Таблица 1. Параметры хроматографирования производных 1,4-дигидропиридина в полупрепаративной (150×10 мм) колонке сорбента «Силасорб» С-18 30 мкм
| Доля модификатора, % | Рʹ | Амлодипин | Нифедипин | Нимодипин | Фелодипин | ||||||||
| VR, мл | kʹ | N | VR, мл | kʹ | N | VR, мл | kʹ | N | VR, мл | kʹ | N | ||
| Элюенты состава «ацетонитрил-вода» | |||||||||||||
| 100 | 5,80 | 10 | 0,67 | 177 | 8,5 | 0,42 | 268 | 9,0 | 0,57 | 246 | 11,0 | 0,83 | 336 |
| 90 | 6,24 | 11,2 | 0,87 | 321 | 8,9 | 0,48 | 294 | 9,4 | 0,53 | 256 | 11,2 | 0,87 | 415 |
| 80 | 6,68 | 13,4 | 1,23 | 593 | 9,4 | 0,57 | 462 | 9,6 | 0,60 | 304 | 13,4 | 1,23 | 498 |
| 75 | 6,90 | 17,6 | 1,93 | 1126 | 11,3 | 0,88 | 779 | 12,3 | 1,05 | 527 | 15,9 | 1,65 | 691 |
| 70 | 7,12 | 22,4 | 2,73 | 1389 | 15,4 | 1,57 | 963 | 17,6 | 1,93 | 793 | 19,0 | 2,17 | 1003 |
| 60 | 7,56 | 44,7 | 6,45 | 3572 | 24,8 | 3,13 | 2045 | 27,4 | 3,57 | 2724 | 39,0 | 5,50 | 3894 |
| Элюенты состава «ацетон-вода» | |||||||||||||
| 100 | 5,10 | 8,2 | 0,37 | 159 | 7,4 | 0,23 | 97 | 7,0 | 0,17 | 125 | 7,2 | 0,20 | 230 |
| 90 | 5,61 | 16,2 | 1,70 | 306 | 9,8 | 0,63 | 129 | 9,3 | 0,55 | 181 | 7,2 | 0,20 | 256 |
| 80 | 6,12 | 21,0 | 2,50 | 1329 | 13,1 | 1,18 | 171 | 12,0 | 1,00 | 225 | 9,0 | 0,50 | 358 |
| 70 | 6,63 | 29,1 | 3,83 | 3049 | 16,6 | 1,77 | 256 | 15,0 | 1,50 | 294 | 11,4 | 0,90 | 537 |
| 65 | 6,89 | 32,7 | 4,45 | 3883 | 20,5 | 2,42 | 372 | 22,6 | 2,77 | 630 | 12,3 | 1,05 | 719 |
| 60 | 7,14 | 35,0 | 4,83 | 4900 | 28,6 | 3,77 | 463 | 33,0 | 4,50 | 1418 | 13,0 | 1,17 | 936 |
| 50 | 7,65 | 63,5 | 9,58 | 6802 | 51,7 | 7,62 | 1653 | 54,9 | 8,15 | 3827 | 60,0 | 9,00 | 5625 |
Примечание. Рʹ — полярность элюента; VR — объем удерживания; kʹ — коэффициент емкости; N — число теоретических тарелок.
По результатам исследований методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) наиболее оптимальными подвижными фазами явились смеси растворителей гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1), этанол-гексан (7:3) и бутанол-ацетон (5:5). По критерию величины степени разделения аналитов для их идентификации целесообразно использование системы бутанол-ацетон (5:5).
Для воспроизведения процесса определения производных 1,4-дигидропиридина методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) был использован активный жидкий сорбент 5%-фенил-95%-диметилполисилоксан, тонким слоем (0,25 мкм) распределенный по внутренней поверхности колонки НР-5 ms Ultra inert (30000×0,25 мм), и инертная газообразная подвижная фаза — гелий, подаваемая со скоростью 1 мл/мин. Начиная с 70 °C, после выдерживания 2 мин температура колонки повышалась до 200 °C (скорость 40 °C/мин), затем — до 290 °C (скорость 12,5 °C/мин) и выдерживалась 2 мин. Температура инжектора составляла 250 °C, интерфейса детектора — 290 °C, квадруполя — 150 °C, объем вводимой пробы — 2 мкл. Результаты хроматографирования суммы рассматриваемых производных 1,4-дигидропиридина в предлагаемых условиях представлены на рис. 1. Хроматографические и спектральные характеристики стандартов рассматриваемых аналитов (определение ГХ-МС) отражены в табл. 2. Как можно видеть, предлагаемые условия позволяют полностью разделить все исследуемые соединения, обеспечивая селективное определение каждого из них в присутствии остальных методом ГХ-МС.
Рис. 1. Газо-жидкостная хроматограмма суммы стандартов производных 1,4-дигидропиридина.
1 — амлодипина; 2 — нифедипина; 3 — нимодипина; 4 — фелодипина.
Предлагаемая схема определения производных 1,4-дигидропиридина в биологическом материале
Изолирование. 25 г измельченной (дисперсность 0,2—0,4 см) биоматрицы (ткани печени) подвергают настаиванию в режиме периодического перемешивания со смесью ацетон-ацетонитрил (7,5:2,5) (50 г×2; время каждого настаивания — 30 мин). Жидкое извлечение фильтруют через Na2SO4 безводный, сформированный в виде слоя высотой 15—20 мм в стеклянном фильтре (радиус 20 мм), после чего промывают фильтр 20 г ацетона. Фильтраты соединяют, потом испаряют при 20—22 °C в токе воздуха.
Очистка экстракцией и колоночной хроматографией. После стадии испарения остаток обрабатывают 4 мл ацетонитрила, раствор разбавляют 16 мл буферного раствора с pH 10, затем насыщают хлоридом натрия и встряхивают 4 мин (частота — 30 встряхиваний в минуту) с 20 мл этилацетата. Экстрагирование этилацетатом повторяют, общий экстракт испаряют при 20—22 °C в токе воздуха.
Остаток, который получают после экстракции, растворяют в 2—3 мл смеси ацетонитрил-вода (7:3) и вводят в хроматографическую колонку сорбента «Силасорб С-18». Фракции (с 7 по 12 (13—24 мл)), в которых возможно нахождение производных 1,4-дигидропиридина, сливают в выпарительную чашку, а растворители испаряют, поместив чашку в поток воздуха комнатной (20—22 °C) температуры.
Прибавляя последовательно к полученному остатку по 2—3 мл ацетона, растворяют его, внося образующиеся растворы в мерную колбу на 10 мл, а затем доводят жидкость в ней до метки этим же растворителем.
В чашки А и Б помещают по 4 мл полученного раствора, ацетон испаряют, поместив чашки в поток воздуха комнатной (20—22 °C) температуры.
Идентификация методом ТСХ. Остаток из чашки А обрабатывают 0,2—0,3 мл трихлорметана и помещают на пластину «Сорбфил» с УФ-индикатором. Проводят определение, элюируя смесью бутанол-ацетон (5:5). Проявляют хроматограммы, облучая слой сорбента УФ-светом (λ=254 нм). Аналиты идентифицируют по значениям абсолютной хроматографической подвижности (Rf), совпадающим с Rf стандартов рассматриваемых производных 1,4-дигидропиридина (0,48±0,03 для амлодипина, 0,40±0,02 для нифедипина, 0,53±0,03 для нимодипина. 0,94±0,02 для фелодипина).
Идентификация методом ГХ-МС. Остаток из чашки Б растворяют в 25 мл трихлорметана (раствор №1). Затем 1 мл раствора №1 разбавляют до 10 мл трихлорметаном в мерной колбе (раствор №2). Далее 2 мкл последнего (№2) раствора (хроматографируемая проба) вводят в хроматограф и анализируют в соответствии с предложенными выше условиями. То или иное производное 1,4-дигидропиридина идентифицируют, оценивая время удерживания и характер масс-спектра.
Вид полученных при этом хроматограмм и масс-спектры производных 1,4-дигидропиридина, изолированных из биоматериала, представлены на рис. 2, 3.
Рис. 2. Газо-жидкостные хроматограммы выделенных из биоматериала производных 1,4-дигидропиридина.
а — амлодипина; б — нифедипина; в — нимодипина; г — фелодипина.
Рис. 3. Масс-спектры выделенных из биоматериала производных 1,4-дигидропиридина.
а — амлодипина; б — нифедипина; в — нимодипина; г — фелодипина.
Как следует из полученных результатов, значения времени удерживания выделенных из биоматрицы аналитов, а также соответствующие комплексы сигналов заряженных осколков в их масс-спектрах в целом совпадают с этими же характеристиками веществ-стандартов, приводимыми в табл. 2.
Таблица 2. Хроматографические и спектральные характеристики стандартов рассматриваемых аналитов при определении методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией
| Исследуемые соединения | tR | kʹ | N | H, мм | Характерные частицы в масс-спектрах, m/z |
| Амлодипин | 11,27 | 6,66 | 1515923 | 0,020 | 44, 77, 120, 148, 165, 208, 236, 254, 297, 347, 377 |
| Нимодипин | 11,70 | 6,96 | 277315 | 0,108 | 59, 106, 151, 196, 227, 254, 296, 359 |
| Нифедипин | 12,55 | 7,54 | 1112681 | 0,027 | 42, 77, 127, 168, 224, 254, 284, 329, 355 |
| Фелодипин | 13,73 | 8,34 | 169758 | 0,177 | 42, 67, 106, 150, 178, 210, 238, 280, 310, 338, 383 |
Примечание. tо=1,47
Количественное содержание каждого из производных 1,4-дигидропиридина определяют по площади пика, проводя расчеты с использованием соответствующего уравнения регрессии.
Результатом валидации разработанных на основе ГХ-МС методик по критерию линейности явился расчет уравнений регрессии, имеющих вид:
S=128171∙С+4677 (для амлодипина);
S=17461658∙С+359759 (для нифедипина);
S=5431450∙С−12401 (для нимодипина);
S=17131901∙С−22286 (для фелодипина).
Коэффициент корреляции во всех случаях превышал 0,997. Отклонения экспериментально найденного содержания аналитов в градуировочных смесях с биоматериалом от заданных концентраций соответствовали требованиям, принятым в области судебно-химического анализа [23, 24].
При оценке правильности и прецизионности методик в каждом случае подвергали исследованию по 3 модельных смеси биоматериала с аналитом, концентрации которого соответствовали нижнему, среднему и верхнему уровням рабочего диапазона.
Растворы, полученные в итоге пробоподготовки, хроматографировали по 5 раз в первый и последующий дни. Вычисленные на основе полученных результатов метрологические характеристики отражены в табл. 3.
Таблица 3. Оценка правильности и прецизионности методик определения производных 1,4-дигидропиридина в биоматериале
| Внесено вещества, мкг/г биоматериала | Определено вещества в 1-й день | Определено вещества в следующий день | ||
| метрология (n=5; p=0,95) | ε, % | метрология (n=5; p=0,95) | ε, % | |
| Амлодипин | ||||
| 2,4 | x‾=2,115; S=0,210; Sx‾=0,094; Δx‾=0,262; ε‾=12,36; Sr=9,94% | −11,35 | x‾=2,619; S=0,249; Sx‾ =0,111; Δx‾=0,309; ε‾=11,77; Sr=9,49% | 10,32 |
| 48 | x‾=55,212; S=2,848; Sx‾=1,273; Δx‾=3,540; ε‾=6,42; Sr=5,16% | 14,12 | x‾=49,982; S=2,886; Sx‾ =1,290; Δx‾=3,587; ε‾=7,15; Sr=5,77% | 2,56 |
| 96 | x‾=102,527; S=4,729; Sx‾ =2,115; Δx‾=5,876; ε‾=5,74; Sr=4,58% | 5,32 | x‾=102,584; S=4,443; Sx‾ =1,987; Δx‾=5,5233; ε‾=5,38; Sr=4,33% | 7,16 |
| Нифелипин | ||||
| 0,24 | x‾=0,260; S=0,026; Sx‾ =0,012; Δx‾=0,033; ε‾=12,52; Sr=10,09% | 4,55 | x‾=0,283; S=0,030; Sx‾ =0,013; Δx‾=0,037; ε‾=13,18; Sr=10,59% | 15,38 |
| 32 | x‾=36,223; S=2,087; Sx‾ =0,933; Δx‾=2,595; ε‾=7,15; Sr=5,76% | 12,28 | x‾=30,622; S=1,833; Sx‾ =0,820; Δx‾=2,279; ε‾=7,41; Sr=5,99% | -5,49 |
| 64 | x‾=70,396; S=3,206; Sx‾ =1,434; Δx‾=3,986; ε‾=5,67; Sr=4,55% | 9,76 | x‾=67,867; S=3,256; Sx‾ =1,456; Δx‾=4,048; ε‾=5,95; Sr=4,80% | 5,91 |
| Нимодипин | ||||
| 0,24 | x‾=0,237; S=0,018; Sx‾ =0,008; Δx‾=0,023; ε‾=9,48; Sr=7,65% | −3,97 | x‾=0,280; S=0,022; Sx‾ =0,010; Δx‾=0,028; ε‾=9,82; Sr=7,93% | 14,25 |
| 32 | x‾=35,575; S=1,548; Sx‾ =0,692; Δx‾ =1,924; ε‾=5,39; Sr=4,35% | 11,56 | x‾=34,654; S=1,585; Sx‾ =0,709; Δx‾=1,971; ε‾=5,71; Sr=4,58% | 7,32 |
| 64 | x‾=68,263; S=2,662; Sx‾=1,191; Δx‾=3,310; ε‾=4,84; Sr=3,90% | 6,13 | x‾=69,774; S=2,771; Sx‾ =1,239; Δx‾=3,445; ε‾=4,93; Sr=3,97% | 8,74 |
| Фелодипин | ||||
| 0,24 | x‾=0,267; S=0,021; Sx‾ =0,010; Δx‾=0,027; ε‾=9,96; Sr=8,01% | 8,3 | x‾=0,281; S=0,023; Sx‾ =0,011; Δx‾=0,029; ε‾=10,36; Sr=8,32 % | 14,29 |
| 32 | x‾=31,281; S=1,464; Sx‾=0,655; Δx‾=1,820; ε‾=5,83; Sr=4,68% | −1,86 | x‾=35,799; S=1,756; Sx‾ =0,785; Δx‾=2,183; ε‾=6,09; Sr=4,91% | 12,38 |
| 64 | x‾=69,902; S=2,781; Sx‾=1,244; Δx‾=3,458; ε‾=4,95; Sr=3,98% | 9,29 | x‾=66,638; S=2,791; Sx‾ =1,248; Δx‾=3,470; ε‾=5,23; Sr=4,19% | 3,54 |
Примечание. ε — относительная погрешность.
Как видно из табл. 3, для разработанных методик относительная погрешность (%) составляла от −11,35 до 15,38, стандартное отклонение — 0,018—4,729, относительное стандартное отклонение (%) — 3,90—10,59.
Установлено также соответствие разработанных методик критериям селективности и стабильности.
Значения предела обнаружения и предела количественного определения рассматриваемых производных 1,4-дигидропиридина предлагаемыми методиками не превышали соответственно 0,04—0,14 и 0,08—0,24 мг/г.
Заключение
Для изолирования производных 1,4-дигидропиридина из биоматериала наиболее целесообразно двукратное по 30 мин настаивание со смесью ацетон-ацетонитрил (7,5:2,5) при массовом отношении изолирующего агента и биоматрицы 2:1.
Достаточный уровень очистки аналитов достигается путем экстракции этилацетатом из водно-ацетонитрильной среды при pH 10 в условиях насыщения гидрофильного слоя хлоридом натрия и последующего хроматографирования в колонке (15×1 см) сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм (подвижная фаза — ацетонитрил-вода (7:3)).
Очищенные аналиты идентифицировали методами ТСХ и ГХ-МС. Для количественного определения производных 1,4-дигидропиридина применяли ГХ-МС. Предельно обнаруживаемые и количественно определяемые уровни содержания рассматриваемых веществ в биоматрице не превышали соответственно 0,04—0,14 и 0,08—0,24 мг/г.
Проведена валидация методик определения производных 1,4-дигидропиридина в биоматериале (модель — ткань печени), которая показала, что методики удовлетворяют критериям линейности, селективности, стабильности, правильности и прецизионности.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.