В настоящее время большое внимание исследователей привлечено к изучению водно-электролитных расстройств, прежде всего нарушений натриевого обмена, при хроническом гломерулонефрите (ХГН). Данная проблема приобретает особое значение в связи с полученными в эксперименте и клинических условиях данных о роли антидиуретического гормона (АДГ) - одного из важнейших показателей водно-натриевого обмена (ВНО) в формировании и прогрессировании поражения почек [1-3]. Однако исследование уровня АДГ в сыворотке крови является сложной задачей из-за его нестабильности и большой вариабельности концентрации в течение суток. Поэтому в широкую клиническую практику внедряется исследование суррогатного маркера АДГ копептина, который представляет собой С-концевой фрагмент предшественника молекулы вазопрессина, обладающий гораздо большей стабильностью. Выявлена тесная прямая корреляция между концентрацией АДГ и копептина независимо от осмолярности плазмы [4].

Двумя основными внутрипочечными эффектами АДГ являются активация экспрессии гена аквапорина-2 (AQP-2), ведущая к увеличению количества водных каналов на наружной мембране клеток собирательных трубочек, а также активация эпителиальных натриевых каналов в дистальных (ENaC) отделах нефрона, что приводит к повышению реабсорбции натрия [5-7].

Несмотря на то что белок аквапорин-2 (AQP-2) рассматривают как один из биомаркеров повреждения почек, уровень его экскреции с мочой у больных с протеинурическими формами ХГН не изучался в клинической практике. Имеются лишь единичные экспериментальные данные, свидетельствующие о значительном снижении экспрессии у животных гена AQP-2 при нефротическом синдроме (НС) вопреки увеличению уровня АДГ в сыворотке крови [8, 9].

К известным биомаркерам нарушения целостности почечной ткани относится также молекула повреждения почек 1-го типа (KIM-1). Определяют ее в моче у нефрологических больных в основном для диагностики острого повреждения почек (ОПП) [10, 11]. Однако оценка уровня KIM-1 при различных клинических формах ХГН не проводилась.

В связи с этим изучение концентрации копептина (как суррогатного маркера АДГ) в сыворотке крови наряду с исследованием двух других биологических маркеров - AQP-2 и KIM-1 у больных с активными нефротическими формами ХГН, характеризующимися выраженными нарушениями ВНО, важно с научной и практической точки зрения. Результаты исследования могут иметь значение в связи с появлением на фармакологическом рынке блокаторов почечных рецепторов АДГ и почечных эпителиальных натриевых каналов (ENaC).

В связи с изложенным целью исследования было определение характера и выраженности изменений определяемых в сыворотке крови и моче биомаркеров состояния ВНО у пациентов с протеинурическими формами ХГН, их значение для оценки активности и прогноза заболевания.

Обследовали 47 больных с ХГН: 19 (40%) женщин и 28 (60%) мужчин в возрасте от 17 до 62 лет (в среднем 38,1±13,9 года), наблюдавшихся в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева, УКБ №3, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России с 2011 по 2012 г. Среди 47 обследованных больных диагноз ХГН подтвержден морфологически у 27: у 6 выявлен мезангиопролиферативный гломерулонефрит, у 2 - мезангиокапиллярный гломерулонефрит, у 10 - мембранозный нефрит, у 7 - фокально-сегментарный гломерулосклероз, у 2 - нефрит с минимальными изменениями (по классификации В.В. Серова, 1980).

Результаты исследования биомаркеров сравнивали в 4 группах больных, различающихся по степени активности ХГН и функциональному состоянию почек.

В 1-ю группу вошли 10 больных с НС: отечный синдром различной степени выраженности и локализации, протеинурия, достигавшая в отдельных случаях 12-13 г/сут (в среднем 8,74±3,03 г/сут), гипоальбуминемия (24,17±3,95 г/л), гипертриглицеридемия (4,47±1,99 мг/л). Кроме того, наряду с активным НС критерием включения в 1-ю группу служило прогрессирующее снижение функции почек: у всех больных отмечались повышение уровня креатинина в сыворотке крови (с 1,3 до 2,44 мг/дл, в среднем 1,75±1,45 мг/дл), а также снижение расчетной скорости клубочковой фильтрации - СКФ (с 29 до 66 мл/мин, среднее 45,5±14,04 мл/мин по формуле MDRD).

Во 2-ю группу вошли 16 больных с сохраняющимся НС и нормальной функцией почек: суточная протеинурия - СПУ (8,4±4,93 г/сут), гипоальбуминемия (24,81±4,88 г/л), гипертриглицеридемия (3,8±2,02 мг/л), креатинин (0,67±0,12 мг/дл), расчетная СКФ более 90 мл/мин по формуле MDRD.

В 3-ю группу объединены 10 пациентов с частичной ремиссией НС: отсутствовали отеки, протеинурия была менее 3 г/сут, однако при этом сохранялась на уровне более 1 г/сут (в среднем 2,08±0,86 г/сут), концентрация в сыворотке крови альбумина и креатинина в пределах нормы.

В 4-ю группу вошли 11 пациентов с гематурической формой ХГН в стадии активности (протеинурия 0,79±0,99 г/сут, эритроциты от 8000 до 200 000 в 1 мл в моче по Нечипоренко).

Контрольную группу составили 9 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с больными ХГН: 3 мужчин и 6 женщин в возрасте от 22 до 62 лет (средний 45,9±14,5 года).

Клинические анализы крови, мочи, исследование СПУ, биохимическое исследование крови и мочи с определением уровня креатинина, общего белка, альбумина, показателей липидного обмена, электролитов и др. проводили в межклинической биохимической лаборатории ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, СКФ рассчитывали по формуле MDRD.

У всех пациентов с ХГН и здоровых лиц исследовали концентрацию копептина в плазме крови, а также уровень экскреции с мочой AQP-2 и KIM-1. Плазму получали путем центрифугирования крови, взятой утром натощак в пробирки с ЭДТА, после чего замораживали при –70 °С. Утреннюю мочу (10-20 мл) собирали в сухие пластиковые пробирки, центрифугировали для удаления клеток мочевого осадка и замораживали до исследования при температуре –70 °С. В исследование не включали пациентов с признаками активной мочевой инфекции и сопутствующим сахарным диабетом. Уровень копептина в сыворотке крови, а также экскреции AQP-2 и KIM-1 с мочой исследовали методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерчески доступных наборов.

Статистический анализ полученных данных проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6,0 и SPSS 11.5. На основании критериев Шапиро-Вилка и &khgr;² Пирсона оценивали нормальное распределение исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Манна-Уитни или критерий Крускала-Уоллиса. Критический уровень значимости для всех статистических данных принимали равным 0,05. При анализе данных определяли медиану, разброс величин по отношению к медиане по показателю интерквартильного размаха (25-й процентиль; 75-й процентиль). Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена.

Концентрация копептина в сыворотке крови у больных ХГН характеризовалась большой вариабельностью - от 7,58 до 0,73 нг/мл. Она была достоверно выше в группах больных с НС с нарушением и без нарушения функции почек - соответственно 3,83 (1,03; 5,22) и 3,62 (2,20; 4,70) нг/мл, чем у больных с частичной ремиссией НС, гематурической формой ХГН и контрольной группой (p<0,05). Причем у больных с гематурической формой ХГН этот показатель практически не отличался от такового в контрольной группе. Несмотря на более высокую среднюю концентрацию копептина в группе пациентов с частичной ремиссией НС - 2,36 (1,08; 3,11) нг/мл, различия с двумя указанными группами - больными с гематурической формой ХГН и контролем оказались статистически незначимыми - 0,99 (0,90; 2,62) и 0,95 (0,85; 2,44) нг/мл соответственно (p>0,05) (см. рисунок, а).

Уровень экскреции аквапорина-2 с мочой достоверно не различался и был наименьшим в 3 группах пациентов с НС - 0,035 (0,01; 0,08), 0,03 (0,01; 0,06) и 0,035 (0,01; 0,08) нг/мл соответственно у пациентов с НС и сниженной функцией почек, НС со стабильной функцией почек и частичной ремиссией НС (p>0,05). Концентрация AQP-2 в моче у больных ХГН гематурического типа была выше, чем у больных с НС, независимо от наличия признаков нарушения функции почек (p<0,001), и больных с частичной ремиссией НС (p<0,05). При этом экскреция AQP-2 у больных ХГН гематурического типа была в среднем достоверно меньше, чем в контрольной группе, - 0,21 (0,12; 0,49) и 0,41 (0,38-0,58) нг/мл соответственно (p<0,05) (см. рисунок, б).

При анализе динамики экскреции с мочой KIM-1 самые высокие значения получены в группе больных с НС и снижением функции почек - 9,52 (3,45; 10,10) нг/мл. В то же время у больных с НС и стабильной функцией почек, как и у пациентов с частичной ремиссией НС, экскреция KIM-1 была достоверно ниже - 2,29 (1,54; 7,24) и 2,06 (1,51; 3,21) нг/мл соответственно (p<0,05). Наименьшие значения получены в группе больных ХГН гематурического типа и контрольной группе, однако различия между этими группами статистически незначимы - 0,96 (0,5; 2,37) и 0,35 (0,24; 1,59) нг/мл соответственно. Группы больных с НС с сохраненной функцией почек, частичной ремиссией НС и ХГН гематурического типа достоверно не различались между собой по средним уровням KIM-1 в моче. При этом все группы пациентов с протеинурическими формами ХГН статистически значимо отличались по уровням мочевой экскреции KIM-1 от контрольной группы (p<0,05) (см. рисунок, в).

Выявлена обратная корреляция между уровнем копептина в сыворотке крови и концентрацией AQP-2 в моче (Rs=–0,43; p<0,001) в отсутствие достоверной прямой корреляции между концентрацией копептина в сыворотке крови и экскрецией с мочой KIM-1 (Rs=0,21; p=0,056). В то же время установлена обратная корреляция экскреции с мочой AQP-2 и экскрецией KIM-1 (Rs=–0,37; p<0,05).

Пациенты ХГН с НС представляют особую группу прежде всего с наиболее выраженными нарушениями ВНО. До настоящего времени состояние наполнения артериального русла и патогенез задержки натрия и воды почками у больных ХГН с НС не до конца изучены. Для объяснения механизмов формирования нефротических отеков предложены две различные теории [12]. Теория малого заполнения (underfill) характеризуется следующим: протеинурия приводит к гипоальбуминемии и снижению онкотического давления, выходу жидкости из внутрисосудистого в интерстициальное пространство с формированием отеков, уменьшению объема циркулирующей крови с последующей активацией симпатической части вегетативной нервной системы и ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС). Гиповолемия также может вносить вклад в снижение СКФ. Доказательством в пользу указанной теории служит то, что объем циркулирующей крови (ОЦК) достоверно снижен у 1/3 пациентов с НС [13]. Противопоставлением представленной «классической» теории формирования отеков при НС является подтвержденный факт того, что у многих пациентов с НС, а также с задержкой жидкости и натрия выявлено увеличение ОЦК [12]. При этом у пациентов данной популяции уровни основных маркеров РААС остаются в пределах нормы и даже снижены. У таких больных ведущее значение имеют теория переполнения (overfill) и повышенная реабсорбция натрия и воды обусловленная первичными нарушениями функции почек [14, 15].

Таким образом, механизмы задержки натрия при НС оставались до недавнего времени не вполне ясными, однако последние исследования показали, что в качестве одного из основных механизмов усиления реабсорбции натрия в почке может выступать внутриканальцевая активация плазминогена, попадающего в мочу при повреждении почечного фильтра. Продукт его деградации - плазмин, способен связываться с ENaC, вызывая их протеолитическую активацию, которая приводит к усилению реабсорбции натрия [16].

Описанные нарушения ВНО при НС обусловливают активацию выработки АДГ. В нашем исследовании значение концентрации копептина в сыворотке крови как суррогатного маркера АДГ статистически значимо выше у больных с протеинурическими формами ХГН. Наиболее высокая концентрация копептина в сыворотке крови зарегистрирована в группе пациентов с НС и сниженной функцией почек, что соответствует высокому уровню стимуляции выработки АДГ в ответ на усугубление нарушений ВНО у таких больных. Снижение активности ХГН со снижением выраженности НС сопровождалось уменьшением степени нарушений ВНО и достоверным снижением уровня копептина в сыворотке крови, что коррелировало с клиническими данными. У пациентов с активным гематурическим ХГН уровень копептина был значительно ниже и достоверно не отличался от такового у здоровых лиц. Выявленное нами различие может использоваться в дифференциальном диагнозе обсуждаемых форм ХГН - нефротической и активной гематурической, что особенно важно для гематурической формы, при которой клинические критерии активности не столь очевидны, как при нефротической.

При сравнении результатов исследования в группах экскреции с мочой AQP-2 установлено, что его уровень у пациентов с ХГН с НС достоверно ниже, чем у пациентов с гематурической формой ХГН. Максимальные уровни AQP-2 в моче зарегистрированы у здоровых лиц. Отмечена обратная корреляция между уровнем копептина в сыворотке крови и концентрацией AQP-2 в моче. По данным литературы, подобный характер изменений этих показателей отмечался ранее в экспериментальных исследованиях на животных, но однозначного объяснения не получил [8, 9]. По-видимому, экспрессия гена AQP-2 подавляется в ответ на локальные (на уровне мозгового вещества почки) выраженные нарушения реологии в перитубулярных капиллярах и осмотического давления в интерстициальной ткани. Поскольку в нашем исследовании уровень AQP-2 в моче у больных с НС повышался по мере уменьшения активности ХГН, приближаясь к таковым у здоровых лиц, то правомочно предположить существование компенсаторного механизма «ускользания» почки от избыточной активации АДГ при НС. В противном случае увеличение количества водных каналов (AQP-2) с задержкой жидкости почкой происходило бы еще активнее, приводя к усугублению гидратации организма. В отличие от больных с нефротическими формами ХГН у больных с активной гематурической формой ХГН уровень экскреции с мочой AQP-2 сопоставим с таковым у здоровых лиц. Выявление внутринозологических особенностей экспрессии AQP-2 с мочой обосновывает возможность использования этого показателя для дифференциального диагноза протеинурических и гематурических форм ХГН. Последнее наблюдение подчеркивает нозологические различия между протеинурическими и гематурическими формами ХГН.

Кроме определения степени дизрегуляции ВНО в данном исследовании удалось объективизировать активность нефротических форм ХГН на основании оценки уровня экскреции с мочой KIM-1: максимальное увеличение концентрации KIM-1 в моче у пациентов с НС и сниженной СКФ и, наоборот, уменьшение концентрации у больных с меньшей активностью ХГН указывает на возможность применения этого показателя как одного из критериев активности НС. Отмеченная нами обратная корреляция между уровнем экскреции с мочой KIM-1 и AQP-2 нуждается в уточнении - в настоящее время это представляется в большей степени отражением независимых процессов, хотя и характеризует выраженность повреждения почек в целом.

В нашем исследовании впервые предпринята попытка выяснить значение уровня АДГ в сыворотке крови и экскреции с мочой AQP-2 при НС не в эксперименте, а в клинических условиях. Уровень копептина (как суррогатного маркера АДГ) в сыворотке крови, а также уровень секреции с мочой AQP-2 могут быть использованы для определения активности ХГН с НС и оценки эффективности лечения. Такое же практическое значение может иметь определение уровня экскреции с мочой KIM-1 у пациентов с НС. Представляется практически значимой возможность использования уровней копептина, AQP-2 и KIM-1 в качестве критерия для дифференциальной диагностики гематурической формы ХГН.