АГ — артериальная гипертония

ГУ — гематурия

ДАД — диастолическое артериальное давление

НС — нефротический синдром

ОПП — острое повреждение почек

ПУ — протеинурия

САД — систолическое артериальное давление

СКФ — скорость клубочковой фильтрации

СОЭ — скорость оседания эритроцитов

СПУ — суточная протеинурия

СРБ — С-реактивный белок

ТИФ — тубулоинтерстициальный фиброз

ХБП — хроническая болезнь почек

ХГН — хронический гломерулонефрит

KIM-1 — молекула повреждения почек 1-го типа

Проблема активности/прогрессирования хронического гломерулонефрита (ХГН) остается одной из актуальных задач современной нефрологии. Наряду с традиционно используемыми клиническими показателями активности ХГН, среди которых по-прежнему одно из ведущих мест отводят нефротическому синдрому — НС (Н.А. Мухин и соавт., 2009; L. Raij и соавт., 1995), интенсивно ведутся поиски новых высокоспецифичных биомаркеров, появление которых в сыворотке крови и моче больных отражает лежащие в основе активности ХГН локально-почечные иммуновоспалительные механизмы.

В последние годы уже не вызывает сомнения, что клетки почечного канальцевого эпителия выполняют не только их основную функцию реабсорбции натрия и воды, но и участвуют в формировании воспалительного ответа при повреждении почки и через сеть цитокиновых реакций — в развитии тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ). К настоящему времени появилась возможность исследовать многие субстанции, синтезируемые канальцевыми эпителиоцитами, в частности молекулу повреждения почек 1-го типа — KIM-1.

KIM-1 — трансмембранный структурный гликопротеин эпителиальных клеток проксимальных канальцев почек, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, в большом количестве начинает экспрессироваться пролиферирующим эпителием проксимальных почечных канальцев после острого ишемического или токсического повреждения, что подтверждается результатами иммуногистохимических исследований ткани почек крыс и человека [1]. Разработка чувствительных лабораторных методик определения концентрации КIM-1 в моче открыла путь для широкого исследования этого биомаркера при остром повреждении почек (ОПП) разной этиологии [2], при этом выявлена прямая корреляция между тканевой экспрессией KIM-1 в почке и его концентрацией в моче [3]. Показано, что уровень экскреции KIM-1 с мочой может быть использован для оценки прогноза почечной выживаемости после ОПП [4].

Недавние исследования [1, 4] подтвердили значение этой молекулы не только как маркера селективного повреждения проксимального отдела почечных канальцев, но и как фактора, играющего активную патогенетическую роль в этом повреждении. В частности, показано участие KIM-1 в удалении погибших апоптотических клеток эпителием проксимальных почечных канальцев, подобно интерстициальным макрофагам, распознающим фосфатидилсерин на поверхности подвергшихся апоптозу клеток. Так, установлено, что выжившие после ОПП эпителиальные клетки фагоцитируют образовавшийся в процессе апоптоза клеточный детрит пропорционально величине экспрессии KIM-1 в канальцах [5]. Кроме того, подтверждены ранее полученные данные о том, что KIM-1 сам является рецептором для фосфатидилсерина, стимулируя фагоцитоз. На этом основании сделан вывод о ведущей роли KIM-1 в регулировании процессов удаления поврежденных клеток с поверхности базальной мембраны почечного эпителия при ОПП.

Исследования экспрессии KIM-1 проводились не только при ОПП, но и при хронической болезни почек (ХБП) [5—9], причем максимальная экспрессия KIM-1 отмечена в участках фиброза и воспаления паренхимы почек [1].

В исследовании [10] с использованием специально выведенной линии мышей, у которых экспрессия KIM-1 стойко повышена с рождения в отсутствии ишемических и токсических повреждающих факторов, предпринята попытка оценить роль длительной гиперпродукции KIM-1 при ХБП. Результатом постоянной гиперпродукции молекулы KIM-1 стало развитие хронического воспаления с исходом в ТИФ, что сопровождалось повышенной выработкой моноцитарного хемотаксического пептида 1-го типа (MCP-1). Кроме того, с учетом данных о роли KIM-1 в выработке провоспалительных цитокинов в ходе этого исследования оценена экспрессия в тканях почки интерлейкина-6 (IL-6) и трансформирующий β-фактор роста (TGF-β) и выявлено значительно более высокое содержание этих цитокинов в тубулоинтерстициальной ткани по сравнению с контролем. При этом тканевая экспрессия TGF-β, являющегося ключевым фактором фиброгенеза в почке, тесно коррелировала с уровнем МСР-1 в интерстициальной ткани почки [11]. Таким образом, в результате этих работ установлена связь между хронической гиперпродукцией KIM-1 клетками эпителия почечных канальцев и интерстициальным воспалением, завершающимся фиброзом. Предполагают, что путем сложных паракринных межклеточных взаимодействий трансформированные в миофибробласты канальцевые эпителиоциты мигрируют в интерстициальную ткань почки, где участвуют в каскаде клеточно-воспалительных реакций, приводящих к дальнейшему повреждению тубулоинтерстициального аппарата почки и потере его функции [10].

Если ранняя экспрессия молекулы KIM-1 может рассматриваться как адаптивный механизм, позволяющий восстановить функцию канальцев путем удаления погибших клеток, то продолженная гиперпродукция KIM-1 является неотъемлемым звеном хронического воспаления и фиброза в тубулоинтерстициальной ткани.

С учетом установленной в эксперименте роли KIM-1 в сложных механизмах интерстициального воспаления и фиброгенеза в почке, представляет интерес ее изучение в клинических условиях при ХГН.

Цель исследования — оценка уровня экскреции с мочой KIM-1 в группах больных ХГН, различающихся по степени клинической активности, а также возможности использования KIM-1 как критерия прогноза течения ХГН.

Обследовали 47 больных ХГН: 19 (40%) женщин и 28 (60%) мужчин в возрасте от 17 до 62 лет (в среднем 38,1±13,96 года), наблюдавшихся в Клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева, УКБ № 3, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России с 2011 по 2013 г. Критериями исключения из исследования служили признаки активной мочевой инфекции, сопутствующий сахарный диабет, тяжелая артериальная гипертония (АГ), ожирение (индекс массы тела >30 кг/м²), вирусные гепатиты, системные заболевания.

Клиническое обследование больных проводили по принятому в нефрологическом отделении плану. Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) оценивали по клиренсу эндогенного креатинина (проба Реберга—Тареева) и расчетной формуле MDRD. Ультразвуковое исследование почек с оценкой размеров и толщины паренхимы, а также другие инструментальные исследования проводили на базе Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева. Биопсийный материал почки изучен проф. В.А. Варшавским на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России.

Среди 47 обследованных больных ХГН диагноз подтвержден морфологически у 27: у 10 выявлен мембранозный гломерулонефрит, у 7 — фокально-сегментарный гломерулосклероз, у 2 — мезангиокапиллярный гломерулонефрит, у 6 — мезангиопролиферативный гломерулонефрит, у 2 — нефрит с минимальными изменениями (по классификации В.В. Серова, 1980).

Результаты исследования биомаркеров оценивали в 4 группах больных ХГН, различающихся по клинической картине и степени активности заболевания, но сопоставимых между собой и группой контроля по полу и возрасту (табл. 1).

В 1-ю группу вошли 10 больных высокоактивным ХГН с НС, имеющих отечный синдром различной степени выраженности и локализации, протеинурию (ПУ), достигающую в отдельных случаях 12—13 г/сут (в среднем 8,74±3,03 г/сут), гипоальбуминемию, гипертриглицеридемию, умеренную эритроцитурию. Кроме того, наряду с активным НС критерием включения в 1-ю группу явилось снижение функции почек. У всех больных уровень креатинина в сыворотке составлял в среднем 1,75±1,45 мг/дл (от 1,3 до 2,44 мг/дл). Почечная недостаточность не была проявлением ХПН (сморщенная почка), а в сочетании с НС, повышенным уровнем острофазовых показателей (скорость оседания эритроцитов — СОЭ, С-реактивный белок — СРБ, фибриноген) расценивалась нами как признак высокой активности ХГН, имея у ряда больных преходящий характер. У больных 1-й группы наблюдалась АГ — САД 149,4±7 мм рт.ст. (от 135 до 160 мм рт.ст.), ДАД 108,6±7 мм рт.ст. (от 100 до 115 мм рт.ст.).

Во 2-ю группу включили 16 больных с НС и нормальной функцией почек: СПУ составляла 8,4±4,93 г/сут, эритроцитурия по методу Нечипоренко не превышала 5000 в 1 мл. Наблюдалась гипоальбуминемия, гипертриглицеридемия, при нормальном уровне креатинина в сыворотке крови (0,67±0,12 мг/дл). У пациентов 2-й группы САД составил 133,7±5 мм рт.ст. (от 120 до 150 мм рт.ст.), ДАД 85,5±4 мм рт.ст. (от 75 до 95 мм рт.ст.).

В 3-ю группу объединили 10 пациентов с частичной ремиссией НС: к моменту исследования отсутствовали отеки, сохранялась ПУ субнефротического уровня (2,08±0,86 г/сут), число эритроцитов в анализе мочи по Нечипоренко не превышало 8000 в 1 мл. Концентрация в сыворотке крови альбумина и креатинина находилась в пределах нормы. Отсутствовала А.Г. (САД 115,6±4 мм рт.ст., ДАД 74,5±6 мм рт.ст.).

В 4-ю группу включены 11 пациентов ХГН, клинически характеризующегося гематурией — ГУ (количество эритроцитов 80 000±25 000 в 1 мл мочи по Нечипоренко), умеренной ПУ, при нормальной концентрации в сыворотке альбумина и креатинина. У пациентов 4-й группы САД составляло 130,2±5 (от 117 до 145) мм рт.ст., ДАД — 82,5±6 (от 70 до 90) мм рт.ст.

Длительность нефрита во всех группах была сопоставимой — в среднем 1—1,5 года.

Контрольная группа состояла из 9 здоровых лиц, 3 мужчин и 6 женщин от 22 до 62 лет (средний возраст 45,9±14,49 года).

Как один из критериев активности воспаления оценен уровень в сыворотке крови острофазового белка фибриногена, который был повышен во всех группах больных, в том числе с ведущим симптомом Г.У. Наиболее высокий в нашем наблюдении уровень фибриногена выявлен у больных с НС (1-я и 2-я группы): соответственно 6,79±2,21 и 5,82±1,68 г/л, что статистически значимо выше (p<0,05), чем у больных 3-й и 4-й групп (соответственно 3,86±1,63 и 4,68±1,44 г/л) и в контроле (2,71±0,78 г/л).

В качестве дополнительного параметра, оценивающего фильтрационную функцию почек, использован уровень цистатина С в сыворотке. Выявлены сопоставимое с уровнем в сыворотке креатинина распределение этого показателя у больных ХГН и нормальный уровень обоих показателей в контрольной группе (табл. 2).

У 30 больных, поступивших по поводу обострения ХГН, обследование и взятие образцов крови и мочи для исследования биомаркеров проводили до начала активной иммуносупрессивной терапии и лечения диуретиками, у некоторых из них также повторно на разных сроках проведения этой терапии. У отдельных больных, обычно имеющих неполную ремиссию НС, биомаркеры исследовали на фоне ранее начатой иммуносупрессивной терапии. В лечении использовали современные стандартные схемы, включавшие преднизолон внутрь или внутривенно и/или циклофосфан внутривенно, а также циклоспорин, А и менее часто препараты микофеноловой кислоты.

У всех пациентов с ХГН и у здоровых лиц исследовали уровень экскреции с мочой KIM-1. С этой целью 10—20 мл утренней мочи собирали в сухие пластиковые пробирки, центрифугировали для удаления клеток мочевого осадка и замораживали до накопления необходимого количества проб при температуре –70 °С. Исследование проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA). Для определения KIM-1 в моче использовали систему Human TIM-1 Immuoassay («R&D Systems Inc», США; Кат. №DKM100, лот № 305381). Результаты оценивали по интенсивности окрашивания исследуемых образцов мочи при длине волны 450 нм. Уровень KIM-1 рассчитывали путем построения калибровочной логарифмической кривой с помощью программы Statistica 6.0.

Статистический анализ полученных данных проведен с применением пакета прикладных программ Exel, Statistica 6,0 и SPSS 11.5. Рассчитывали средние показатели и стандартное отклонение. На основании критериев Шапиро—Вилка и χ² Пирсона оценено нормальное распределение исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Манна—Уитни или критерий Крускала—Уоллиса. Критический уровень значимости для всех статистических данных принимали равным 0,05. При анализе результатов исследования биоматериалов определяли медиану, разброс величин по отношению к медиане по показателю межквартильного размаха (25-й и 75-й процентили). Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена. Прогностическое значение концентрации молекулы KIM-1 оценивали при помощи построения ROC- кривой.

Уровень KIM-1 в моче больных у больных ХГН в среднем был значительно выше, чем у здоровых людей, — 2,37 (1,54; 7,32) и 0,35 (0,245−1,545) нг/л соответственно (р<0,0001) (рис. 1).

У больных с преимущественно протеинурическими формами (1-я и 2-я группы) уровень экскреции KIM-1 был статистически значимо выше, чем у больных ХГН c ГУ (4-я группа), соответственно 3,085 (1,855; 8,52) и 0,96 (0,518; 2,362) нг/мл (р=0,01) (табл. 3).

Самые высокие значения получены нами в группе больных с НС и дисфункцией почек — 9,52 (3,45; 10,10) нг/мл. Статистически значимо меньшие значения в нашем наблюдении отмечены у больных с ГУ (4-я группа) — 0,96 (0,5; 2,37) нг/мл и в контроле — 0,35 (0,24; 1,59) нг/мл, но различия между этими группами оказались статистически незначимыми (р>0,05).

Больные с НС и сохранной функцией почек (2-я и 3-я группы) занимали промежуточное положение по уровню экскреции KIM-1, различия между группой пациентов с частичной ремиссией НС (3-я группа) и группой пациентов с ГУ (4-я группа) статистически незначимой.

При этом все 3 группы пациентов с протеинурическими формами ХГН статистически значимо отличались по уровням мочевой экскреции KIM-1 от контрольной группы (р<0,05) (см. табл. 3; рис. 2).

У больных ХГН установлена сильная обратная корреляция уровня мочевой экскреции KIM-1 с уровнем альбумина в сыворотке крови (Rs= –0,54; р=0,001) и сильная прямая корреляция с СПУ (Rs=0,62; р=0,001) (рис. 3, а, б).

Кроме того, отмечена статистически значимая корреляция между уровнем KIM-1 в моче и общего холестерина в сыворотке (Rs=0,50; р=0,0001), а также статистически значимая корреляция между концентрацией KIM-1 в моче и уровнем фибриногена в сыворотке (Rs=0,40; р=0,002) (см. рис. 3, в, г) и сильная корреляция между концентрацией KIM-1 в моче и цистатина С в сыворотке крови (Rs=0,42; р=0,001), при этом корреляции с уровнем креатинина в сыворотке не выявлено, что является дополнительным аргументом в пользу исследования цистатина С у пациентов с протеинурическими формами ХГН.

На основании результатов корреляционного анализа связи между экскрецией KIM-1 у больных с протеинурическими формами ХГН, выраженностью белковой дискразии сыворотки крови и высоким уровнем СПУ мы оценили значение определения этого мочевого биомаркера как фактора риска персистирования/рефрактерности Н.С. Из 47 больных ХГН нами отобраны 23 больных с активными протеинурическими формами ХГН, получавших примерно одинаковую стандартную медикаментозную терапию, у которых можно проследить динамику ПУ в последующие 1—1,5 года. У 15 больных подгруппы, А с сохранением первоначально высокой ПУ, которая нами обозначена условно как «с ухудшением», уровень экскреции KIM-1 был в среднем в 2,5 раза выше, чем у 7 больных подгруппы Б «с улучшением» — уменьшением величины СПУ более чем на 50% от первоначальной и нормализацией белковых фракций крови.

С учетом этих результатов мы построили ROC-кривую для определения значения высокого уровня экскреции KIM-1 в оценке прогноза ХГН по критерию персистенции/рефрактерности Н.С. Площадь под кривой (AUC) составила 0,844. Концентрация KIM-1 больше 2,34 нг/мл с чувствительностью 86,67% и специфичностью 83,33% позволяет прогнозировать персистенцию высокой ПУ у больных с активными прогрессирующими протеинурическими формами ХГН (рис. 4).

У всех обследуемых больных с протеинурическими формами ХГН наблюдается статистически значимое повышение экскреции с мочой КIM-1, особенно выраженное у больных с сочетанием НС и дисфункции почек. При этом отмечается сильная прямая корреляция уровня экскреции КIM-1 с СПУ, концентрацией в сыворотке крови цистатина С и фибриногена, обратная — с уровнем альбумина в сыворотке. В то же время различия по концентрации KIM-1 между группой больных ХГН с ГУ и контролем оказались статистически незначимыми.

Наличие статистически значимой сильной корреляции между клинической тяжестью НС и уровнем экскреции KIM-1 с мочой у больных ХГН обосновывает использование этого мочевого биомаркера для неинвазивной оценки активности/прогрессирования ХГН. На основании построения ROC-кривой уровень экскреции с мочой KIM-1 2,34 нг/мл и более (площадь под кривой 0,83) позволяет прогнозировать с чувствительностью 86,7% и специфичностью 83,3% персистирующий характер НС и его рефрактерность к проводимой иммуносупрессивной терапии.

Полученные данные имеют значение прежде всего с точки зрения перспективы применения этого неинвазивного теста с целью определения прогноза течения НС и своевременной коррекции терапии. Кроме того, результаты исследования обосновывают поиск путей фармакологической блокады выработки KIM-1 в почке для оптимизации методов патогенетического воздействия на прогрессирование ХГН.

Конфликт интересов отсутствует.