Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) — заболевание, приводящее к стойкому снижению зрения и инвалидизации лиц старшей возрастной группы. На сегодняшний день на территории Европы ВМД занимает первое место среди причин необратимой слепоты и слабовидения [7]. В основе заболевания лежит поражение хориокапилляров, мембраны Бруха и ретинального пигментного эпителия, приводящее к необратимым изменениям в сетчатке. Наиболее часто (90%) ВМД представлена сухой формой, которая проявляется образованием макулярных друз или дефектов ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Экссудативная форма, в основе которой лежит образование хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) субретинальной неоваскулярной мембраны (СНМ), формируется только в 10% случаев, однако именно она приводит к быстрому и необратимому снижению остроты зрения [1, 6]. Сложные патогенетические механизмы развития заболевания до сих пор не раскрыты; на протяжении многих лет происходит эволюция подходов к лечению экссудативной ВМД [2—4]. В последние годы основным методом лечения является интравитреальное введение ранибизумаба. Его эффективность была доказана многочисленными мультицентровыми рандомизированными исследованиями (ANCHOR, MARINA, FOCUS, PIER, SUSTAIN, SUMMIT) [8, 13]. Однако терапевтический ответ непредсказуем и различен.

Фармакогенетика — это дисциплина, изучающая взаимодействие генотипа и фенотипа с целью объяснить различия ответа пациентов на лечение. Основными задачами фармакогенетики являются определение генетических вариантов, влияющих на эффективность лечения, выделение пациентов, лучше отвечающих на терапию, и максимальное устранение побочных эффектов. Известно, что существуют мультифакторные заболевания (например, сахарный диабет, гипертония), в развитии которых важную роль играют как генетические факторы, так и окружающая среда. ВМД тоже относится к мультифакторным заболеваниям с неустановленной этиологией. Применение лекарственного средства можно условно считать экзогенным воздействием. Таким образом, логично предположить, что ответ на лечение тем или иным препаратом будет варьировать в зависимости от индивидуальных генетических особенностей пациента. Эта гипотеза была не раз подтверждена исследователями на примере различных лекарственных препаратов.

Первой работой по данной проблеме стало проведенное в США ретроспективное исследование с участием 86 пациентов, получавших лечение бевацизумабом. Больным проводили инъекции препарата каждые 6 нед до достижения состояния неактивности СНМ, а также генотипирование по полиморфизмам CFH Y402H и ARMS2 A69S. У 53,7% пациентов с генотипом CFH YY и YН по полиморфизму CFH Y402H отмечали улучшение остроты зрения, тогда как у пациентов с генотипом CFH НН повышение остроты зрения наблюдали лишь в 10,5% случаев (р=0,004). По гену ARMS2 статистически достоверных различий выявлено не было [5].

В аналогичном ретроспективном исследовании с участием 156 пациентов, получавших ранибизумаб pro re nata (по потребности), была показана связь между наличием полиморфизмов CFH Y402H и количеством потребовавшихся инъекций. В течение

9 мес пациентам, носителям полиморфизмов YY, YН, НН гена CFH было произведено в среднем 3,3, 3,8 и 3,9 в год инъекций соответственно. Анализ частоты рецидивов показал, что при очередных визитах у больных с генотипом CFH НН необходимость новой инъекции была более вероятна, чем у больных с генотипом CFH YY (OD 1,37) [12].

В полногеномном пилотном исследовании LUCENTIS GENOTYPE STUDY с участием 65 пациентов с экссудативной ВМД анализировалось большое количество генов. Через 1 год лечения CFH и CTGF были ассоциированы с более низкой прибавкой остроты зрения. Наличие двух минорных аллелей полиморфизма rs1065489 CFH было связано с ухудшением остроты зрения в среднем на 7 букв (р=0,02) за 6 мес и на 19 букв (р=0,04) за 12 мес, а полиморфизма rs9399005 CTGF — на 8 букв (р=0,03) за 12 мес. При исследовании пациентов с различными полиморфизмами гена CFH до конца не ясно, связано ли это с вариабельностью ответа на ранибизумаб или такой генотип сам по себе предопределяет более тяжелое течение и устойчивость СНМ к лечению. Для решения этого вопроса необходимо подобрать группу пациентов с примерно одинаковой тяжестью, обширностью и характеристикой СНМ и сравнить влияние полиморфизмов CFH на исход лечения ранибизумабом. При оценке толщины сетчатки в макулярной зоне по данным оптической когерентной томографии (ОКТ) значимыми оказались полиморфизмы нескольких генов-кандидатов. Основным из них является минорный аллель полиморфизма rs6660704 С3, который ассоциирован со значительным уменьшением толщины сетчатки в макулярной зоне как за 6 мес, так и за 12 мес на 292 мкм (р=0,0056) и 232 мкм (р=0,017) соответственно. По данным флюоресцеиновой ангиографии с активностью СНМ были статистически достоверно связаны полиморфизмы нескольких генов: FLT1, FGFR2 и VEGFA. С частотой инъекций ранибизумаба были статистически достоверно ассоциированы VEGFA, FLT1 и CFH [9].

В связи с этим целью исследования явилось изучение роли полиморфизмов генов CFH, НTRA и IL-8 в развитии экссудативной ВМД и выявление особенностей терапевтического ответа на эндовитреальное введение ранибизумаба у пациентов с разными генотипами.

Клиническим материалом исследования на первом этапе явились данные генетического скрининга 69 пациентов с экссудативной ВМД, контролем служили 370 случайных жителей Москвы без СНМ. Для анализа гена CFH (фактор комплемента H), HTRA 1 (сериновая пептидаза) и IL-8 (интерлейкин 8) проводили выделение ДНК из 5 мл венозной крови с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (фирма «Промега», США) согласно инструкции. Генотипирование полиморфизмов проводили с помощью MALDI-TOF минисеквенирования. Для ПЦР-амплификации фрагментов ДНК, содержащих искомые полиморфизмы, с помощью программных пакетов Vector NTI 9 и Primer Express 2.0 были подобраны и синтезированы пары праймеров. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы «Bruker Daltonics» (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11).

На втором этапе оценивали изменения остроты зрения и толщины сетчатки в фовеальной области у 120 пациентов на фоне проводимого лечения. Луцентис (ранибизумаб, раствор для внутриглазного введения, «Новартис Фарма АГ» (Швейцария), рег. №ЛСР-004567/08 от 16.06.2008) в объеме 0,05 мл (0,5 мг) вводили в стекловидное тела троекратно с интервалом 4 нед между инъекциями. Всем пациентам помимо стандартного офтальмологического обследования проводили флюоресцеиновую ангиографию сетчатки на фундус-камере FF-450 («Carl Zeiss Meditec AG», Германия) и HRT3 («Heidelberg Engineering», Германия), а ОКТ сетчатки на сканере OCT Stratus («Carl Zeiss Meditec AG», Германия) и HRT3 («Heidelberg Engineering», Германия), поправка на HRT3 +60 мкм. Статистический анализ проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, SPSS.

В результате генетического исследования выявлена статистически достоверная ассоциация полиморфизмов гена CFH с увеличением (rs1061170, rs514943 и rs380390) или уменьшением (rs529825, rs7524776, rs1831281, rs2274700, rs1576340, rs12144939, rs7540032) риска развития СНМ (см. таблицу).

CFH является основным регулятором активации системы комплемента по альтернативному пути. Полиморфизм Y402H приводит к аминокислотной замене тирозина на гистидин в участке связывания фактора комплемента Н с С-реактивным белком и гепарином [11]. В результате из-за сниженной способности связывания фактора комплемента Н с С-реактивным белком при инфекционном воздействии происходит гиперактивация системы комплемента по неспецифическому пути. При этом наблюдается накопление активированных факторов системы комплемента в очаге воспаления, например, эти белки входят в состав друз при ВМД.

Можно предположить, что rs529825 С-rs1061170 С (условно «плохой» гаплотип гена CFH) кодирует вариант, обладающий недостаточной способностью адекватно ингибировать активацию системы комплемента, что будет приводить к высокой концентрации активированных факторов системы комплемента и вследствие этого к повреждению собственных клеток и тканей. При этом, чем сильнее происходит активация системы, тем значительнее выражена недостаточность ингибирования «плохими» вариантами CFH. У больных с ВМД заболевание развивается на протяжении десятков лет бессимптомно, видимо, вследствие недостаточного ингибирования системы комплемента. В таких условиях недостаточность ингибирования проявляется у обладателей двух «плохих» вариантов гена CFH. Клиническая картина глазного дна у пациентов, являющихся носителями гомозиготы по мутации 402Н, характеризовалась наличием выраженной экссудативной реакции и преобладанием двухстороннего поражения.

IL-8 синтезируется моноцитами, макрофагами, фибробластами и вызывает миграцию нейтрофилов и базофилов в очаг воспаления, их дегрануляцию, выделение супероксидного радикала, стимулирует ангиогенез. В экспериментах in vitro было показано, что аллель А этого полиморфизма ассоциирован с повышенной экспрессией гена IL-8. При выявлении мутации гена IL-8 (-251)А для клинической картины характерны фокальный характер поражения, отсутствие друз и отслоек пигментного эпителия, в основном классический характер СНМ (без присутствия оккультного компонента), хорошо развитая сеть новообразованных сосудов.

Другим локусом, ассоциированным с ВМД, является участок 10q26 на 10-й хромосоме, содержащий ген предрасположенности к возрастной макулопатии 2 (ARMS2/LOC387715) и ген сериновой пептидазы HTRA1 [10]. Из-за неравномерного сцепления и статистически неразличимого эффекта двух генов трудно определить, полиморфизмы какого гена имеют значение в развитии заболевания. Функция белка ARMS2 до сих пор остается неизвестной, тогда как полиморфизмы HTRA1 влияют на экспрессию генов [14]. Ген HTRA1 кодирует сериновую протеазу, относящуюся к семейству белков теплового шока, которая, взаимодействуя с факторами роста системы трансформирующего фактора роста фибробластов (TGF-β), определяет степень васкуляризации тканей.

В данном исследовании было определено, что наличие одной копии гена с аллелем риска А полиморфизма rs11200638 гена HТRA1, Т-полиморфизма rs10490924 и del443in54 гена ARMS2 увеличивает риск развития СНМ у пациентов с ВМД (р<0,00001). Отличительной чертой клинической картины у пациентов с мутацией (-625)А промоторного участка гена HTRA1 в двух хромосомах было молниеносное течение заболевания от экссудативных проявлений до процессов выраженного рубцевания с формированием фиброзной ткани не только суб-, но и интра- и преретинально.

Генетический скрининг показал, что комбинация исследуемых мутаций (402Н, (-625)А и (-251)А в обеих копиях генов CFH, HTRA1 и IL-8) приводит к развитию самой тяжелой и быстропрогрессирующей формы заболевания.

При проведении второго этапа исследования был выявлен достоверный положительный эффект на фоне эндовитреального введения ранибизумаба. Средняя толщина сетчатки в фовеальной зоне уменьшилась с 357,73±97,22 до 289,88±56,51 мкм (р≤0,000), средняя острота зрения повысилась от 0,22±0,15 до 0,35±0,22. При исходной остроте зрения 0,1 и выше отмечали более значительное увеличение остроты зрения в процессе лечения (от 0,27±0,03 до 0,49±0,03). При исходной остроте зрения ниже 0,1 эффект лечения был минимален (недостоверное повышение остроты зрения с 0,07±0,00 до 0,09±0,02), а в трех случаях из 12 отмечали снижение этого показателя за счет вторичной дегенерации фоторецепторов. Интересен тот факт, что толщина сетчатки на фоне проведенного лечения в двух группах уменьшалась одинаково. Так, при относительно высокой остроте зрения средние значения фовеальной толщины сетчатки с 340,49±13,94 мкм уменьшилась до 296,6±10,36 мкм, а при остроте зрения менее 0,1 — с 446,6±46,8 до 308,9±14,97 мкм.

Аналогичные изменения были выявлены при фармакогенетическом анализе. В случае обнаружения в генотипе пациента гомозигот по трем полиморфизмам 402Н, (-625)А и (-251)А в обеих копиях генов CFH, HTRA1 и IL-8, несмотря на выраженную резорбцию отека (с 314,01±33,9 до 296,11±15,0 мкм), острота зрения практически не повысилась 0,14±0,02 до и 0,16±0,03 после.

В приведенном клиническом примере представлена динамика картины глазного дна пациента Б. с наличием в генотипе «плохих» полиморфизмов в обеих копиях генов CFH, HTRA1 и IL-8. Пациент обратился с жалобами на резкое снижение зрения левого глаза и появление искажений в течение месяца. Острота зрения с коррекцией левого глаза составила 0,13. На глазном дне с помощью флюоресцеиновой ангиографии и ОКТ выявлена активная субретинальная неоваскулярная мембрана с выраженным отеком (толщина сетчатки в фовеальной зоне 323 мкм) (рис. 1).

В случае полного отсутствия данных полиморфизмов в генотипе отмечали хороший терапевтический ответ и длительную ремиссию заболевания.

Пациентка М. обратилась в клинику с жалобами на снижение остроты зрения левого глаза и появление темного пятна в поле зрения. При осмотре острота зрения с коррекцией 0,25. На глазном дне была выявлена активная СНМ с увеличением толщины сетчатки в фовеальной зоне до 425 мкм (рис. 4).

Таким образом, наличие благоприятных и неблагоприятных полиморфизмов генов CFH, HTRA1 и IL-8 оказывают влияние не только на развитие и степень тяжести заболевания но и на силу и продолжительность терапевтического ответа.

1. Клиническая картина у пациентов с гомозиготным полиморфизмом по аллелю 402Н в гене фактора комплемента Н (CFH) отличается повышенной экссудативной реакцией в макулярной зоне.

2. У пациентов с гомозиготной мутацией (-625)А промоторного участка гена HTRA1 развитие СНМ характеризуется быстрым течением (2—3 мес от первых проявлений СНМ до формирования хориоретинального рубца), повышенным отложением пигмента и выраженным рубцеванием в зоне СНМ.

3. Доказано, что часто рецидивирующее течение СНМ связано с мутациями 402Н, (-625)А и (-251)А в обеих копиях генов CFH, HTRA1 и IL-8 соответственно.

4. Отрицательными прогностическими признаками для проведения антиангиогенной терапии являются острота зрения ниже 0,1 и наличие 402Н, (-625)А и (-251)А в обеих копиях генов CFH, HTRA1 и IL-8.