Аутофлуоресцентная диагностика новообразований кожи и слизистых оболочек

Заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи в наши дни продолжает расти. Каждый год в мире выявляют более 130 тыс. меланом и 2—3 млн злокачественных новообразований эпителиального происхождения. Последние на 75—97% представлены базально-клеточным раком (БКР) [1, 10, 17], который наиболее часто (до 70% случаев) располагается в области головы и шеи [14, 23], поражая в том числе веки и периорбитальную область. Несмотря на научный прогресс и развитие высоких технологий, сохраняется необходимость в простом и эффективном методе диагностики. Одним из направлений исследований является флуоресцентная диагностика (ФД), которая появилась еще в 1940-х годах после изобретения так называемой «лампы Вуда» [13] и с тех пор достигла значительных успехов [4, 24].

Ткани человека содержат большое число разнообразных природных флуорофоров, в основном из группы флавинов, протеинов и порфиринов [9]. Каждый флуорофор имеет характерные спектры поглощения и эмиссии (рис. 1).

Рисунок 1. Спектры поглощения (а)основных флуорофоров биологических тканей. Объяснение в тексте.

Рисунок 1. Спектры эмиссии (б) основных флуорофоров биологических тканей. Объяснение в тексте.

Последние часто перекрываются, причем степень перекрытия варьирует при действии различных источников возбуждения. Как следствие, суммарный спектр флуоресценции ткани, во-первых, имеет сложный состав, а во-вторых, по форме и диапазону зависит от длины волны возбуждающего излучения.

В ультрафиолетовой части спектра флуоресцируют такие внеклеточные белки, как коллаген, эластин, а также ароматические аминокислоты внутриклеточных белков — триптофан, тирозин и фенилаланил. Намного больше соединений люминесцирует в синей и желто-зеленой областях спектра. Это, в первую очередь, восстановленные пиридиннуклеотиды (NADH, NADFH) и окисленные флавопротеины (FMN, FAD) и, кроме того, витамины и продукты метаболизма, в том числе пиридоксали, фолиевая кислота, ее производные и др.

Флуоресценция тканей в красной области спектра характеризуется меньшей интенсивностью по сравнению с ультрафиолетовой и коротковолновой видимой областями и связана преимущественно с эндогенными порфиринами (см. рис. 1, б) [2, 3, 9]. Порфирины представляют собой природные пигменты, структура которых состоит из циклических тетрапиррольных макроциклов и металлических комплексов. Наибольший интерес для онкологии представляет протопорфирин IX, который является предшественником гема — небелковой составляющей гемоглобина, миоглобина, многочисленных цитохромов, каталазы, пероксидазы и др. (рис. 2).

Рисунок 2. Схема биосинтеза гема. Объяснение в тексте.

Было установлено, что быстро пролиферирующие опухолевые клетки вследствие большей активности в них ферментов начального этапа синтеза гема, а также дефицита железа и фермента феррохелатазы способны селективно накапливать протопорфирин IX [11, 18, 21]. Это послужило основанием для активной разработки методов ФД опухолевых заболеваний.

Основной сложностью на первых этапах было отсутствие алгоритмов анализа, которые позволили ли бы уверенно идентифицировать слабую флуоресценцию естественной концентрации протопорфирина IX в общем спектре флуоресценции интересующего участка ткани.

Толчком к развитию ФД стало открытие A. Policard возможности усиления красной флуоресценции неопластической ткани посредством введения экзогенного гематопорфирина [11]. В силу высокой фототоксичности и длительности оказываемого эффекта в дальнейшем экзогенные флуорофоры (производные гематопорфирина, хлорины и др.) стали применять преимущественно для фотодинамической терапии [24], в то время как ФД вернулась к оценке аутофлуоресценции эндогенных протопорфиринов.

Следующим большим шагом стало открытие способа индуцирования аутофлуоресценции путем введения предшественника протопорфирина IX — 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) [16]. Сегодня именно эта методика получила наибольшее распространение [15, 16, 19, 22]. Однако даже у молодых соматически здоровых людей прием препаратов 5-АЛК может сопровождаться побочными эффектами со стороны ЦНС и выраженными фототоксическими реакциями; кроме того, было установлено, что в ряде случаев применение индукторов флуоресценции может снижать чувствительность метода в целом [8]. Таким образом, возросла необходимость поиска эффективного метода оценки нативной аутофлуоресценции ткани [12, 20].

В 2006 г. в НИИ глазных болезней РАМН были разработаны два способа оценки пролиферативной активности новообразований кожи и слизистых оболочек — по данным локальной спектроскопии и флуоресцентной фотографии, которые позволяют полностью отказаться от применения индукторов флуоресценции протопорфирина IX и экзогенных флуорофоров (патенты RU 2362489 и RU 64783) [5, 8].

Способ, предназначенный для обработки данных локальной спектроскопии, заключается в моделировании спектра, который был бы максимально приближен к суммарному спектру аутофлуоресценции, полученному с изучаемого участка ткани. Было установлено, что суммарный спектр аутофлуоресценции в диапазоне 650—800 нм при длине волны возбуждающего излучения 632,8 нм на 97% сформирован всего тремя составляющими: коллагеном, кератином и протопорфирином [9]. Зная эталонные спектры флуоресценции кератина и водного раствора синтетического протопорфирина IX (спектр коллагена в указанном диапазоне практически совпадает со спектром кератина, поэтому отдельно не учитывается), можно определить коэффициенты долевого участия каждого вещества в формировании суммарного спектра (рис. 3).

Рисунок 3. Последовательное приближение модельного спектра аутофлуоресценции (кератин + протопорфирин IX) к реальному спектру, полученному при спектроскопии. Объяснение в тексте.

Не вызывает, однако, сомнения тот факт, что на фоне локальной спектроскопии, изучающей содержание флуорофоров в некой заданной точке, более перспективным представляется пространственное картирование с использованием флуоресцентной фотографии, которое позволяет оценить распределение флуорофоров на целом участке ткани и построить границы патологического процесса. Последнее особенно важно при диагностике новообразований таких сложных локализаций, как, например, внутренний угол глаза, когда необходимо оценить целесообразность выбора метода лечения или любого изменения объема вмешательства [7].

Разработанный в НИИ глазных болезней РАМН способ получения и анализа флуоресцентных изображений прост в исполнении и не требует больших материальных затрат. В максимальном варианте предполагается использование специальной регистрирующей установки с набором светофильтров, зоны пропускания которых соответствуют основным флуорофорам ткани, в данном случае кожи и слизистых оболочек. Возможен и более экономичный вариант — бытовой фотоаппарат с подходящими характеристиками светочувствительной матрицы (в нашем случае Canon EOS 300D). Для дальнейшей работы с полученными флуоресцентными изображениями было создано специальное программное обеспечение («Канцерплот», регистрационный номер 2007613931 от 14.09.2007), которое позволяет с помощью колориметрического анализа (частный случай дифференциального спектрального анализа) высчитывать процент долевого участия красного канала в общем спектре флуоресценции для каждой точки изображения, что отражает концентрацию протопорфирина IX в соответствующей области. Результаты расчетов выводятся на экран в виде изолиний, очерчивающих области со сходными значениями показателя пролиферации (рис. 4).

Рисунок 4. Интерфейс программы «Канцерплот». Желтым цветом на аутофлуоресцентное изображение нанесены изолинии показателя пролиферации. Объяснение в тексте.

Диагностическим критерием служит дельта показателя пролиферации (ΔR, %) — разность между значениями соответствующего показателя для новообразования и окружающих тканей, условно принимаемых за фон. Отдельно производится оценка вероятности прохождения границы между опухолью и здоровой тканью (патент RU 2400265). Исследователь вручную выделяет две зоны интереса — в пределах опухоли и в пределах здоровых тканей, после чего программа в автоматическом режиме производит сканирование изображения и выявляет участки, в которых сочетаются флуоресцентные паттерны обеих областей. Данный алгоритм коренным образом отличается от существовавших ранее подходов, когда анализу подвергалась только интенсивность свечения опухоли. Визуальная граница, которая для удобства пользователя наносится на исходное изображение (рис. 5),

Рисунок 5. Интерфейс программы «Канцерплот». Зеленым цветом на аутофлуоресцентное изображение нанесены вероятностные границы опухоль/здоровая ткань. Объяснение в тексте.

соответствует максимумам вероятности прохождения границы опухоль/здоровая ткань.

Описанный метод нативной аутофлуоресцентной диагностики убедительно доказал практическую возможность отказа от индукторов флуоресценции и экзогенных флуорофоров при исследовании новообразований кожи и слизистых оболочек без потери чувствительности диагностики в целом. Что касается специфичности метода, то в проведенном в НИИ глазных болезней РАМН исследовании [6] была выявлена так называемая «зона неопределенности» в области перекрытия диапазонов дельты показателя пролиферации для группы доброкачественных и злокачественных новообразований (рис. 6).

Рисунок 6. Распределение пациентов в группах по значению дельты пролиферации. Объяснение в тексте.

Авторами был предложен дополнительный параметр — коэффициент «размытости» границ опухоли (K_dith), представляющий собой усредненную обратную величину к вероятности прохождения границы опухоль/здоровая ткань и отражающий степень функциональной атипии опухолевых клеток, характер инвазии и наличие зон скрытого роста. Благодаря такой комплексной оценке аутофлуоресцентного паттерна новообразования специфичность метода существенно повысилась (с 0,69 до 0,85). С учетом усовершенствований метод нативной аутофлуоресцентной диагностики позволяет с высокой степенью достоверности отнести исследуемое новообразование к одной из двух групп (рис. 7).

Рисунок 7. Диаграмма соотношения коэффициента «размытости» границ опухоли и дельты пролиферации. Злокачественному процессу статистически соответствует область, выделенная красным. Объяснение в тексте.

В качестве иллюстрации к вышеизложенному приводим клинические примеры.

Клинический пример 1(рис. 8).

Рисунок 8. Папиллома кожи внутреннего угла левой глазной щели (подтверждена гистологически). а — макрофото; б — аутофлуоресцентное изображение; в — аутофлуоресцентное изображение с нанесенными изолиниями показателя пролиферации (желтый цвет); г — аутофлуоресцентное изображение с построенными вероятностными границами между новообразованием и здоровой тканью (зеленый цвет).

Пациентка К., 46 лет, новообразование кожи внутреннего угла левой глазной щели размером 2×1,5×3 мм. При проведении аутофлуоресцентной диагностики выявлена низкая пролиферативная активность в области основания. Дельта показателя пролиферации составила 3,2%, т.е. попала в диапазон физиологических значений для данной области [6]. Вероятностные оптические границы с высокой степенью достоверности определены почти на всем протяжении, K_dith составил 0,99. Согласно рис. 7, данное новообразование располагается в «зеленой зоне», т.е. обладает признаками доброкачественности. Впоследствии было установлено, что гистологически оно представляет собой папиллому кожи.

Клинический пример 2(рис. 9).

Рисунок 9. Базально-клеточный рак кожи периорбитальной области слева (подтвержден гистологически). а — макрофото; б — макрофото новообразования; в — аутофлуоресцентное изображение; г — аутофлуоресцентное изображение с нанесенными изолиниями показателя пролиферации (желтый цвет); д — аутофлуоресцентное изображение с построенными вероятностными границами между новообразованием и здоровой тканью (зеленый цвет).

Пациент В., 58 лет, новообразование кожи периорбитальной области слева размером 5×4×4 мм. Было выявлено заметное превышение пролиферативной активности новообразования над окружающими тканями. Дельта показателя пролиферации составила 6,2%, что на рис. 7 соответствует «зоне неопределенности». Однако вероятностные оптические границы опухоль/здоровая ткань в отличие от предыдущего примера определены не на всем протяжении, что согласуется с высоким значением K_dith — 1,42, который позволяет отнести данное новообразование к злокачественным (красная зона на рис. 7). Гистологическое исследование выявило БКР кожи.

Клинический пример 3(рис. 10).

Рисунок 10. Плоскоклеточный рак края нижнего века левого глаза с переходом на пальпебральную слизистую (подтвержден гистологически). а — макрофото; б — аутофлуоресцентное изображение; в — аутофлуоресцентное изображение с нанесенными изолиниями показателя пролиферации (желтый цвет); г — аутофлуоресцентное изображение с построенными вероятностными границами между новообразованием и здоровой тканью (зеленый цвет).

Пациентка Н., 63 года, новообразование края нижнего века левого глаза с переходом на пальпебральную слизистую оболочку размером 5×3×2 мм. Обнаружено значительное превышение пролиферативной активности новообразования над прилежащими неизменными участками тканей. Дельта показателя пролиферации составила 12,6%, а коэффициент «размытости» границ — 2,25. В совокупности эти данные с высокой степенью достоверности свидетельствуют о злокачественной природе данного новообразования (см. рис. 7). Гистологический диагноз — БКР.

Таким образом, исследования в области ФД, проводившиеся в НИИ глазных болезней РАМН в 2006—2012 гг., привели к ощутимым результатам. Был разработан простой в исполнении, неинвазивный, безопасный и экономичный способ получения и анализа аутофлуоресцентных изображений, позволяющий отказаться от применения индукторов флуоресценции и экзогенных флуорофоров при первичной диагностике новообразований век и периорбитальной области. Был также разработан оригинальный способ определения вероятностных оптических границ между новообразованием и окружающими здоровыми тканями, представляющий большую практическую ценность в определении объема вмешательства. Кроме того, был выработан и внедрен в практику Института продемонстрировавший высокую чувствительность и специфичность комплексный подход к оценке аутофлуоресцентного паттерна новообразований, была налажена работа специализированного кабинета аутофлуоресцентной диагностики.

Мы полагаем, что полученные данные могут быть экстраполированы на новообразования кожи и слизистых оболочек другой, неофтальмологической, локализации. Будущее метода связано с дальнейшим повышением его эффективности, особенно в направлении дифференциальной диагностики злокачественных и воспалительных процессов. Планируется также создание нового, более удобного для пользователя интерфейса программы «Канцерплот», что будет способствовать расширению ее практического применения.