Сохранение тонкой структуры и физиологической функции роговицы является одной из важнейших задач современной клинической офтальмологии. Роговица обеспечивает ¾ преломляющей мощности рефракционного аппарата глаза [1], а совершенная цитоархитектоника клеточных слоев, выстилающих роговицу, и кератоцитов, населяющих ее строму, позволяет обеспечить ее структуре более чем 99% прозрачности [2, 3]. Дифференцированные клетки внешнего слоя эпителия роговицы ежедневно слущиваются (в ходе естественного процесса десквамации), уступая место новым, образующимся из пролиферирующих клеток базального слоя, которые, в свою очередь, являются производными клеток-предшественников (прогениторов) и их более дифференцированного производного — транзиторных амплифицирующих клеток (ТАК). Основным источником репопуляции пула клеток-предшественников эпителия роговицы являются лимбальные эпителиальные стволовые клетки (ЛЭСК), тесно ассоциированные с палисадами Фогта и населяющими их стромальными клетками [4, 5]. Именно микроокружение палисада лимба поддерживает стволовые клетки в недифференцированном, «спящем» состоянии до их активации внешними молекулярными сигналами [6]. После активации скорость центрипетальной миграции (в направлении от лимба к центру роговицы) клеток — производных ЛЭСК у человека составляет около 28 мкм в день [7], что позволяет восстанавливать эпителий роговицы, поврежденный внешним воздействием, в сроки от 1 до 4 сут. В процессе миграции ЛЭСК претерпевают ряд изменений, пролиферируя сначала в клетки-прогениторы, а затем в ТАК. В случае массивной травмы лимба (повреждение более чем 70—75% его окружности) источник ЛЭСК резко оскудевает и основной вклад в регенерацию эпителиального слоя роговицы, по-видимому, вносит пул персистирующих в базальном слое роговичного эпителия ТАК [4, 8, 9]. Потенциал этого остаточного резерва невысок, что приводит к нарушению процесса эпителизации роговицы, изменению ее прозрачности и результирующей инвалидизации.

Таким образом, сохранение и поддержание регенераторного потенциала клеток роговицы глаза как при ее ятрогенной травме (фоторефракционной кератэктомии, лазерной коррекции зрения, шунтирующих операциях), так и при оперативных вмешательствах, выполняемых вследствие осложненных кератитов или повреждений роговицы иной этиологии (пенетрирующей, ламеллярной или эндотелиальной кератопластике), является первостепенной задачей офтальмолога и офтальмохирурга [10].

Любое хирургическое вмешательство сопровождается реактивным воспалением [11]. Если воспаление приобретает инфекционный характер, оно может привести к серьезным последствиям, вплоть до гибели глаза. В современной офтальмохирургии одной из основных причин, оказывающих серьезное неблагоприятное влияние на исход операции и течение послеоперационного периода, является именно внутриглазная инфекция. Поэтому использование топикальных антибактериальных препаратов (АБП) в современной клинической офтальмологии является неотъемлемым компонентом лекарственной терапии, как патогенетической, так и профилактической. Назначение АБП в профилактических целях в неосложненном послеоперационном периоде в рефракционной офтальмохирургии стало рутинной практикой. При этом существующие данные в отношении эффективности этой практики противоречивы, что делает подход к выбору средства профилактики четко дифференцированным: с учетом факторов риска развития инфекционных осложнений у пациента и свойств используемого агента [12—13].

Наиболее широкое распространение в клинической офтальмологии получили антибиотики аминогликозидной и фторхинолоновой групп, так как они обладают высокой безопасностью и эффективностью в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактериальных возбудителей офтальмоинфекций.

Спектр показаний к профилактическому и терапевтическому назначению топикальных АБП в офтальмологии не ограничивается перечисленными выше, что значительно расширяет круг пациентов, получающих эти препараты, и актуализирует проблему выбора, который должен основываться не только на спектре активности антибиотика, но и на профиле безопасности его применения.

В офтальмологии вопрос безопасности лекарственного средства требует особого внимания, так как локальное применение препаратов в конъюнктивальную полость, безусловно, будет воздействовать на эпителий конъюнктивы и роговицы, оказывая влияние на скорость репарации тканей [15].

Цитотоксичность АБП — широко известный факт, основанный как на доклинических, так и на клинических данных [16—18]. Клинически данное свойство может проявляться в замедлении скорости эпителизации дефекта роговицы [19], отеке роговицы [20], а также в образовании преципитатов в ее строме, что неоднократно наблюдалось при лечении кератитов и инфицированных язв роговицы [21—26]. Следует отметить, что цитотоксичность, безусловно, носит дозозависимый характер [27] и зачастую является продукт-специфичной, а большинство публикаций, описывающих негативный опыт применения АБП, относится к представителям фторхинолоновой группы антибиотиков I и II поколений — офлоксацину и ципрофлоксацину [28, 29]. По мере накопления клинического опыта применения АБП и появления новых технологий, используемых как для поиска новых молекул-кандидатов, так и для их тестирования, появляются антибиотики следующих поколений, обладающие улучшенной безопасностью и повышенной эффективностью. С момента появления фторхинолонов IV поколения систематизированных данных о клинических проявлениях их цитотоксичности не публиковалось, что косвенно свидетельствует об улучшенном профиле их безопасности [30, 31], тем не менее все еще встречаются единичные клинические случаи, описывающие такие серьезные побочные эффекты, как отек роговицы [32]. При этом акцент озабоченности перенесен на безопасность средств доставки новых молекул, которые также могут вызывать серьезные побочные эффекты, как это было продемонстрировано в случае с биоадгезивной платформой пролонгированной доставки DuraSite, импрегнированной безифлоксацином или азитромицином, в исследовании бесшовного закрытия постоперационных дефектов роговицы [33]. В отношении аминогликозидных антибиотиков, в частности препаратов III поколения, на сегодняшний день не имеется клинических данных по цитотоксичности.

Оценка цитотоксичности антибиотиков является немаловажным аспектом. В последние годы в научной литературе появились публикации, в которых представлены данные об оценке цитотоксичности, полученные в экспериментальных исследованиях in vitro с использованием клеточных культур. Анализ научных публикаций, в которых приводятся сравнительные данные по оценке токсического воздействия офтальмологических антибиотиков на различные клеточные структуры глаза, показал, что в настоящее время единого мнения по данному вопросу нет [34].

Исследования на клеточных культурах позволяют проводить количественную оценку цитотоксичности АБП и имеют практическое значение при выборе и обосновании применения лекарственных препаратов.

Цель данного исследования — сравнить общее цитотоксическое действие на клеточные культуры аминогликозидного антибиотика III поколения — нетилмицина, II поколения — тобрамицина и фторхинолонового антибиотика II поколения — ципрофлоксацина.

В качестве тест-систем в исследовании были использованы 3 типа клеток: клетки постоянной трансформированной клеточной линии СНО-К1 (клетки опухоли яичника китайского хомячка), нормальные фибробласты кожи (ФК) человека и клетки постоянной трансформированной клеточной линии Clone 1−5С-4 (клетки нормальной конъюнктивы человека). Выбор данных клеточных культур обусловлен тем, что к общей токсичности чувствительны все клетки, независимо от их происхождения и специализации в организме. Клетки CHO-К1, имеющие высокую эффективность клонирования и стабильный уровень спонтанных мутаций, активно применяются в качестве модельной тест-системы для скрининга потенциальной мутагенности и канцерогенности у млекопитающих (OECD, Test № 476: 1997, IDT). Нормальные Ф.К., сохраняющие на протяжении всего срока культивирования постоянный диплоидный набор хромосом и характерную морфологию, являются одной из наиболее перспективных тест-систем для биохимико-токсикологических исследований in vitro. Клетки нормальной конъюнктивы человека широко используются в качестве тест-системы в офтальмологических исследованиях.

Клетки постоянной трансформированной клеточной линии СНО-К1, выделенные из яичника китайского хомячка, получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в питательной среде F12 («Биолот», Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (fetal bovine serum, FBS) («HyClone», США) и 1% пенициллин-стрептомицина («Gibco by Life Technologies», США).

Нормальные ФК человека были выделены в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург) из фрагментов кожи лица взрослых доноров, полученных в результате косметологических операций. В работе были использованы клетки 3—5-го пассажей. Клетки культивировали в питательной среде ДМЕМ/F12 («Биолот», Россия) с добавлением 10% FBS («HyClone», США) и 1% пенициллин-стрептомицина («Gibco by Life Technologies», США).

Клетки постоянной трансформированной клеточной линии Clone 1−5С-4 (клетки нормальной конъюнктивы человека) были получены из коллекции НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва). Клетки культивировали в питательной среде Игла МЕМ («Биолот», Россия) с добавлением 10% FBS («HyClone», США) и 1% пенициллин-стрептомицина («Gibco by Life Technologies», США).

Все типы клеток культивировали при 37 °C в СО₂-инкубаторе в атмосфере 5% СО₂.

Действие антибиотиков на клеточные культуры выявляли по их влиянию на жизнеспособность клеток, культивируемых в питательных средах с добавлением исследуемых препаратов. Для определения жизнеспособности клеток использовали количественные и качественные методы оценки. Количественная оценка — метод клонирования клеток и колориметрический метод оценки их пролиферации; качественная оценка — прижизненное визуальное наблюдение под инвертированным микроскопом за морфологическим состоянием клеток в процессе культивирования с их фотофиксацией в момент наблюдения.

В основе метода лежит способность клеток образовывать колонии, представляющие собой клоны, как потомство одной изначальной клетки. Четкие клоны образуются при редком посеве отдельных клеток. Эффективность образования колоний (эффективность колониеобразования, или эффективность клонирования) определяется процентным отношением числа образовавшихся колоний (клонов) через N суток культивирования к числу посеянных клеток. Эффективность образования колоний (клонов) характеризует жизнеспособность клеток в данных условиях культивирования.

Влияние тестируемых препаратов на эффективность клонирования проверяли на клетках линии СНО-К1, которые высевали на чашки Петри диаметром 3 см в 2 мл питательной среды F12 («Биолот», Россия) с добавлением 10% FBS («HyClone», США). Культивирование проводили при 37 °C в СО₂-инкубаторе в газовой среде с 5% СО₂. Тестируемые препараты добавляли в питательную среду в момент посева клеток. Контролем служили клетки той же линии CHO-К1, культивируемые в стандартных условиях без добавления препаратов. Срок культивирования составил 5 сут. Колонии, образовавшиеся за это время, фиксировали в 70% растворе этанола и окрашивали 0,1% раствором генцианового фиолетового (генцианвиолет). Эффективность клонирования определяли как выраженную в процентах долю числа сформировавшихся колоний, состоящих из 10 и более клеток, по отношению к числу посеянных клеток. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.

В основе колориметрических методов оценки пролиферации клеток лежит их окрашивание органическими красителями с последующей экстракцией их из клеток в раствор. Степень пролиферации определяется по оптической плотности красителя. Колориметрические методы позволяют оценить количество жизнеспособных клеток в данных условиях культивирования. Чаще всего используют тесты со следующими красителями: нейтральный красный, 3-(4,5-диметилтиазолин-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ-тест), cульфородамин В (SRB-тест), генциановый фиолетовый. Наиболее простыми и доступными методами можно считать определение содержания общего белка как показателя прироста клеточной массы (SRB-тест и тест с генцианвиолетом) [35].

Степень пролиферации определяется по оптической плотности красителя генцианового фиолетового, связавшегося с клеточными белками и экстрагированного из клеток через N суток культивирования. Влияние тестируемых препаратов на пролиферацию определяли на клетках линии СНО-К1, нормальных ФК человека и клетках постоянной трансформированной клеточной линии Clone 1−5С-4. Клетки высевали в 96-луночные планшеты из расчета 500 клеток на лунку в 200 мкл соответствующей питательной среды с добавлением 10% FBS («HyClone», США). Для клеток линии СНО-К1 использовали среду F12 («Биолот», Россия), для ФК — DMEM/F12 («Биолот», Россия), для клеток линии Clone 1−5С-4 — Игла MEM («Биолот», Россия). Тестируемые АБП добавляли в питательные среды в момент посева клеток. Контролем служили клетки линий CHO-К1, Clone 1−5С-4 и ФК, культивируемые в стандартных условиях: при 37 °C в СО₂-инкубаторе в атмосфере 5% СО₂. Срок культивирования — 5 сут. На 5-е сутки культивирования клетки фиксировали в 70% растворе этанола и окрашивали 0,1% раствором генцианового фиолетового. После этого экстрагировали краситель из клеток, добавив в лунки по 100 мкл 7% уксусной кислоты. Количество клеток, выросших за время культивирования, определяли методом фотоколориметрического анализа с помощью анализатора Fluorofot («Charity», Россия) по оптической плотности красителя (генцианового фиолетового), связанного с клеточными белками. Измерения проводили при длине волны 570 нм. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы MS Excel. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.

Метод прижизненного наблюдения под инвертированным микроскопом с фотофиксацией позволяет визуально оценить морфологическое состояние клеток в процессе их культивирования в данных условиях и сравнить с контрольным вариантом. Прижизненное наблюдение с фотофиксацией в процессе культивирования всех типов клеток (как в средах, содержащих тестируемые АБП, так и в контроле) осуществляли под инвертированным микроскопом Nikon Eclipse TS100, оснащенным фотокамерой.

Выбор концентрации АБП для эксперимента базировался на данных клинического использования исследуемых препаратов. Терапевтическая доза однократного использования каждого препарата — 1 капля в конъюнктивальный мешок пораженного глаза. Объем капли, формируемой глазной пипеткой, варьирует от 25 до 50 мкл: конъюнктивальный мешок может вместить около 10 мкл (10 см³) жидкости. При этом в конъюнктивальной полости человека в норме постоянно содержится около 6—7 мкл слезной жидкости. При сомкнутых веках слезная жидкость полностью заполняет конъюнктивальный мешок, а при раскрытых веках распределяется по переднему сегменту глазного яблока в виде тонкой прероговичной слезной пленки толщиной в среднем 5—10 мкм. Таким образом, с учетом объема слезной жидкости первоначальная концентрация препарата в конъюнктивальном мешке при однократном применении может варьировать от 70 до 90%. В экспериментах по определению пролиферации клеток колориметрическими методами использовали 200 мкл питательной среды в 1 лунке 96-луночной платы. Доза препарата составила 20 и 2 мкл на 200 мкл среды, что соответствует 10 и 1% от объема питательной среды. В экспериментах по клонированию клеток использовали 2 мл питательной среды в 1 чашке Петри диаметром 3 см. Доза препарата составила 200 и 20 мкл на 2 мл среды (10 и 1% от объема питательной среды соответственно). Расчет концентраций исследуемых препаратов в клинике и эксперименте представлен в таблице.

Влияние антибиотиков на эффективность клонирования оценивали на клетках линии CHO-К1 в 2 сериях экспериментов с различной концентрацией исследуемых препаратов (1 и 10%) в объеме питательной среды. Результаты серии экспериментов по эффективности клонирования клеток линии СНО-К1 в присутствии исследуемых препаратов в концентрации 1% от объема питательной среды показали, что эффективность клонирования в экспериментальных вариантах была ниже, чем в контроле. Наиболее близким к контролю по эффективности клонирования оказался нетилмицин — 73%. Наиболее выраженное цитотоксическое действие на клетки проявил тобрамицин. Эффективность клонирования в этом варианте составила всего 13%. При концентрации тестируемых АБП в 10% от объема питательной среды клетки линии СНО-К1 образовали клоны только в присутствии нетилмицина, причем эффективность клонирования в этом варианте составила 57%. Ципрофлоксацин и тобрамицин в такой же концентрации проявили высокую степень цитотоксичности при редком посеве клеток. Результаты представлены на рис. 1.

На рис. 2 представлены различия в морфологии клонов и отдельных клеток в контроле и экспериментальных вариантах. Колонии в контроле плотные, сформированы из 100 и более клеток типичной для линии СНО-К1 эпителиоподобной морфологии. Наиболее близкими к контролю по этим морфологическим признакам является вариант с нетилмицином. В этом варианте выявлены как плотные, так и диффузные по структуре клоны, сформированные из 80—90 клеток. В варианте с ципрофлоксацином клоны имеют более рыхлое строение (диффузную структуру) и состоят из 15—20 клеток. В варианте с тобрамицином колонии очень мелкие (состоят менее чем из 10 клеток) и диффузные. Клетки в этих вариантах не всегда имеют характерную эпителиоподобную морфологию. Много округлившихся и вытянутых клеток, их структура зернистая, с вакуолями, что свидетельствует об их недостаточно хорошем физиологическом состоянии. Эти данные позволяют сделать вывод, что тестируемые антибиотики в концентрации 1% от объема питательной среды оказывают на клетки линии СНО-К1 цитотоксическое действие разной степени. Наиболее токсичное действие на клетки было выявлено для тобрамицина. Наименьший цитотоксический эффект проявил нетилмицин.

Влияние антибиотиков на пролиферацию определяли на клетках линии СНО-К1, ФК и клетках линии Clone 1−5С-4. С каждым типом клеток было выполнено по 2 серии экспериментов с различной концентрацией исследуемых препаратов (1 и 10%) в объеме питательной среды. Тестирование методом фотоколориметрического анализа выявило, что при концентрации исследуемых препаратов 1% от объема питательной среды наименее токсичным для всех типов клеточных культур оказался нетилмецин, который практически не проявил цитостатического действия. В концентрации 10% от объема питательной среды токсическое действие этого препарата на все типы клеток носит умеренный характер, в то время как тобрамицин и ципрофлоксацин проявляют высокую степень токсичности для всех типов клеток как в концентрации 1% от объема питательной среды, так и в концентрации 10%. Наиболее выражено это действие проявилось на клетках линий СНО-К1 и Clone 1−5С-4.

Результаты экспериментов на клетках линии CHO-К1, ФК и клетках линии Clone 1−5С-4 с концентрацией тестируемых антибиотиков 10 и 1% от объема питательной среды, полученные с помощью метода фотоколориметрического анализа, приведены на рис. 3.

С помощью фотоколориметрического метода определения пролиферации было установлено цитотоксическое действие исследуемых препаратов на все типы клеток в следующей последовательности (по убыванию токсичности): тобрамицин→ципрофл-оксацин→нетилмицин.

Морфологическое состояние клеток линии CHO-К1, ФК и клеток линии Clone 1−5С-4, культивируемых в средах, содержащих исследуемые препараты в концентрации 1 и 10% от объема питательной среды, представлено на рис. 4, 5.

Как можно видеть на представленных на рис. 4, 5 фотографиях, все типы клеток в контрольных вариантах имеют типичную для них морфологию (клетки линий CHO-К1 и Clone 1−5С-4 — эпителиоподобную, ФК — фибробластоподобную) и на 6-е сутки культивирования сформировали конфлюэнтный монослой. При концентрации тестируемых препаратов 1% от объема питательной среды наиболее близкими к контролю по морфологическому состоянию всех типов клеток и степени формирования монослоя оказались экспериментальные варианты с нетилмицином. В присутствии тобрамицина и ципрофлоксацина в питательной среде в такой же концентрации ни один из типов клеток не образовал субконфлюэнтного монослоя. В экспериментальных вариантах с данными препаратами клетки распластаны, но их мало, выявлено много округлых и вытянутых клеток, их структура зернистая, с вакуолями, что является признаком угнетенного состояния клеток. Эти данные позволяют сделать вывод, что тестируемые антибиотики в концентрации 1% от объема питательной среды оказывают на все типы клеток цитотоксическое действие разной степени. Независимо от использованной клеточной тест-системы наиболее токсичное действие было выявлено для тобрамицина. Наименьший цитотоксический эффект для клеток всех тест-систем проявил нетилмицин. При концентрации тестируемых препаратов 10% от объема питательной среды в экспериментальных вариантах с тобрамицином и ципрофлоксацином монослой не сформирован. Клетки всех тест-систем в присутствии этих препаратов в питательной среде в данной концентрации имеют круглую форму, что говорит об их угнетенной жизнеспособности. В питательных средах всех тест-систем в присутствии ципрофлоксацина выявлено формирование кристаллов препарата. Эти данные позволяют сделать вывод, что ципрофлоксацин и тобрамицин в концентрации 10% от объема питательной среды оказывают на все типы клеток высокотоксическое действие. Экспериментальные варианты с нетилмицином, присутствующим в питательных средах в концентрации 10%, оказались близкими к контролю как по степени формирования монослоя, так и по морфологическому состоянию клеток всех тест-систем.

Результаты оценки цитотоксичности аминогликозидного антибиотика III поколения — нетилмицина, II поколения — тобрамицина и фторхинолонового антибиотика II поколения — ципрофлоксацина, полученные в данном исследовании in vitro, показали, что данные препараты имеют различную степень цитотоксичности. Независимо от использованного метода оценки общей токсичности протестированных в данной работе антибиотиков было выявлено токсическое действие каждого препарата на клетки конкретного типа. Наибольший токсический эффект для всех типов клеток, использованных в качестве тест-систем в данной работе, проявил аминогликозидный антибиотик II поколения тобрамицин. Наименее токсичным и наиболее близким к контролю по степени токсичности для всех типов клеток, использованных в качестве тест-систем в данной работе, оказался аминогликозидный антибиотик III поколения нетилмицин.

Проведенное исследование показало принципиальную возможность использования культивируемых клеток для сравнительной оценки цитотоксического действия различных офтальмологических препаратов in vitro. Представленные в работе результаты исследований по оценке цитотоксичности антибиотиков аминогликозидного и фторхинолонового ряда демонстрируют, что данные препараты оказывают цитостатический эффект в условиях in vitro и отличаются по своему цитотоксическому потенциалу. Анализ и оценку полученных результатов следует экстраполировать на клинические признаки. Правильный выбор АБП является ключевым фактором в устранении нежелательных реакций, возникающих при использовании антибиотиков различных групп в офтальмологии в качестве как патогенетической, так и профилактической терапии.

Работа выполнена в рамках проекта РНФ № 14−50−00068.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: О.А., М.Б.

Сбор и обработка материала: О.А., Ю.Х.

Статистическая обработка данных: О.А., Ю.Х.

Написание текста: О.А., Д.М.

Редактирование: О.А., М.Б., Д.М.

Конфликт интересов отсутствует.