Развитие офтальмологии невозможно без совершенствования методов адекватной оценки анатомо-функционального состояния органа зрения в целом, его отдельных структур и понимания процесса их взаимодействия. С этих позиций методы исследования роговицы за последние годы претерпели значительные изменения. Достаточно упомянуть целый ряд методов, которые позволили существенно расширить возможности детальной оценки в клинической практике анатомо-функционального состояния роговицы: топографические кератометрия и пахиметрия, оптическая когерентная томография, конфокальная микроскопия, двунаправленная пневмоаппланация, тиаскопия [1—6]. В меньшей степени технические нововведения каснулись возможности оценки оптических явлений, происходящих при пропускании света веществом роговицы, — объективной оценки ее прозрачности.

С точки зрения биофотоники прозрачность роговицы определяется как ничтожным поглощением света, так и низкой светорассеивающей способностью ее вещества. Возрастание именно светорассеивающих свойств приводит к нарушению прозрачности роговицы и возникновению помутнений. Для характеристики прозрачности роговицы чаще всего используют два противоположных по смыслу термина «светопропускание» и «светорассеяние». Противопоставление этих терминов не совсем корректно с точки зрения оптики. Это связано с тем, что на уменьшение величины светопропускания кроме светорассеяния могут влиять еще два фактора — поглощение и люминесцентное переизлучение света веществом роговицы. При этом для большинства задач по оценке прозрачности роговицы, имеющих клиническое приложение, поглощением и люминесцентными свойствами можно пренебрегать.

Оптические свойства роговой оболочки определяются ее прозрачностью, регулярностью поверхности, упорядоченностью структуры и рефракционным индексом. Прозрачность в основном обеспечивается гомогенной ориентацией коллагеновых фибрилл стромы, диаметр и расстояние между которыми статистически не превышают половины длины луча видимого света (от 400 до 700 нм). Это свойство организации вещества роговицы позволяет лучам света не дифрагировать на оптически неоднородной структуре и распространяться через роговицу прямолинейно, не рассеиваясь. Регулярность укладки фибрилл может облегчать светопропускание стромой посредством происходящей интерференции, создающей эффект, аналогичный просветлению в технической оптике [7]. Даже незначительные изменения в гомеостазе роговичной ткани с тенденцией к разупорядочиванию структуры могут приводить к нарушению прозрачности за счет возникновения избыточного светорассеяния.

«Правильное» прохождение света через роговицу, подчиняющееся только ее общей рефракции, закладывается в самый начальный момент взаимодействия, еще при прохождении световой волны через внешние структуры глазной поверхности. Именно эти структуры, обладая значительной контрастностью оптической плотности по отношению к воздуху, определяют в каждой точке поверхности реальную геометрию вхождения луча вглубь глаза, а также «случайное» дифракционное рассеяние. Геометрическую регулярность поверхности определяют слезная пленка и эпителий роговицы. Несмотря на то что слезная пленка в гистологическом смысле не является структурным компонентом роговицы, именно на ее передней поверхности на границе с воздухом происходит оптическое преломление (коэффициенты преломления воздуха, слезной пленки, вещества роговицы и водянистой влаги составляют 1,000; 1,336; 1,376 и 1,336 соответственно) [8].

Иррегулярность передней поверхности роговицы как следствие микродефектов слезной пленки и переднего эпителия, не влияя на рефракцию, может увеличивать светорассеяние, которое будет неизбежно влиять на контрастность формируемой проекции. Этот эффект может быть измерен инструментально. В некоторых клинико-экспериментальных исследованиях было зафиксировано снижение контрастной чувствительности за счет увеличения иррегулярности роговичной поверхности при удалении муцинного слоя слезы [9]. Клиническая значимость этого эффекта известна и является одной из причин разнообразия тестов и проб для первичной диагностики истощаемости слезной пленки [10—13]. Для качественного и количественного анализа ее структурных характеристик, влияющих на первичное светорассеяние и потерю световой энергии, используют метод тиаскопии, основанный на фоторегистрации феномена интерференции [14]. Новая модификация этого метода предполагает использование стационарного параболического осветителя и программного обеспечения для количественного описания интерференционной картины липидного слоя [15].

Передний неороговевающий эпителий роговицы составляет 10% ее обшей толщины и состоит из 5—6 слоев трех различных типов эпителиальных клеток. Процесс полной дифференцировки клеток до десквамации их в слезной пленке занимает 7—14 сут [16—18]. Солнечная радиация, гипоксия, механическое воздействие может инициировать процесс апоптоза [19—22] клеток и тем самым привести к нарушению упорядоченности структуры эпителия и как следствие прозрачности роговицы [23].

На уровень светорассеяния в пределах эпителия роговицы влияет не только регулярность его строения, но и абсолютная толщина. Это связано с тем, что эпителий даже с нормальными оптическими характеристиками является сильно рассеивающей свет тканью. В ряде случаев (кератиты различной этиологии, состояние после лазерной абляции стромы) изменение толщины роговицы может быть обу-словлено гиперплазией клеток глубжележащих слоев эпителия и прямо влиять на общую прозрачность роговицы [24].

Эпителий и строма разделены видимой микроскопически бесклеточной нерегенерируещей мембраной толщиной 12 мкм, состоящей из коллагеновых фибрилл и протеогликанов, — передней пограничной боуменовой (Bowman) пластинкой или мембраной, которую некоторое авторы относят к передней части стромы, поскольку ее фибриллы образуются кератоцитами стромы и распространяются в вещество последней. Показано, что даже при отсутствии боуменовой мембраны как четко определяемой структуры роговицы (например, у некоторых млекопитающих) или ее удалении (при эксимерлазерной абляции) эпителий может сохранять свою гомогенность [8]. Влияние передней пограничной мембраны на прозрачность роговицы не описано.

Строма занимает большую часть (около 90%) роговицы. Нормальная биологическая активность кетатоцитов, упорядоченная ориентация коллагеновых волокон стромы, сбалансированное содержание водного компонента — основные условия поддержания прозрачности роговицы. Вещество стромы содержит внеклеточный матрикс, роговичные фибробласты (кератоциты) и нервные волокна. Клеточные компоненты занимают лишь 2— 3% всего объема [25], в то время как коллагеновые структуры — 70% всего сухого вещества. Для прижизненной визуализации коллагеновых волокон используют конфокальную микроскопию [26]. При трансмиссионной электронной микроскопии обращает на себя внимание не только строгая взаимоориентированность фибрилл с расстоянием между ними 41,4±0,5 нм (27), но и постоянство их диаметра (от 22,5 до 35 мкм) [27, 28]. Именно эта жесткая упорядоченность играет основную роль в процессе светопроведения, а отек стромы или ее рубцовые изменения могут привести к потере этой функции. При увеличении расстояния между фибриллами прозрачность роговицы снижается. Так, J. Goldman и G. Benedek объясняют прозрачность роговицы малыми по отношению к длине волны света размерами коллагеновых фибрилл, которые не влияют на прохождение света, пока они не превышают половины длины его волны [8].

Сеть кератоцитов объединена дендритными отростками [30]. Кератоциты в состоянии покоя синтезируют так называемые кристаллины (молекулы, изначально более известные по обменным процессам в хрусталике глаза), которые предположительно и обеспечивают такие функции роговицы, как светопроведение и светопреломление [31], а также участвуют в антиоксидантной защите роговицы [11]. Описана экспрессия кератоцитами человека таких кристаллинов, как ALDH1A1, ALDH3A [16], ALDH2 и TKT (транскетолаза) [31]. Одним из факторов, определяющих оптическую прозрачность стромы роговицы, может являться выделяемый в толщу стромы кератансульфат, который, выполняя несколько функций, может играть роль динамического буфера, поддерживающего оптимальную гидратацию стромы [32]. При генетически обусловленном нарушении синтеза кератансульфата развивается пятнистая дистрофия роговицы.

Задняя пограничная мембрана (десцеметова мембрана) бесклеточная нерегенерирующая ткань толщиной 8—10 мкм, повреждение которой приводит к стойкому стромальному отеку. Реже, при условии миграции клеток заднего эпителия роговицы к краю дефекта, он может закрыться. Основная составляющая десцеметовой мембраны — коллагеновые фибриллы, которые не интегрированы с аналогами остальных слоев.

Задняя поверхность десцеметовой мембраны выстлана монослоем гексагональных эпителиальных клеток размерами от 5 до 20 мкм. При помощи широкодиапазонного спектрального микроскопа можно определить количественный и качественный набор клеток, а также определенные тренды на внешние раздражители. В среднем частота клеточного распределения составляет 3500 клеток/мм². На внешнее воздействие клетки заднего эпителия роговицы отвечают снижением численности и потерей формы, что в критических ситуациях может отразиться на выполнении ими барьерной функции. Количественно изменяясь в течение жизни, истощаясь и мигрируя, клетки заднего эпителия роговицы выполняют свою основную барьерную функцию, обеспечивая адекватный уровень гидратации стромы и как следствие — ее прозрачность [33]. В течение жизни отмечается снижение численности клеток заднего эпителия, которые, согласно данным литературы, не имеют способности к пролиферации в естественных условиях, хотя склонны к митозу, и как следствие, пролиферации в условиях клеточных колоний или в определенных условиях in situ.

Все биологические ткани являются оптически неоднородными поглощающими средами, средний показатель преломления которых больше, чем у воздуха, поэтому на границе раздела биообъект—воздух часть излучения отражается (так называемое френелевское отражение), а остальная часть проникает в биоткань. Объемное рассеяние является причиной распространения значительной доли излучения в обратном направлении (обратное рассеяние). Хорошо известно, что основным источником рассеяния света в биотканях является различие в значениях показателей преломления различных компонентов биотканей (митохондрий, ядра, органелл и цитоплазмы клеток, внутритканевой жидкости и структурных элементов соединительной ткани — коллагеновых и эластиновых волокн). Очевидно, что эти универсальные принципы взаимодействия света и биологической ткани в полной мере могут описывать и оптическую модель роговицы. Основные отличия будут заключаться в количественных характеристиках взаимодействий, связанных с необходимостью обеспечения существенно большей прозрачности роговицы относительно большинства тканей организма.

С оптической точки зрения биологические ткани можно разделить на два больших класса. Оптические свойства сильно рассеивающих или оптически мутных тканей (кожа, мышцы, стенки сосудов, кровь, склера) могут быть хорошо описаны моделью многократного рассеяния скалярных волн в случайно неоднородной среде с поглощением. Оптические свойства слабо рассеивающих или прозрачных (роговица, хрусталик) тканей описываются моделью однократного (или малократного) рассеяния упорядоченной среды с плотной упаковкой рассеивателей, которые содержат поглощающие центры.

Роговица как биологический объект с высокой степенью упорядоченности вещества обладает выраженной оптической анизотропией, влияющей и на светорассеяние. Анизотропные оптические свойства большинства биологических тканей объясняются строением последних, в частности сочетанием коллагеновых, эластиновых, ретикулярных волокон, а также их основного вещества. Характерным компонентом структуры фиброзных тканей являются коллагеновые волокна, которые входят в состав разных видов соединительной ткани и определяют их прочность на разрыв. В рыхлой неоформленной волокнистой соединительной ткани коллагеновые волокна располагаются в различных направлениях в виде волнообразно изогнутых тяжей толщиной 1—3 мкм и более. Коллагеновые волокна состоят из пучков параллельно расположенных фибрилл толщиной в среднем 50—100 нм, связанных между собой гликоз-аминогликанами и протеогликанами. Толщина волокон зависит от числа фибрилл. Коллагеновые фибриллы обладают поперечной исчерченностью — чередованием темных и светлых участков с периодом повторяемости 64—70 нм. В пределах одного периода находятся внутренние (вторичные) полосы шириной 3—4 нм. Основное вещество — это условно студнеобразная среда, заполняющая пространство между клетками и волокнами соединительной ткани. Показатель преломления коллагеновых волокон находится в пределах 1,44—1,47, а показатель преломления основного (базового) вещества — 1,33—1,36. Поэтому, исходя из общего описания строения биологической ткани, можно считать, что она обладает оптической анизотропией, обусловленной анизотропией формы. Наличие хиральных молекул в составе биологических тканей (оптически активных белков или метаболических веществ, поступающих в ткань) обусловливает не только линейную, но и круговую анизотропию ткани. Для сильно рассеивающих тканей круговая анизотропия в оптических характеристиках не проявляется.

Анизотропные свойства роговицы усиливаются в результате существующего в ней постоянного механического напряжения, направленного по касательной к ее поверхности и связанного с уровнем внутриглазного давления (ВГД). Доказано, что величина оптической анизотропии зависит не только от уровня ВГД, но и от локальных биомеханических свойств и толщины роговицы и может существенно изменяться в объеме [34].

Важным элементом взаимодействия проходящего света и биологической ткани является люминесцентное переизлучение структурными белками. Стоксовская люминесценция присуща большинству структурных белков, в том числе коллагену, составляющему основу роговицы. В последних исследованиях было доказано, что характер этой люминесценции также зависит от биомеханического состояния тканей роговицы, а значит и опосредованно влияет на направленность светорассеяния [35—37].

Таким образом, оптическая анизотропия роговицы, определяемая структурой входящих в ее состав тканей, биомеханическим статусом и уровнем ВГД, в аспекте рассмотрения ее прозрачности будет выражаться в возникновении направленности светорассеяния. При этом такая направленность хорошо описывается оптической индикатрисой светорассеяния (абстрактная фигура, описывающая анизотропию в объеме). В общем случае для роговицы оптическая индикатриса светорассеяния резко вытянута вдоль нормали к поверхности роговицы в каждой ее точке [38].

Как уже указывалось выше, именно оптическая неоднородность биологических тканей обусловливает процессы светорассеяния при распространении в них излучения. Рассеянное излучение зависит от формирующих биологическую ткань факторов, таких как размеры и форма структурных элементов, их ориентация, оптические постоянные и другие параметры. Для того чтобы иметь возможность извлечь эту информацию и интерпретировать результаты экспериментов по светорассеянию, предпринимались попытки построения адекватной оптической модели соответствующей ткани и на ее основе решения задачи распространения излучения в данной среде. Точная теория о поглощении и рассеянии света биологическими тканями и частицами произвольных размеров и структур отсутствует, однако важную информацию об их оптических свойствах можно получить на основе анализа моделей светорассеяния.

Сложность строения биологических тканей, высокая концентрация рассеивающих частиц, неоднородность их размеров, формы и оптических постоянных делают задачу построения адекватной оптической модели довольно сложной. Что касается роговицы, то данные литературы указывают на то, что даже в тех случаях, когда физико-математическая модель отражала ее многослойное строение в целом, каждый из слоев рассматривали отдельно, без учета их возможного оптического взаимодействия при светорассеянии. Кроме этого, не учитывали естественные геометрические пропорции роговицы и особенности ее формы.

В настоящее время существует множество моделей для описания процесса светорассеяния роговицей. Некоторые авторы рассматривают эту структуру как протеогликановую сеть, окутывающую и связывающую коллагеновые фибриллы [39]. Подробный анализ существующих физико-математических моделей взаимодействия пучка света с веществом роговицы не выявил возможных причин такой корреляции [38, 40—44].

Первым значительным шагом к визуализации и оценке состояния всех слоев роговицы явилось создание щелевой лампы как инструмента описания структур в проходящем свете. В 1918 г. A. Vogt впервые при помощи отражения лучей от задних слоев роговицы смог рассмотреть мозаичную форму клеток ее заднего эпителия [45]. Используя схожий метод, H. Graves в 1924 г. описал некоторые возрастные изменения этого слоя [46]. В 1961 г. D. Maurice разработал спектральный микроскоп для прижизненного исследования биологических тканей, минимизировав нежелательные блики в рабочем поле [47, 48]. R. Laing, а затем H. Kaufman адаптировали прибор для работы в условиях как глазного банка, так и клиники [49, 50].

Разберем основные методы подробнее. Одним из простейших методов оценки состояния роговицы является визуализация, заключающаяся в прямом осмотре глаза без каких-либо специальных приборов либо с использованием простейших средств облегчения осмотра, таких как дополнительно подведенное освещение, приборы для детального осмотра внутренностей глаза (линзы, рефлекторы, офтальмоскопы), медикаментозные препараты для расширения зрачка и средства регистрации с помощью фотосъемки (например, ретроиллюминационная фотография глаза [51]). Наряду со своей простотой этот метод лежит в основе других, более сложных методов исследования глаза. С его помощью относительно достоверно можно определить в основном грубые изменения структуры роговой оболочки.

Биомикроскопия с помощью щелевой лампы заключается в наблюдении прозрачных структур глаза через микроскоп при освещении пучком света. При этом можно менять не только высоту микроскопа относительно направления освещения, но и угол обзора [52]. Данная техника позволяет проводить осмотр и оценку прозрачности роговицы, хрусталика и стекловидного тела [52, 53].

В последствии в работе Э. Финчема [54] была описана возможность фотосъемки изображения роговицы и хрусталика с использованием щелевой лампы. Однако описанный метод не получил распространения из-за сложности осуществления и невозможности достижения необходимой четкости фотоснимка.

В 1940 г. в работе Х. Голдмана [55] было предложено устройство, позволяющее при фотосъемке избежать нежелательных артефактов. Вместо обычного фотоаппарата в нем используется специальная камера, в которой пленка наматывается на барабан, способный вращаться по мере перемещения прибора вдоль оптической оси осветителя. При этом в сопряженный фокус объектива такой фотокамеры через щелевую диафрагму последовательно попадает изображение всех точек оптического среза, которое фиксируется на пленке. Диафрагма дает изображение участка оптического среза, лежащего в фокальной плоскости объектива. Угол между лучом осветителя и положением объектива камеры составляет 45°, а диафрагма — 1:4. Это устройство имело существенный недостаток: помимо сложности конструкции, оно не позволяло делать моментальную фотографию.

Снимки, получаемые при фотоофтальмометрии (способ, основанный на фотографировании линзы под углом 40° относительно направления пучка света щелевой лампы), описанные в работе А.И. Дашевского [56], не были достаточно резкими. Поэтому фотоофтальмометрия не получила широкого распространения. Затем она была модифицирована за счет изменения расположения фотоаппарата для получения четкой фотографии всех отделов глаза сразу [57].

Указанные методы исследования роговицы основаны на светопроведении, светорассеянии и отражении лучей внутри слоистой структуры на основе различий в оптических индексах на границе сред и биологической ткани. Долгое время именно биомикроскопия оставалась единственным методом качественной оценки прозрачности роговицы и светорассеяния.

В 70-х годах прошлого столетия была создана установка для оценки прозрачности оптических сред с помощью щелевой лампы [58, 59], в основу которой был заложен принцип, разработанный австрийским картографом Т. Шаймпфлюгом. Изображение наклонно расположенного объекта в щелевой лампе формируется так, что плоскости объекта, его изображения и объектива пересекаются. В результате проводится фотографирование сагиттального изображения переднего сегмента глаза таким образом, что фокус расположен между передней и задней поверхностью роговицы. Таким образом, шаймпфлюг-камера может вращаться на 180° вдоль оптической оси. Полученные таким образом снимки анализировали с помощью денситометрического метода.

В настоящее время для неинвазивного исследования прозрачности роговицы используют объективные методики, основанные либо на принципе денситометрии оптических срезов, либо на измерении интенсивности интегрального отражения (рефлектометрии). Рефлектометрические методы исследования тканей роговицы появились сравнительно недавно с развитием конфокальных (в том числе и когерентных) методов микроскопии, однако «золотым стандартом» остается денситометрический метод анализа яркости оптического среза. На современном уровне техники денситометрический анализ прозрачности роговицы реализован как опция при кератотопографических иследованиях с использованием камер типа шаймпфлюга, а современная интерпретация денситометрических данных основана на предложенных физических и математических моделях роговицы [40]. Интерпретации данных светорассеяния часто базируется на тонких процессах оптического взаимодействия ткани и светового пучка [44].

Следует отметить, что прямые измерения интенсивности светорассеяния многослойных сферических объектов с различными оптическими характеристиками отдельных слоев (к которым относится и роговица) имеют определенные погрешности. Сложные оптические взаимодействия в многослойной модели могут приводить к ложному изменению яркости более прозрачных объектов, находящихся за интенсивно рассеивающим слоем, особенно выраженным на границе различных слоев.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.