Для диагностики инфекционных процессов глазной поверхности (ГП) широко используют стандартное бактериологическое исследование. Однако в определенной доле случаев данный метод оказывается не информативен. Отмечено, что при клинически диагностированных инфекционных поражениях ГП этиологический агент при проведении стандартного бактериологического исследования обнаруживают в диапазоне от 67 до 98% случаев [1, 2].

Учитывая связь инфекционных процессов с локальной гипертермией [3, 4], при стандартном бактериологическом исследовании микроорганизмы культивируют при температуре 37 °C, а расширенные температурные протоколы применяют редко [5, 6]. Однако температурный оптимум роста микроорганизмов на ГП может не совпадать с лабораторным, что обусловлено особенностями теплообмена глаза. Признаки температурной дисрегуляции ГП могут возникнуть даже при незначительных ухудшениях иннервации и трофики, чему способствуют постоянный контакт ГП с окружающей средой, а также то, что роговица, занимающая значительную площадь ГП, имеет бессосудистый статус, естественным образом ограничивающий ее вовлеченность в иммунную систему.

Температура ГП в норме и при различной патологии исследуется методом инфракрасной термографии (ИКТ) [7]. Отечественными и зарубежными авторами, использующими ИКТ, отмечено снижение температуры ГП при глаукоме [8—10]. При помощи ИКТ выявлена сопровождающая синдром «сухого глаза» (ССГ) температурная дисрегуляция, заключающаяся в увеличении градиента температуры на ГП, что обусловлено высокой скоростью испарения слезной жидкости [11, 12]. В связи с этим ожидаемо, что на ГП даже при инфекционных процессах, обыкновенно сопровождающихся гипертермией, могут доминировать микроорганизмы со сниженным температурным оптимумом культивирования. Такие микроорганизмы, обладающие способностью адаптироваться к относительно низким температурам, относят к психротолерантным [13].

Таким образом, недостаточная информативность стандартного бактериологического исследования при инфекционных поражениях ГП может быть связана с условиями стандартного бактериологического исследования, предусматривающими относительно высокую температуру культивирования.

С учетом вышеизложенного целью работы явилось изучение в рамках поискового исследования состава и свойств микроорганизмов ГП, выделенных в различных температурных условиях культивирования, у пациентов с инфекционными кератитами (ИК) и здоровых добровольцев без офтальмопатологии.

Материал и методы

В данном поисковом исследовании было задействовано 15 человек, разделенных на две группы. В 1-ю группу вошли 10 пациентов с различными инфекционными поражениями ГП, а во 2-ю группу (условная норма) — пять участников без патологических изменений ГП (табл. 1). В выборку не включали пациентов, получающих антибактериальную терапию или завершивших ее менее чем за 14 дней до начала настоящего исследования.

Таблица 1. Характеристика наблюдений

Примечание. OD — правый глаз, OS — левый глаз, OU — правый и левый глаз, СКП — сквозная кератопластика, ПОУГ — первичная открытоугольная глаукома, ИК — инфекционный кератит.

У всех участников было получено добровольное информированное согласие на проведение исследования.

Термография. Бесконтактную инфракрасную термографию проводили тепловизором Testo 875 (Testo SE & Co. KGaA, Германия) при комнатной температуре (24 °C) и влажности 50% на кушетке в горизонтальном положении. Перед исследованием участник 15 мин находился в помещении для адаптации к условиям исследования. Тепловизор устанавливали горизонтально на штативе на высоте 110 см от пола. Исследование проводили с использованием температурной шкалы с автоматическим распознаванием горячей/холодной точки. Пространственное разрешение термограммы составляло 320×240 пикселей, температурное — 0,1 °C.

Микробиологическое исследование. Микробиологическое исследование проводили в соответствии с оригинальным протоколом, который предусматривал выделение чистых культур микроорганизмов на питательных средах при двух температурных режимах (37 °C и 24 °C).

Забор материала. Забор биологического материала с ГП производили стерильным зонд-тампоном при первичном осмотре. При наличии инфильтрата роговицы материал получали с поверхности инфильтрата, в противном случае — с бульбарной конъюнктивы. В 1-й группе забор осуществляли с пораженного глаза, а во 2-й группе — случайным образом с одного глаза. Пробы получали последовательно трижды.

Получение накопительной культуры. Первые две пробы помещали в две пробирки с жидкой средой для бактериальной флоры объемом 2 мл (Becton, Dickinson and Company Sparks, США; BD BACTEC Standard/10 Aerobic/F Culture Vials), а третью — в пробирку с жидкой средой для грибковой флоры [DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), Gibco, с пенициллином и стрептомицином]. Пробирки с биологическим материалом в питательной среде обогащения для бактериальной флоры хранили в двух вариантах температур: одну — в термостате при 37 °C в течение 2 сут, а другую — при 24 °C в течение 5 сут. Пробирку с биологическим материалом в среде обогащения для грибковой флоры хранили при температуре 24 °C в течение 5 сут.

Посев на твердые питательные среды. Из каждой пробирки со средой обогащения для бактериальной флоры производили посев на две чашки Петри: с кровяным агаром и хромогенным агаром UriSelect 4 (Bio-Rad Laboratories, США). Из пробирки со средой обогащения для грибковой флоры осуществляли посев материала на чашку Петри с хромогенным агаром для грибов Candida (Liofilchem, Chromatic Candida). Затем чашки Петри помещали в температурные условия, соответствующие температурам хранения пробирок с накопительной культурой.

Идентификация. Результаты роста на твердых питательных средах оценивали на 2-й и 5-й день культивирования. Для идентификации микроорганизмов использовали комплекс микробиологических методов, включая микроскопию, биохимические тесты, масс-спектрометрию.

Импрессионная проба и ее визуализация при помощи сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с лантаноидным контрастированием. Импрессионную пробу проводили при первичном осмотре. Для забора биологического материала использовали стерильный гибкий полистироловый носитель. Носитель с адгезированными микробными и эпителиальными клетками обрабатывали реактивами из набора для контрастирования BioREE-B в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя (ООО «Глаукон», Россия). Затем носитель с адгезированными эпителиальными и микробными клетками закрепляли на предметном столике и размещали в камере сканирующего электронного микроскопа EVO LS 10 (Zeiss, Германия). Наблюдения проводили в режиме низкого вакуума при ускоряющем напряжении 21 кВ и токе на образце 60—320 пА. Использовали детектор обратно-рассеянных электронов (BSE).

Статистическую обработку результатов проводили с применением методов описательной статистики: вычисления среднего значения, медианы и квартилей.

Результаты

Температура ГП и вероятные температурные условия существования микроорганизмов. По результатам термографического исследования было выявлено, что средняя температура ГП в группе условной нормы составляет 33,65 °C (диапазон температур от 33,2 до 34,2 °C; Q1 = 33,43 °C; Q3 = 33,68 °C). Значение средней температуры ГП в группе условной нормы в дальнейшем было принято нами за значение «нормальной» температуры ГП. Отклонение температуры исследуемого глаза от нормальной температуры и от температуры контралатерального глаза в этой группы было незначительным — в пределах 0,6 °C.

В свою очередь, средняя температура ГП пораженного глаз в 1-й группе (инфекционное поражение роговицы) была выше и составила 35,36 °C (диапазон температур от 33,1 до 36,7 °C; Q1 = 34,3 °C; Q3 = 36,2 °C). Отклонение температуры исследуемого пораженного глаза от нормальной температуры и от температуры контралатерального глаза в этой группе было более выраженным: в пределах 2,9 °C и 1,2 °C соответственно.

Несмотря на то что инфекционный процесс обычно сопровождается локальной гипертермией, нами были выявлены случаи ИК, при которых температура пораженного глаза оказывалась ниже температуры контралатерального глаза. В соответствии с отклонением температуры исследуемого пораженного глаза от температуры контралатерального глаза в 1-й группе (инфекционное поражение роговицы) ретроспективно нами были выделены две подгруппы. В первую подгруппу (1a — ИК с «холодным» пораженным глазом) мы отнесли наблюдения №3, 6, 7 с относительной гипотермией ГП, при которой температура пораженного глаза оказалась ниже температуры контралатерального глаза, а во вторую подгруппу (1b — ИК с «горячим» пораженным глазом) — наблюдения №1, 2, 4, 5, 8—10, где температура пораженного глаза оказалась выше температуры контралатерального глаза.

Температурный оптимум роста микроорганизмов роговицы, проанализированный in vitro при помощи оригинального микробиологического исследования. В результате проведения оригинального микробиологического исследования в 14 из 15 наблюдений на ГП были обнаружены микроорганизмы: у всех пациентов из 1-й группы (ИК) и у четырех из пяти исследуемых из группы условной нормы. Видовой состав микроорганизмов и температура, при которых они были культивированы, приведены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты оригинального микробиологического исследования

Интересно отметить, что большинство микроорганизмов успешно росли при температуре 24 °C. Такое свойство микроорганизмов свидетельствует о психротолерантности. Это свойство у исследуемых микроорганизмов проявлялось как облигатно, в том случае, если колонии выделялись исключительно при 24 °C (три наблюдения из 1-й группы), так и факультативно, в тех случаях, когда рост колоний происходил и при 24 °C, и при 37 °C (семь наблюдений из 1-й группы и три наблюдения из 2-й группы). При этом были зафиксированы два варианта факультативной психротолерантности: в первом варианте (четыре наблюдения из 1-й группы) наблюдали ранний синхронный рост микроорганизмов в обоих температурных режимах (т. е. признаки психротолерантности были явно выраженными); во втором варианте (три наблюдения из 2-й группы и три — из 1-й группы) рост микроорганизмов при 24 °C был более поздним (т. е. признаки психротолерантности были выражены слабо).

Морфология микроорганизмов роговицы, полученная при помощи СЭМ с лантаноидным контрастированием. Во всех случаях, в которых с ГП микробиологическим методом были выделены микроорганизмы, в импрессионной пробе они также были обнаружены: как в норме (рис 1, в), так и при инфекционных процессах (рис. 1, а, б). При этом морфологические параметры (табл. 3) микроорганизмов в импрессионных пробах в подавляющем большинстве случаев (за исключением наблюдений №1 и 3) совпадали с эталонным описанием микроорганизмов, выделенных при проведении оригинального микробиологического исследования. Морфологические эталоны оценивались по атласу эталонных культур, визуализированных методом СЭМ с лантаноидным контрастированием [14].

Рис. 1. Изображение материала импрессионной пробы, полученное при помощи СЭМ (BSE, лантаноидное контрастирование).

а — наблюдение №6: множественные грибоподобные (дрожжеподобные) клетки; б — наблюдение №8: множественные палочковидные микроорганизмы с умеренным удлинением без образования спор, с четкими контурами внешних оболочек; в — наблюдение №14: коккоморфные микроорганизмы.

Таблица 3. Результаты визуализации материала импрессионных проб, полученные при помощи СЭМ (BSE, лантаноидное контрастирование)

Анализ условий температурного оптимума роста микроорганизмов в зависимости от теплового статуса ГП. В исследуемых группах был проведен совокупный анализ данных термографии ГП и данных оригинального микробиологического исследования (рис. 2). Выявлено, что в норме (см. рис. 2, зеленый фон) имело место незначительное отклонение температуры исследуемого глаза от нормального показателя и от температуры контралатерального глаза, при этом признаки психротолерантности (т. е. уверенного роста при 24 °C) у выделенных с поверхности роговицы микроорганизмов либо отсутствовали, либо были слабо выражены.

Рис. 2. Распределение температурных оптимумов роста колоний микроорганизмов относительно температуры глазной поверхности (объяснение в тексте).

Микроорганизмы, выделенные с ГП в подгруппе Ia (ИК с «холодным» пораженным глазом; см. рис. 2, III квадрант, синий фон), проявляли признаки облигатной психротолерантности. К облигатно психротолерантным можно отнести и микроорганизмы, выделенные в наблюдении №7, если трактовать появление колоний Staphylococcus epidermidis как сомнительный результат, поскольку этот микроорганизм является распространенным контаминантом, вносимым в пробу с поверхности кожи [15]. Учитывая этот факт, допустимо утверждение, что все микроорганизмы в подгруппе 1a (ИК с «холодным» пораженным глазом) проявляли признаки облигатной психротолерантности.

У всех микроорганизмов, выделенных с ГП подгруппы 1b (ИК с «горячим» пораженным глазом; см. рис. 2, I квадрант, синий и красные фоны), несмотря на повышение температуры пораженного глаза относительно нормы, наблюдали признаки холодовой устойчивости, а именно — факультативной психротолерантности. При этом в подгруппе 1b были выявлены микроорганизмы как со слабо выраженной, так и с явно выраженной факультативной психротолерантностью. Микроорганизмы со слабо выраженной факультативной психротолерантностью были выделены в наблюдениях №5, 8, 9 подгруппы 1b, в которых температура пораженного глаза не превышала норму более чем на 2,5 °C (см. рис. 2, квадрант I, красный фон). С дальнейшим повышением температуры пораженного глаза в подгруппе 1b (см. рис. 2, квадрант I, синий фон) усиливались признаки холодовой устойчивости колоний микроорганизмов. Так, микроорганизмы с явно выраженной факультативной психротолерантностью были выделены в наблюдениях №1, 2, 4, 10, в которых температура пораженного глаза была выше нормальной более чем на 2,5 °C.

Исходя из приведенных наблюдений, как понижение температуры пораженного глаза, так и ярко выраженное повышение его температуры в ответ на инфекционный процесс можно объединить в единую группу случаев, при которых наблюдается явная температурная дисрегуляция ГП (см. рис. 2, синий фон). Такое состояние объединяет наблюдения №1—4, 6, 7, 10 в 1-й группе, именно в этих случаях температурный оптимум роста микроорганизмов смещается в сторону холодовой устойчивости.

Обсуждение

Основным результатом настоящего исследования можно считать обнаружение устойчивого сигнала облигатной психротолерантности при культивировании микроорганизмов, выделенных в группе ИК в случаях гипотермии ГП (в подгруппе 1a — ИК с «холодным» пораженным глазом). Стандартные бактериологические методы исследования не позволили бы обнаружить такие микроорганизмы. Помимо установления факта облигатной психротолерантности микроорганизмов при гипотермии ГП, были выявлены признаки их холодовой устойчивости при ИК, не сопровождающихся понижением температуры пораженного глаза.

При ретроспективном анализе амбулаторных карт пациентов с ИК было выявлено, что у пяти из семи пациентов, объединенных нами в обсуждении в группу с выявленным состоянием тепловой дисрегуляции ГП (см. рис. 2, синий фон), были признаки, потенциально указывающие на нейротрофические нарушения, в частности: лагофтальм, состояние после удаления лицевого нерва, признаки нейротрофического кератита, характеризующиеся выявленным снижением чувствительности роговицы (наблюдения №2, 7, 3, 6, 10 соответственно). При этом в случаях ИК с незначительным повышением температуры пораженного глаза (см. рис. 2, красный фон) таких признаков выявлено не было.

Необходимо отметить, что подавляющее большинство психротолерантных микроорганизмов, которые были идентифицированы в случаях тепловой дисрегуляции ГП, не являются типичными патогенами и их можно отнести к условно-патогенной флоре. Такие микроорганизмы, как Acinetobacter lwoffii, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis, Klebsiella oxytoca, Micrococcus luteus, Pseudomonas luteola, Streptococcus viridans [16—19], хоть и описаны как участвующие в возникновении инфекции (в том числе глазной), но это участие фиксируют при наличии определенной иммуносупрессии [20—26]. Выявленные в наблюдении №1 Achromobacter xylosoxidans и в наблюдении №2 Klebsiella pneumoniae обычно описывают как патогенные для человека. Однако стоит отметить, что инфекционный процесс, вызванный Achromobacter xylosoxidans, зачастую также сопряжен с состояниями различного иммунодефицита [27].

Заключение

Итак, при проведении настоящего исследования было выявлено, что локальная температурная дисрегуляция ГП при ИК, в том числе с нейротрофическими нарушениями в анамнезе, сопровождается феноменом психротолерантности ассоциированных с ней микроорганизмов. Так, в данном поисковом исследовании в случаях ИК с температурной дисрегуляцией ГП на ее поверхности были обнаружены следующие бактерии с психротолерантными свойствами: Acinetobacter lwoffii, Achromobacter xylosoxidans, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Pseudomonas luteola, Streptococcus viridans.

Таким образом, при установлении этиологического фактора инфекционных процессов роговицы следует учитывать, что на ГП могут существовать микроорганизмы, которые эффективно растут при относительно низкой температуре. В качестве практических рекомендаций можно предложить проведение бактериологического исследования при комнатной температуре в тех случаях, когда можно заподозрить явные нарушения трофики роговицы.

Благодарности

Авторы благодарят коллектив лаборатории молекулярной биологии ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России за помощь в проведении комплекса микробиологических методов исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.А., И.Н., Е.Ф.

Сбор и обработка материала: Е.Р., М.К., Д.К.

Написание текста: М.К. Е.Р.

Редактирование: И.Н., С.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.