В мире ежегодно осуществляется более 180 000 трансплантаций роговицы [1]. Очевидно, что спрос в этой области существенно превышает современные возможности доступа хирургов к нативной жизнеспособной роговичной ткани. Решать подобного рода проблемы призваны глазные банки. При этом оптимальная консервация кадаверного материала должна обеспечивать возможность регулярных поставок донорской ткани в лечебные учреждения для плановых и ургентных кератопластик различного вида.
Методы, используемые для консервации донорской роговицы, классифицируются в зависимости от продолжительности хранения как краткосрочные, среднесрочные, долгосрочные и с неограниченным сроком хранения. Это, соответственно, хранение во «влажной камере», гипотермический способ, метод органного культивирования и криоконсервация [2].
Метод хранения во «влажной камере»
Основоположником теории и практики консервации роговицы по праву считается В.П. Филатов, который в 1935 г. предложил метод сохранения глазного яблока во «влажной камере». При этом целый кадаверный глаз хранится в закрытой стерильной банке, наполненной насыщенным влажным воздухом при средней температуре 4 °C [3]. Если время между смертью донора и энуклеацией глаза находится в пределах от 4 до 6 ч, то донорский глаз, сохраненный данным методом, можно хранить и использовать для сквозной кератопластики (СКП) в течение 2 дней, при более длительном промежутке времени — для передней послойной кератопластики (ППКП). Чем короче срок хранения, тем лучше клинические результаты. Главным недостатком способа считается посмертный контакт эндотелиального слоя с измененной влагой передней камеры.
Консервация во «влажной камере» является самым простым и наиболее бюджетным из всех методов хранения. Это выгодно во многих ситуациях, особенно в развивающихся странах, где имеется огромная потребность в донорских роговицах, а дорогостоящие тканевые культуры с последующими бактериологическими тестами, как правило, недоступны. В этих случаях основные усилия должны быть направлены на забор максимального количества донорского материала в кратчайшие сроки после смерти донора. По этой причине кератопластика в таких регионах должна рассматриваться как экстренная операция, а консервация во «влажной камере» до сих пор может считаться методом выбора.
Время хранения глазного яблока во «влажной камере» ограничивается накоплением метаболических субстратов и продуктов обмена веществ в водянистой влаге, в частности лактата [4]. Поэтому следующим важным шагом развития способов хранения стали попытки консервации изолированной роговицы. Все нижеперечисленные методы в подавляющем большинстве подразумевают консервацию изолированного роговичного лоскута.
Гипотермический метод
Наиболее часто используемым методом консервации роговицы является гипотермический. Он широко применяется в Северной Америке, ведущих офтальмологических клиниках России, ряде развивающихся стран.
Принцип, лежащий в основе гипотермической консервации клеток, тканей и органов, базируется на замедлении метаболических процессов при охлаждении в соответствии с теорией Аррениуса. Однако такое замедление не приводит к тотальной остановке аутолитических процессов, и после определенного срока времени, варьирующего в зависимости от размера объекта (от нескольких часов для сердца до более 1 мес для эритроцитов), начинается деструкция ткани [5].
В 1960-х годах был предложен метод хранения роговичного лоскута в сыворотке крови. Вскоре после этого были разработаны синтетические растворы, ионный состав которых напоминал водянистую влагу передней камеры. Они содержали в своем составе хондроитина сульфат и аскорбиновую кислоту [6, 7]. В начале 1970-х годов гипотермический способ хранения корнеосклеральных дисков в растворе Мак-Кэри—Кауфмана (М—К-среде) стал методом выбора при трансплантации роговицы. В основе М—К-среды была культуральная клеточная среда М-199, содержащая 5% декстран 40, HEPES-буфер и антибиотики [8]. Хотя среда создавалась для хранения роговичного лоскута при температуре 4 °C на протяжении 7 дней, наилучший результат имели кератопластики, выполненные в пределах 4 сут после консервации. Даже такой, казалось бы, ограниченный срок хранения оказал большое положительное влияние на логистику поставок роговиц для трансплантации.
В дальнейшем, в 1985 г., H. Kaufman и соавторы усовершенствовали данную среду включением в ее состав осморегуляторных компонентов для снижения отека (K-Sol) [9]. В 1990 г. в России был предложен оригинальный состав отечественной среды для консервации роговицы (пропись Борзенка—Мороз) [10].
В настоящее время для среднесрочной консервации используют также и другие среды: Dexsol, Optisol, Eusol и пр., которые, в сущности, являются производными М—К-среды [11—14]. При заявленном возможном хранении роговицы в этих средах до 14 дней многие банки предпочитают не превышать срок хранения 7 сут.
Нормотермический метод
Нормотермический метод, или метод органного культивирования, позволяет длительно (до 35 дней) сохранять пригодные для СКП донорские роговицы.
Родоначальником метода стал D. Doughman [15, 16], который предложил хранить изолированную роговицу в питательной среде при температуре 34 °C в условиях термостата.
Наиболее распространенной средой для органной культивации является питательная среда Игла с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. Большинство банков включают в состав среды пенициллин, стрептомицин и амфотерицин B. К альтернативным антибиотикам относятся биклин, тазоцин, амикин и нистатин. Не меняют среду во время хранения 40% банков, остальные проводят замену через каждые 1—2 нед. Концентрация декстрана, используемого для купирования отека стромы, во время хранения варьирует от 4 до 8%. Независимо от перечисленных различий результаты трансплантаций сходны. Роговицы обычно хранятся в подобных средах до 4 нед [17], но известны также случаи успешных кератопластик после 7-недельной консервации [18]. По сравнению с гипотермическим хранением, органная культура увеличивает шансы обнаружения бактерий и грибов, которые могут привести к послеоперационной инфекции, будучи вовремя невыявленными. Антибиотики в условиях более высокой температуры действуют эффективнее. Образец среды берется на микробиологическое исследование после 7 дней хранения. В дальнейшем такой скрининг проводится перед трансплантацией.
Обстоятельством, имеющим большое значение при проведении кератопластик высокого риска, является тот факт, что длительная органная консервация приводит к обеднению роговицы антигенпрезентирующими клетками, что снижает процент возможных иммунных реакций [19].
К недостаткам данного метода можно отнести необходимость постоянного экспертного технического наблюдения и относительную дороговизну.
Тем не менее метод широко распространен в странах Западной Европы [20, 21]. Из 66 глазных банков, включенных в каталог Европейской ассоциации глазных банков, 46 использовали органную культуру, 13 применяли гипотермическую консервацию, а 7 использовали оба метода [22].
Криотермический метод
Известным методом длительного хранения корнеосклеральных лоскутов с практически неограниченным сроком является криогенная консервация (сохранение ткани при минусовой температуре), поз-воляющая создать условия для холодового анабиоза [23, 24].
Первые опыты по консервации роговичной ткани при температуре ниже 0 °C провел французский ученый А. Magitot в 1911 г. Он консервировал роговицу при температуре –4°, –6 °С [25]. Эти опыты не увенчались успехом — роговица быстро теряла прозрачность.
В дальнейшем была исследована возможность хранения роговичной ткани в диапазоне от –3 до –20°C [26, 27]. Данный эксперимент выявил невысокий трансплантационный эффект сохраненного материала. В 1946 г. была сделана попытка консервации роговицы в условиях еще более низких температур — до –195 °С [28]. Клиническое применение криоконсервированных данным методом роговичных лоскутов также не увенчалось успехом, поскольку все произведенные СКП завершились помутнением пересаженного трансплантата, а в части случаев и его отторжением.
В дальнейшем были разработаны основные правила криоконсервации, такие как инкубация в крио-протекторных растворах для сохранения жизнеспособности консервированных клеточных элементов и соблюдение соответствующего режима замораживания—оттаивания.
Криоконсервация методом замораживания—оттаивания подразумевает наличие межклеточного раствора в замороженном состоянии (т.е. в кристаллической форме), но сводит к минимуму образование льда внутри клеток, поскольку формирование кристаллов приводит к разрушению клеточных мембран и как следствие — к гибели клетки. Этот эффект достигается охлаждением с контролируемой скоростью в присутствии криопротекторов в нетоксичных концентрациях [29].
В современной хирургии роговицы неуклонно возрастает доля послойных кератопластик, в том числе передних и межслойных, когда для успешного клинического результата не требуется сохранения высокой жизнеспособности донорских клеток, а имеет значение сохранение архитектоники — коллагеновой «матрицы», которая впоследствии заселяется собственными клетками реципиента. В таких случаях оптимальным материалом становится замороженный без криопротектора роговичный материал.
Иранские исследователи докладывают о проведении ими 3-летних клинических исследований с применением криоконсервированного без протектора донорского материала в составе целого глазного яблока. Продолжительность замораживания при температуре –70 °C варьировала от 5 дней до 7 мес. Оттаивание осуществляли поэтапно: сначала в течение 1 ч до 4 °C, затем еще 1 ч при комнатной температуре. Далее авторы выкраивали корнеосклеральные лоскуты. Пациентам с кератоконусом была выполнена глубокая передняя послойная кератопластика (ГППК), которая в подавляющем большинстве случаев завершилась прозрачным приживлением трансплантата [30].
Результаты успешного клинического применения криоконсервированной при температуре –20 °C роговичной ткани приводят ученые из Китая. Пациентам с краевой дегенерацией Терьена была выполнена периферическая ГППК. Период наблюдения составил около 2 лет. Большинство трансплантатов прижилось прозрачно [31].
Также ацеллюлярный материал, сохраненный без криопротектора, может быть методом выбора в ургентных случаях, когда необходимо сохранить глаз как орган и отложить оптическую реабилитацию на более поздний период.
Как сообщают корейские авторы, успешная ГППК была выполнена пациентке с угрозой перфорации роговицы. В качестве трансплантационного материала была использована донорская роговица, консервированная в среде Optisol-GS и сохраненная при температуре –70 °C в течение 4 нед. Через 6 мес после операции трансплантат оставался прозрачным [32]. Кроме того, их коллеги из Японии сообщают еще об одном благоприятном исходе ГППК, выполненной пациенту с десцеметоцеле и СКП в анамнезе. Авторы сохраняли роговицу в составе целого глазного яблока при температуре –80 °C в течение 3 мес. Далее глазное яблоко последовательно оттаивали при 20 °C в течение 4 ч, при 4 °C в течение 4 ч и затем при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы уменьшить повреждение ткани от перепада температур. После этого выкраивали корнеосклеральный лоскут и хранили до операции в растворе Optisol-GS [33].
Имеются сообщения об успешном случае проведения ургентной кератопластики пациенту с перфорацией роговицы, выполненной криоконсервированным роговичным лоскутом, полученным после проведения автоматизированной эндотелиальной кератопластики. Материал хранили при температуре –80 °C в течение 3 мес в растворе Optisol-GS. Хотя трансплантат прижился непрозрачно, структурная целостность роговицы была восстановлена [34].
Интересной областью применения криогенизированной роговичной ткани может быть «страховочное» сохранение материала, изъятого в ходе проведения операции ReLEx. Реимплантация данного материала дает возможность вернуть пациенту исходную толщину роговицы, а значит, и дооперационное значение рефракции, что очень важно при развитии пресбиопии или пострефракционной хирургической эктазии. Сохраненный и невостребованный материал также может быть использован для аллогенной трансплантации подходящему реципиенту. Данные по отработке методов хранения таких микролоскутов и их успешному клиническому применению приводят сингапурские исследователи [35]. Последние использовали для хранения лоскутов криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО), однако логично предположить, что успех в данном случае не определяется напрямую сохранностью клеточных элементов, хотя, возможно, играет определенную роль.
Для осуществления СКП и задних кератопластик криогенизация материала должна в обязательном порядке включать обработку криопротекторным агентом.
Криопротекторы — это вещества, ограничивающие или устраняющие повреждающее действие замораживания и оттаивания на живые клетки и ткани. Они препятствуют формированию внутриклеточного льда и дегидратации путем образования комплексов с биокатионами и стабилизации конформации белков, что уменьшает повреждающий эффект гиперконцентрации солей.
Криопротекторы можно разделить на две категории:
1. Мембранопроникающие, которые проникают внутрь клетки и препятствуют формированию кристаллов льда за счет образования водородных связей с молекулами воды, — глицерин, ДМСО, пропиленгликоль, этиленгликоль.
2. Мембранонепроникающие, которые не проникают внутрь клеток, а оказывают свое действие путем снижения скорости образования кристаллов и защиты клетки от осмотических перепадов, — сахароза, трегалоза, фиколл, альбумин, поливинилпирролидон, декстран [36—39].
Исследования по криоконсервации роговичной ткани развивались в нескольких направлениях: изменение скорости охлаждения, варьирование температурного режима, оптимизация выбора криопротекторных растворов и их концентраций [40, 41].
Установлено, что только медленное охлаждение и быстрое размораживание сохраняют максимальную жизнеспособность эндотелия [42].
Из криопротекторов максимальную эффективность в плане сохранения жизнеспособности эндотелия показывают ДМСО и полиэтиленоксид с молекулярной массой 400 (ПЭО-400) [43, 44]. Однако количество выживающих эндотелиальных клеток часто все равно не достигает значений, необходимых для широкого внедрения этого метода в клиническую практику.
Во второй половине XX века производились интенсивные поиски оптимальных криопротекторов. Результаты экспериментальных и клинических исследований противоречивы [45—49]. Первоначальный оптимизм 60—70-х годов сменился скептицизмом, и на сегодняшний момент становится понятно, что крио-генизация донорской роговицы для СКП может быть успешной лишь при очень высоких «стартовых» значениях плотности эндотелиальных клеток (ПЭК) [50].
Перспективным может оказаться подход, при котором используется декстран в качестве мембранонепроникающего криопротектора. По данным М. Halberstadt и соавторов, после размораживания и недельного органного культивирования все слои роговицы были структурно сохранны, но ПЭК при этом составила 1300±360 кл/мм2 [51]. Необходимы дальнейшие экспериментально-клинические исследования, чтобы сделать вывод о результативности такого метода криогенизации.
Витрификация является альтернативным методом сохранения роговицы при минусовых температурах. В этом случае удается миновать ледообразования в образце в целом (внутри и вне клеток). Однако опасность для клеток эндотелия может возникать из-за длительного контакта с криопротекторами и приводить к токсическим реакциям [29]. Время, необходимое для отмывки от токсичного вещества в этом случае, остается слишком большим для того чтобы глазные банки приняли метод витрификации на вооружение [50, 52].
Заключение
В современной деятельности глазных банков основными методами хранения донорских корнеосклеральных лоскутов являются среднесрочный метод гипотермии и долгосрочный метод нормотермической консервации, которые обеспечивают адекватное сохранение роговичной ткани и ее эндотелиального слоя для успешных сквозных и послойных трансплантаций роговицы, а также позволяют осуществлять планомерные поставки кадаверных корнеосклеральных лоскутов из глазных банков в лечебные учреждения для плановых и экстренных реконструктивных вмешательств.
Возможно, непрекращающиеся работы в направлении оптимизации протоколов заморозки приведут к появлению достаточно эффективного способа длительного сохранения роговичного эндотелия. Однако на сегодняшний день сложность метода и значительное повреждение эндотелиальных клеток в процессе хранения ограничивают использование криоконсервированной роговицы для сквозных кератопластик, оставляя за криогенным хранением «нишу» материала для различных видов передних послойных и межслойных операций и ургентных вмешательств.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Труфанов Сергей Владимирович — д-р мед. наук, и.о. заведующего отделением патологии роговицы
e-mail: trufanov05@mail.ru