ABCA4 — один из основных генов, мутации которого ассоциированы с различными наследственными заболеваниями сетчатки (НЗС), такими как болезнь Штаргардта (БШ), палочко-колбочковая дистрофия (ПКД) и пигментная абиотрофия. Ген ABCA4 кодирует белок ABCR4, который является переносчиком N-ретинилиден-фосфатидилэтаноламина через мембрану диска фоторецептора и необходим для рециркуляции ретиналя, играющего важную роль в зрительном цикле.

Мутации в гене АВСА4 являются наиболее распространенными причинами Б.Ш. Молекулярный анализ гена ABCA4 привел к идентификации более чем 900 мутаций (72% выявлены при БШ), ассоциированных с дистрофиями сетчатки [1]. Высокая гетерогенность аллелей в пределах 50 экзонов гена АВСА4 затрудняет возможность прогнозирования тяжести заболевания [2]. Однако в зависимости от влияния на структуру и функции белкового продукта мутации гена АВСА4 можно условно подразделить на мягкие, умеренные и тяжелые, обусловливающие относительно легкие или тяжелые формы заболевания. Такую классификацию предложили Ф. Кремерс и соавторы на основе анализа многочисленных клинико-генетических наблюдений НЗС [3]. Подобная систематизация до сих пор сохраняет актуальность, позволяя прогнозировать клиническую картину заболевания у большинства пациентов в зависимости от выявленных генетических дефектов гена АВСА4 [2, 4]. В настоящее время такая концепция является общепринятой [5, 6], позволяя унифицировать профессиональный язык офтальмологов и генетиков, изучающих вопросы клинико-генетических корреляций при мутациях в гене АВСА4. Таким образом, тяжесть фенотипа может быть обусловлена тяжестью мутантной аллели [7, 8].

p.G1961E — однонуклеотидная замена c.5882G>A в 42-м экзоне, эффект которой заключается в уменьшении АТФазной активности АВСR4-переносчика, классифицируется как умеренная и является одной из самых частых мутаций в гене АВСА4 [9, 10]. Частота встречаемости варьирует в зависимости от популяции: обнаружена у 10% пациентов с БШ — выходцев из Европы, частота встречаемости в общей популяции европейцев составляет примерно 0,2% [11].

Цель исследования — оценить клинико-генетические корреляции у пациентов с НЗС с мутацией p. G1961E в гене АВСА4.

В исследование включены 20 пациентов с НЗС (40 глаз) с мутацией p. G1961E в компаунд-гетерозиготном состоянии.

Клинические исследования включали стандартные и дополнительные офтальмологические методы: кинетическую и статическую периметрию в пределах 60° поля зрения (программа macula examination, Octopus 900, «Interzeag AG», Швейцария), спектральную оптическую когерентную томографию сетчатки (ОКТ) (протоколы cross line, ММ5, ONH и 3D Disc) (томограф RTVue-100, «OPTOVUE», США), аутофлюоресценцию (АФ) («Heidelberg Engineering GmbH», Германия), регистрацию максимальной ганцфельд-электроретинограммы (гЭРГ) и мультифокальной ЭРГ (мф-ЭРГ) («Tomey ЕР-1000 Multifocal», Германия).

Высокопроизводительное параллельное секвенирование кодирующих (экзонных) последовательностей и прилежащих участков интронов генов ABCA4, ELOVL4, PROM1, CNGB3 проводили при помощи прибора Ion Torrent PGM («Life Technologies», США).

Для обогащения образцов ДНК фрагментами целевых участков генома методом AmpliSeq использовали два пула праймеров (в общей сложности 294 пары), обеспечивающих полное покрытие экзонов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 и 99-процентное покрытие прилежащих интронных последовательностей протяженностью не менее 100 п.н. В состав панели включены 33 пары праймеров для секвенирования известных на сегодняшний день минорных экзонов ABCA4 [12].

Результаты секвенирования анализировали с использованием программного обеспечения Torrent Suite в составе: Base Caller (первичный анализ результатов секвенирования), Torrent Mapping Alignment Program — TMAP (выравнивание последовательностей относительно референсного генома NCBI build 37 — hg19), Variant Caller (выявление вариаций нуклеотидных последовательностей). Аннотацию функционального значения генетических вариаций и фильтрацию известных полиморфизмов проводили с помощью компьютерной программы ANNOVAR. Визуальный анализ данных, ручную фильтрацию артефактов секвенирования и выравнивание последовательностей осуществляли с применением программы Integrative Genomic Viewer — IGV. Достоверность выявления мутаций валидирована секвенированием ДНК по Сэнгеру.

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0.

По результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования мутация p. G1961E в гене ABCA4 обнаружена у 20 больных, что составило 37% от общего числа всех пациентов, наблюдающихся с НЗС и имеющих по крайней мере одну мутацию в гене АВСА4.

У 8 пациентов с БШ (№ 1—7) (см. таблицу)

Фенотип БШ у этих пациентов характеризуется началом заболевания в возрасте 10 лет—21 год, медленным прогрессированием в течение 24—59 лет наблюдения с потерей остроты зрения в среднем на 0,025±0,008 в год. Динамические данные 2 пациентов (№ 7.1 и 7.2) не оценивали в связи с коротким сроком наблюдения. У пациентов № 2—6 отмечены умеренные функционально-структурные изменения: острота зрения 0,08—0,25, центральная абсолютная/относительная скотома в пределах 7—20°, потеря эллипсоидной зоны фоторецепторов в макулярной зоне по данным ОКТ 2,94±0,64 мм. У пациента № 1 выявлены более выраженные изменения, соответствующие тяжелой форме заболевания: потеря эллипсоидной зоны на всем протяжении ОКТ-среза, центральная скотома в пределах 30° сочетались с нормальными периферическими границами поля зрения (см. рисунок).

Однако у всех пациентов этой группы (за исключением пациента № 2) отмечены выраженные в разной степени отклонения от нормы параметров гЭРГ (снижение амплитуды, увеличение латентности волн, а и в, межокулярная асимметрия этих показателей). Во всех случаях при регистрации мф-ЭРГ отмечены снижение плотности и нарушение топографии биопотенциала центральной зоны сетчатки, различные по степени (от умеренных до резко выраженных) и площади (№ 2, 4, 5, 7.1, 7.2 — в пределах фовеа, парафовеа и перифовеа, № 1, 3, 6 — с захватом всей центральной зоны сетчатки до 30°).

У пациентов № 7.1 и 7.2 при небольшом сроке заболевания наблюдается диссоциация между структурно-функциональными и электрофизиологическими показателями: при незначительных функциональных и морфологических нарушениях изменения гЭРГ достаточно выражены, что позволяет предположить прогрессирование заболевания с течением времени.

У 6 пациентов (№ 8—13) мутация p. G1961E выявлена в сочетании с другими миссенс-мутациями (p.N1805D; p. R1640W; p. P1088T; p. L541P; p. P1380L; p. R1640Q). Фенотип Б.Ш. у этих пациентов (кроме № 13) соответствует более легкой форме заболевания с поздним началом (18—43 года), остротой зрения 0,06—0,3 при длительности заболевания 15 лет—32 года и умеренными структурными изменениями сетчатки (потеря эллипсоидной зоны фоторецепторов в макулярной зоне по данным ОКТ в диапазоне 1,4—4,9 мм. У пациента № 13 при позднем начале (32 года) и длительностью заболевания 13 лет отмечены выраженные морфофункциональные изменения (см. таблицу). В 2 случаях (№ 9 и 11) наше наблюдение ограничено длительностью заболевания 3 года—5 лет.

У всех пациентов этой группы параметры гЭРГ оставались в пределах нормальных значений, изменения мф-ЭРГ ограничивались зоной 1—3 «кольца», т. е. не выходили за пределы перифовеа. Исключение составил случай № 13, когда выраженные нарушения параметров мф-ЭРГ захватывали всю исследуемую этим методом зону сетчатки (от 0 до 30°).

У пациента № 16 мутация p. G1961E выявлена в компаунд-гетерозиготном состоянии с нонсенс-мутацией p. V1973X. При начале заболевания в 15 лет и длительности 9 лет БШ характеризуется относительно легким течением: острота зрения 0,2, небольшая центральная скотома 7° и ограниченная потеря эллипсоидной зоны фоторецепторов по данным ОКТ до 1,87/1,8 мм на OD и OS соответственно. У пациента № 17 p. G1961E выявлена с дупликацией со сдвигом рамки считывания (p.L1902fs). При относительно раннем начале (11 лет) и более медленном прогрессировании в течение 16 лет острота зрения с коррекцией составила 0,1, а центральная абсолютная/относительная скотома — в пределах 15°, хотя потеря эллипсоидной зоны фоторецепторов в макулярной зоне по данным ОКТ составила 5,49/5,7 мм.

У 2 пациентов (№ 14 и 15) мутация p. G1961E выявлена в гетерозиготном состоянии с мутациями сайта сплайсинга (c.768−1G>T; c.4540−1G>A). При начале заболевания в 9—18 лет и длительности 24—34 года острота зрения составила 0,1—0,2, атрофия эллипсоидной зоны фоторецепторов в макулярной зоне по данным ОКТ — от 3,28 до 4,84 мм, а центральная абсолютная/относительная скотома ограничена 10—15°. У этих пациентов изменения мф-ЭРГ также ограничены по площади и не выходили за пределы зоны перифовеа (1—3 «кольца»).

У 2 пациентов (№ 18, 19) с диагнозом БШ и ПКД выявлена 1 мутация в гене АВСА4 (p.G1961E).

У этих пациентов зарегистрировано наиболее выраженное из всех проанализированных случаев изменение амплитудно-временных показателей гЭРГ, соответствующее терминам «микро-ЭРГ» или «угасающая ЭРГ». Мф-ЭРГ также демонстрировала резкое нарушение топографии и снижение плотности биопотенциала сетчатки в пределах всей исследуемой зоны от 0 до 30°.

Офтальмоскопическая и аутофлюоресцентная картина глазного дна пациентов № 1—18 соответствовала БШ и у пациента № 19 — ПКД.

Таким образом, различные типы мутаций могут обеспечивать более легкое или тяжелое течение заболевания в зависимости от влияния на структуру и функцию белкового продукта [10].

p.G1961E — одна из самых частых мутаций в гене АВСА4, ее классифицируют как «умеренную». Многие авторы пришли к выводу, что у большинства пациентов с мутацией p. G1961E в гетерозиготном или гомозиготном состоянии фенотип соответствовал более легкой форме БШ [9, 16—19]. У большой группы (13 человек со сроком наблюдения от 9 лет) наших пациентов с мутацией p. G1961E фенотип также соответствует более легкой форме БШ: поражения ограничены центральной зоной сетчатки с небольшими центральными скотомами, при этом параметры гЭРГ оставались в пределах нормальных значений только у 8 пациентов. В целом по данным всех пациентов была установлена обратная связь между степенью повреждения эллипсоидной зоны и показателями остроты зрения (коэффициент гамма-корреляции R=(–)0,72; p<0,05) и световой чувствительности сетчатки MS (R=(–)0,55; p<0,05).

Так как мутация p. G1961E связана с лучшей сохранностью эллипсоидной зоны фоторецепторов по данным ОКТ, структурные изменения ограничиваются парафовеальной областью и не распространяются на всю сетчатку [18, 19], что может объяснить более легкое течение заболевания у пациентов № 2—6 с мутацией p. G1961E и гаплотипом p.[L541P;A1038V], который, как правило, ассоциирован, по данным разных авторов, с тяжелой клинической картиной. Однако у пациентов этой группы выявлены выраженные в разной степени отклонения от нормы параметров гЭРГ, которая характеризует функции палочек и колбочек всей сетчатки в целом. Тем не менее в исследовании W. Cella и соавт. [19] показатели гЭРГ (фотопической и скотопической) у всех пациентов с мутацией p. G1961E в сочетании с гаплотипом [p.L541P; p. A1038V] были в пределах нормы, в то же время у них отмечено снижение амплитуды P50 паттерн-ЭРГ.

Легкая клиническая картина наблюдалась также у пациентов № 16, 17, у которых p. G1961E находится в гетерозиготном состоянии с дупликацией со сдвигом рамки считывания (представляет собой нуль-мутацию) и с нонсенс-мутацией, а также у пациентов № 14, 15 с мутацией p. G1961E в сочетании c мутациями сайта сплайсинга, которые в 95% случаев приводят к фенотипу, подобному нулевой мутации, т. е. к полной утрате функции белка [14, 17].

Хотя p. G1961E считается «мягкой/умеренной» мутацией, в некоторых случаях она может быть ассоциирована с более тяжелым фенотипом, причиной которого, вероятно, может быть вторая мутация. Важно отметить, что у наших пациентов степень тяжести проявления фенотипа в 2 из 14 случаев № 1 и 13 (не учитывая 4 пациентов со сроком наблюдения меньше 9 лет и 2 пациентов с одной мутацией) коррелирует с тяжестью второй мутации. Так, у пациента № 13 с мутацией p. G1961E в сочетании с тяжелой миссенс-мутацией p. P1380L клиническая картина при позднем начале (в 32 года), длительностью заболевания 13 лет характеризуется значительной потерей зрительных функций и выраженными структурными изменениями. И хотя функциональный анализ мутации p. P1380L не проведен, однако в исследовании К. Tanaka и соавт. (2017) эта мутация в гомозиготном состоянии описана у пациента с тяжелым фенотипом [20].

У пациента № 1 при мутации p. G1961E в гетерозиготном состоянии с тяжелой комплексной миссенс-мутацией p.[L541P;A1038V] фенотип ассоциирован с более ранним началом (14 лет), остротой зрения 0,03/0,07 при длительности заболевания 38 лет и более выраженными структурными и функциональными поражениями сетчатки. Учитывая, что у других 5 пациентов с такой же мутацией p.[L541P;A1038V] отмечен легкий фенотип, можно предположить, что причиной более тяжелого течения являются другие генетические факторы или дополнительные, невыявленные мутации.

Некоторые авторы также отмечают, что наличие мутации p. G1961E не во всех случаях дает возможность прогнозирования относительно благоприятного течения, тяжелые формы дистрофии сетчатки могут сопровождаться обширными атрофическими изменениями фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) [9, 19]. Другие авторы предположили, что случаи повышенной патогенности мутации p. G1961E могут быть объяснены, возможно, «доминантно-негативным» эффектом, поскольку эта мутация приводит к ингибированию, а не к стимуляции АТФазной активности ABCA4 [21]. Это предположение выдвинуто для объяснения тяжелого фенотипа БШ, наблюдавшегося у 2 родных сибсов, генотип которых по результатам молекулярно-генетического анализа определен как p.[G1961E];[W663X], т. е. сибсы были идентичны по наличию мутации p. G1961E и нонсенс-мутации (нуль-аллеля) в компаунд-гетерозиготном состоянии. Мутация W663X была унаследована ими от матери, у которой диагностирована БШ (генотип p.[A1038V]; [W663X], а p. G1961E унаследована также обоими сибсами от отца, не имеющего клинических признаков дистрофии сетчатки. Учитывая наблюдение тяжелого фенотипа БШ у 2 пациентов с генотипом p.[G1961E]; [W663X], авторы статьи констатировали, что мутация р. G1961E в компаунд-гетерозиготном состоянии не всегда определяет легкое клиническое течение заболевания. Однако этот вывод основывается на данных неполного генотипирования пациентов и потому может обоснованно подвергаться сомнению. Генотипирование в рассматриваемой работе проводилось посредством диагностических чипов ABCR500, позволяющих выявлять около 500 мутаций в гене ABCA4, известных к моменту разработки этой версии чипов. В настоящее время количество описанных патогенных вариантов последовательности гена ABCA4 практически вдвое превышает это значение. Таким образом, по техническим и историческим причинам из диагностики исключено значительное количество потенциально патогенных мутаций, что привело к неполному генотипированию пациентов и возможному формированию на основе полученных данных неверных представлений о характере клинико-генетических корреляций.

Следует отметить, что неполное генотипирование характерно для работ, в которых описаны неожиданно тяжелые формы дистрофии сетчатки у больных с мутацией р. G1961E. Так, в приведенных ранее работах отмечено, что диагностика проводилась на чипах ABCR600 и ABCR400 соответственно. Это не позволяет говорить о качественно выполненном молекулярно-генетическом обследовании групп пациентов, на основании которого сделаны выводы [9, 19]. Такие публикации следует считать историческими артефактами, а приведенные в них клинико-генетические корреляции могут иметь смысл только после дополнительного, по возможности полного, генотипирования пациентов.

В нашей работе использован наиболее адекватный из доступных на сегодняшний день способ диагностики мутаций в гене ABCA4, заключающийся в полном секвенировании всей кодирующей последовательности гена, прилежащих интронных последовательностей протяженностью не менее 100 пар нуклеотидов и известных на сегодняшний день минорных экзонов ABCA4, слабо экспрессирующихся в нормальной сетчатке глаза человека. Такой подход гарантирует эффективное выявление подавляющего числа патогенных вариантов ABCA4 и адекватную характеристику клинико-генетических корреляций в большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать незначительные ограничения используемого нами способа диагностики, заключающиеся в невозможности выявления ранее не описанных глубоко интронных мутаций. В настоящее время эта возможность реализуется только таргетным высокопроизводительным параллельным секвенированием всех интронов гена. Такой подход реализован впервые совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [22]. Исследованы образцы ДНК 36 пациентов с БШ, которым не удалось установить полный молекулярный диагноз заболевания с использованием стандартных современных диагностических подходов. В изученной выборке обнаружено 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых выявленных вариантов окончательно не доказана, эта пионерская работа прокладывает путь к совершенствованию молекулярно-генетической диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, являющемуся краеугольным камнем (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

Важно учитывать, что недостаточно полная характеристика течения заболевания также может нарушать картину клинико-генетических корреляций при Б.Ш. Отдельные авторы анализируют корреляции при относительно небольшой, до 5 лет, длительности заболевания, что может искажать представление о фенотипической картине, обусловленной мутацией p. G1961E.

У 2 пациентов (№ 18, 19) выявлена 1 мутация гена ABCA4 (p.G1961E). И если у пациента № 18 в настоящее время клиническая картина соответствует БШ и можно предположить, что отсутствие 2-й мутации может быть связано с изменениями гена, которые нельзя обнаружить с помощью секвенирования, или наличием глубоких интронных невыявленных мутаций, то у пациента № 19 с ПКД нельзя исключить наличия мутаций в других генах и носительства частой мутации p. G1961E, не являющейся причиной НЗС. Однако обращает на себя внимание тот факт, что из всех обследованных с мутацией p. G1961E именно у указанных пациентов отмечены наиболее выраженные изменения показателей гЭРГ и мф-ЭРГ.

В целом мф-ЭРГ изменена во всех случаях, отмечались выраженное в разной степени снижение плотности и нарушение топографии биопотенциала центральной зоны сетчатки. Отмечены высокая прямая корреляция плотности и амплитуды и умеренная обратная корреляция латентности Р1мф-ЭРГ и средней чувствительности сетчатки (MS).

Высокопроизводительное параллельное секвенирование ДНК в обследованной выборке пациентов позволило выявить миссенс-мутацию p. G1961E в компаунд-гетерозиготном состоянии с миссенс-мутациями, нонсенс-мутацией, мутациями сайта сплайсинга и дупликацией со сдвигом рамки считывания. Аминокислотная замена p. G1961E является частой мутацией гена АВСА4 в популяции жителей России, ассоциированной с развитием наследственных заболеваний сетчатки, что позволяет накапливать и анализировать данные клинико-генетических корреляций, облегчает задачу прогнозирования течения заболевания, а также позволяет определять дальнейшую тактику лечения. В нашем исследовании у пациентов с длительностью заболевания от 9 лет и более мутация p. G1961E в 81% случаев ассоциирована с легким течением наследственных заболеваний сетчатки, даже при наличии второй тяжелой мутации. Однако в редких случаях встречается более тяжелый фенотип наследственных заболеваний сетчатки с мутацией p. G1961E, что, вероятно, обусловлено другими генетическими факторами. Мультифокальная электроретинограмма изменена у всех 20 пациентов. У 7 из 8 пациентов с мутацией p. G1961E в сочетании с комплексной мутацией p.[L541P;A1038V], а также у 2 пациентов без выявленной второй мутации обнаружены изменения ганцфельд-электроретинограммы, выраженные в разной степени.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.Ш., В.С.

Сбор и обработка материала: И.Г., Н.Ж., И.Р., В.К., А.М., А.Т., В.С.

Статистическая обработка данных: И.Г., Н.Ж., А.М.

Написание текста: И.Г., Н.Ж., А.М.

Редактирование: Н.Ш., И.Р., В.К., В.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Шеремет Н.Л. — д.м.н., ведущий научный сотрудник отделения патологии сетчатки и зрительного нерва ФГБНУ «НИИГБ»; e-mail: sheremet_n@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4597-4987

Грушкэ И.Г. — аспирант ФГБНУ «НИИГБ»; e-mail: irina.grusca@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0341-8050

Жоржоладзе Н.В. — к.м.н., младший научный сотрудник отделения патологии сетчатки и зрительного нерва ФГБНУ «НИИГБ»; e-mail: nino1998@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1771-300Х

Ронзина И.А. — к.м.н., научный сотрудник отделения патологии сетчатки и зрительного нерва ФГБНУ «НИИГБ»; e-mail: ronzinirina@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-0298-2250

Микаелян А.А. — аспирант ФГБНУ «НИИГБ»; e-mail: asia-07@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-9314-4836

Кадышев В.В. — к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии, врач-генетик, офтальмолог ФГБНУ «МГНЦ»; e-mail: vvh.kad@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-7765-3307

Танас А.С. — научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБНУ «МГНЦ»; e-mail: tanas@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-2177-6743

Аношкин К.И. — научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБНУ «МГНЦ»; e-mail: anoshkin@epigenetic.ru; https://orcid.org/0000-0001-9631-8782

Стрельников В.В. — д.б.н., проф., заведующий лабораторией эпигенетики ФГБНУ «МГНЦ»; e-mail: vstrel@list.ru; https://orcid.org/0000-0001-9283-902Х

Автор, ответственный за переписку: Грушкэ Ирина Григорьевна — аспирант отделения патологии сетчатки и зрительного нерва ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»; e-mail: irina.grusca@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0341-8050