Возможность применения терагерцового (ТГц) излучения с перспективой разработки новейших неинвазивных биомедицинских технологий в последнее время вызывает повышенный интерес. Это связано с тем, что ТГц-изучение обладает высокой чувствительностью к содержанию воды в тканях, не является ионизирующим и, следовательно, опасным для биологических объектов. Малая энергия квантов (0,4—40 мэВ) этого диапазона излучения дает возможность применять его in vivo. Одним из перспективных направлений использования ТГц-излучения в офтальмологической практике может стать разработка диагностических методов, позволяющих выявлять на ранних этапах поражение роговицы [1]. В период с 2011 по 2019 г. был проведен ряд исследований, посвященных анализу изменений гидратации роговицы с применением ТГц-спектроскопии и других ТГц-методов визуализации в условиях ex vivo и in vivo [1—7].
Уровень безопасного излучения миллиметрового диапазона был установлен в 1980-х годах: он составляет 10 мВт/см2 [8], что также включает в себя плотность мощности ТГц-диапазона [9]. Однако экспериментальные данные, подтверждающие безопасность ТГц-воздействия на биологические объекты (в том числе структуры глаза in vivo), существуют лишь в ограниченном числе научных работ. Так, в исследовании R. Clothier и соавт. [10] при облучении культуры клеток (дермальных кератиноцитов) ТГц-излучением в диапазоне частот от 0,2 до 3,0 ТГц с мощностью 0,45 Дж/см2 не было выявлено каких-либо изменений в процессе дифференциации клеток, а также угнетения или стимуляции клеточной активности. При исследовании воздействия ТГц-излучения на лимфоцитарную культуру клеток (частота 0,12 ТГц) и фибробластов (частота 2,52 ТГц) в серии экспериментов также не было обнаружено нарушений в цикле деления клеток и выраженного повреждения хромосомной ДНК [11—13].
Был проведен ряд исследований на культурах эпителиальных клеток глаза человека. S. Koyama и соавт. [14] продемонстрировали, что излучение частотой 0,12 ТГц в течение 24 ч не вызывает выраженных отклонений в показателях микроядерного теста, при проведении морфологической оценки, а также при анализе экспрессии белков теплового шока. При суточной экспозиции культуры клеток переднего эпителия роговицы ТГц-излучением с частотой 0,12 ТГц и плотностью 5 мВт/см2 также не было выявлено выраженной генотоксичности или морфологических изменений эпителиальных клеток [15].
В одном из недавних исследований [16], посвященном возможностям применения ТГц-излучения для оценки степени гидратации эпителия роговицы и стабильности слезной пленки, на математической модели комплексной диэлектрической проницаемости системы глазной поверхности в ТГц-диапазоне частот была определена оптимальная частота, при которой глубина проникновения будет ограничена задними слоями стромы роговицы. При большей глубине проникновения результаты исследования могут быть скомпрометированы влиянием влаги передней камеры. Таким образом, для диагностики внешних слоев глазной поверхности (слезной пленки, эпителия и т. д.) предпочтительны частоты в диапазоне 0,30—0,40 ТГц. Безопасность ТГц-излучения в диапазоне указанных частот на данный момент не была подтверждена на модели животных с последующей морфологической оценкой состояния тканей роговицы.
Цель исследования — изучение безопасности воздействия различных временных, мощностных, частотных диапазонов импульсного ТГц-излучения на роговицу глаза на модели кролика.
Материал и методы
Для реализации поставленной цели был разработан и создан экспериментальный макет прибора, позволяющий воздействовать на роговицу в импульсно-непрерывном режиме с возможностью изменения параметров (время, мощность, частота) ТГц-излучения (рис. 1). Источником мощного ТГц-излучения служил квантово-каскадный лазер, обеспечивающий на частоте 3,0 ТГц плотность мощности генерации 60 мВт/см2 [17]. Малые уровни мощности ТГц-излучения были получены при использовании ТГц-фотомиксеров [4]. Безопасность воздействия in vivo изучали на 18 кроликах породы шиншилла массой от 2,0 до 2,5 кг (18 глаз). Воздействию ТГц-излучения подвергали только правые глаза экспериментальных животных, левые глаза служили контролем.
Рис. 1. Блок-схема экспериментального макета ТГц-рефлектометра.
Исследование проводили в соответствии с требованиями приказа Минздрава СССР от 12.08.77 №755, а также общепринятыми принципами гуманного обращения, определяющимися международными правилами по работе с лабораторными животными, которые были установлены Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (принята 18.03.86, подтверждена 15.06.06, Страсбург, Франция). Животные были выведены из эксперимента методом воздушной эмболии.
Для выявления корреляции между параметрами ТГц-излучения и характером его воздействия на слои роговицы у кроликов №1 и №2 исследование проводили при частоте 3,0 ТГц и плотности мощности 60 мВт/см2. Использовали излучение непрерывного квантово-каскадного лазера. Поверхность роговицы кроликов №3 и №4 подвергали воздействию с той же частотой (3,0 ТГц), но с меньшей мощностью источника излучения для каждого исследуемого глаза. Далее параметры мощности и частоты уменьшали: для кролика №5 параметры излучения составили 0,3 ТГц и 3 мкВт/см2, для кролика №6 — 0,3 ТГц и 0,3 мкВт/см2. Экспериментальные животные №7—13 подвергались однократному воздействию субтерагерцового излучения с минимальными частотой (0,1 ТГц) и плотностью мощности (30 нВт/см2), а глаза кроликов №14—18 — трехкратному воздействию той же мощности и частоты излучения. Длительность воздействия составляла 60 с при однократном воздействии и 3 раза по 60 с (с перерывами по 5 мин) при трехкратном воздействии. Этот временной диапазон был выбран с целью получения объема данных, достаточного для графического отображения динамики изменения гидратации ткани роговицы с последующей математической обработкой.
Для прижизненной оценки состояния роговицы до и после воздействия проводили лазерную конфокальную микроскопию (КМР) роговицы с подсчетом плотности клеток (Heidelberg Retina Tomograph 3 с роговичным модулем Cornea Rostock, Гейдельберг, Германия) [18—20].
Программное обеспечение томографа требовало ручной выборки для оценки конечной плотности клеток, в связи с чем допустимый диапазон изменения плотности клеток составил 5—10%.
Объективным критерием оценки состояния роговицы после ТГц-воздействия на разных сроках вывода животных из эксперимента (1-е и 14-е сутки) служили результаты гистологического исследования, выполненного методом электронной микроскопии полутонких срезов.
Результаты и обсуждение
При использовании параметров частоты ТГц-излучения в диапазоне от 0,3 до 3,0 ТГц и плотности мощности от 0,3 мкВт/см2 до 60 мВт/см2 даже при однократном воздействии были получены значительные уменьшения плотности эпителиальных клеток (от 15 до 72%). При воздействии на роговицу субтерагерцовым излучением с частотой от 0,1 ТГц и плотностью мощности 30 нВт/см2 изменение плотности клеток было незначительным (от 0,05 до 9%), с вариацией плотности клеток в пределах допустимой погрешности в сторону как уменьшения после воздействия, так и увеличения. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Изменение плотности клеток эпителия роговицы до и после воздействия ТГц-излучения
| Показатель | Кролики | ||||||||
| №1 | №2 | №3 | №4 | №5 | №6 | №7 | №8 | №9 | |
| Характер воздействия | Однократное | Трех-кратное | Однократное | ||||||
| Плотность клеток (до воздействия), мм2 | 1131±45 | 623±34 | 1091±47 | 2282±66 | 1263±64 | 1002±49 | 928±55 | 1254±82 | 801±59 |
| Частота, ТГц | 3,0 | 0,3 | 0,1 | ||||||
| Мощность | 60 мВт/см2 | 3 мВт/см2 | 30 нВт/см2 | 3 мкВт/см2 | 0,3 мкВт/см2 | 30 нВт/см2 | |||
| Плотность клеток (после воздействия), мм2 | 657±34 | 502±87 | 823±41 | 766±27 | 897±45 | 857±55 | 921±82 | 1162±63 | 751±49 |
| Потеря плотности | ↓28% | ↓54% | ↓58% | ↓22% | ↓29% | ↓15% | ↓2% | ↓7% | ↓6% |
| Показатель | Кролики | ||||||||
| №10 | №11 | №12 | №13 | №14 | №15 | №16 | №17 | №18 | |
| Характер воздействия | Однократное | Трехкратное | |||||||
| Плотность клеток (до воздействия), мм2 | 790±35 | 1007±58 | 539±16 | 775±43 | 901±58 | 876±57 | 627±26 | 940±66 | 599±37 |
| Частота, ТГц | 0,1 | ||||||||
| Мощность, нВт/см2 | 30 | ||||||||
| Плотность клеток (после воздействия), мм2 | 751±55 | 982±72 | 546±26 | 760±40 | 906±46 | 891±50 | 658±28 | 841±56 | 554±66 |
| Потеря плотности | ↑0,05% | ↓2,5% | ↑1,2% | ↓2% | ↓4,9% | ↑1,7% | ↑4,9% | ↓9% | ↓8% |
Состояние клеток эпителия роговицы по данным лазерной КМР после воздействия при максимальных (кролики №1 и №2) и минимальных (кролики №10 и №14) параметрах ТГц-излучения представлены на рис. 2 и 3.
Рис. 2. Результаты КМР до (а, в) и после воздействия. (б — однократного, г — трехкратного), параметры: 3 ТГц и 60 мВт/см2.
Рис. 3. Результаты КМР до (а, в) и после воздействия (б — однократное, г — трехкратное), параметры: 0,1 ТГц и 30 нВт/см2.
На рис. 2 отчетливо заметны постэкспериментальные значительные изменения эпителия: отек поверхностных слоев и изменения формы клеток. Для остальных кроликов, подвергшихся воздействию с аналогичными параметрами вышеуказанных мощности и частоты, результаты были идентичны.
Рис. 3 иллюстрирует отсутствие негативного влияния на структуру и форму эпителиальных клеток при минимальном ТГц-воздействии. Таким образом, по результатам лазерной КМР были определены следующие возможные параметры частоты и мощности ТГц-излучения, при которых не зафиксированы отек эпителиальных клеток, потеря их плотности и организации: частота — 0,1 ТГц, плотность мощности — 30 нВт/см2.
Дополнительным подтверждением отсутствия морфологических изменений в структуре роговицы после ТГц-воздействия служили результаты гистологического исследования роговиц кроликов №10 и №14, представленные на рис. 4—7.
Рис. 4. Морфологическая картина роговицы кролика №10 непосредственно после однократного ТГц-воздействия (а, в, д — острый опыт) в сравнении с контролем (б, г, е). Полутонкие срезы.
Окраска метиленовым синим и фуксином; а, б — ув. 100, в—е — ув. 200. а, б — сагиттальные срезы роговицы в области воздействия лазерного излучения. Общий вид; в — некоторое уменьшение средней площади эпителиоцитов, особенно базального слоя, по сравнению с контролем — (г); д, е — задние слои роговицы практически не различаются.
Рис. 5. Морфологическая картина роговицы кролика №14 непосредственно после многократного ТГЦ-воздействия (а, в, д — острый опыт) в сравнении с контролем (б, г, е). Полутонкие срезы.
Окраска метиленовым синим и фуксином; а, б — ув. 100, в—е — ув. 200. а, б — при малом увеличении внешних различий не отмечается; в, г — толщина переднего эпителия роговицы и средняя площадь базалиоцитов в опытном образце меньше, межклеточные границы поверхностных слоев менее различимы, с другой стороны, стромальные пластины более контурируемые (в), чем в контроле (г); д, е — задние слои роговицы практически идентичны.
Рис. 6. Морфологическая картина роговицы кролика №10 на 14-е сутки после однократного ТГц-воздействия (а, в, д) в сравнении с контролем (б, г, е). Полутонкие срезы.
Окраска метиленовым синим и фуксином; а, б — ув. 100, в—е — ув. 200. а, б — при малом увеличении видимых изменений не отмечено; в, г — передний эпителий роговицы опытного образца представлен гипертрофированными базалиоцитами и компактным слоем недифференцированных клеток (в), тогда как в контрольном образце четко прослежены слои крыловидных и плоских клеток (г); д, е — задние слои роговицы практически не различаются.
Рис. 7. Морфологическая картина роговицы кролика №14 на 14-е сутки после многократного ТГц-воздействия (а, в, д) в сравнении с контролем (б, г, е). Полутонкие срезы.
Окраска метиленовым синим и фуксином; а, б — ув. 100, в—е — ув. 200. а, б — через 2 нед разница в толщине роговиц обеих групп становится минимальной; в, г — в переднем эпителии роговицы опытного образца (в) различимы отдельные крыловидные и плоские десквамирующиеся клетки, видны четкие межпластинчатые границы в строме; д, е — различий в строении задних слоев роговицы не отмечено.
На первом этапе выведение животных из эксперимента осуществляли в 1-е сутки после воздействия. Результаты представлены на рис. 4 и 5.
Для выявления скрытых отдаленных негативных последствий на втором этапе эксперимента животных выводили из опыта на 14-е сутки после воздействия (рис. 6 и 7).
В последующем был проведен морфомерический анализ постэкспериментальных изменений роговиц кроликов. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2. Послойная морфометрическая характеристика роговиц по группам животных
| Срок исследования | Воздействие | Группа | Толщина роговицы, мкм | Толщина переднего эпителия, мкм | Средняя площадь базалиоцитов, мкм2 | Толщина заднего эпителия, мкм | Количество эндотелицитов на ед. длины, кл/мм |
| Острый опыт | Однократное | Опыт | 538±7,82 | 39,7±1,82 | 187±38,9 | 4,81±0,37 | 90,23 |
| Контроль | 634±15,3 | 43,2±1,3 | 215±64 | 6,39±1,01 | 69,2 | ||
| Многократное | Опыт | 578±15,3 | 33,12±1,88 | 110±14,2 | 6,56±0,84 | 56,34 | |
| Контроль | 606±17,5 | 40±108 | 156±24 | 4,67±0,85 | 60,49 | ||
| Через 14 дней | Однократное | Опыт | 535±10,6 | 34,7±1,53 | 264±104 | 6,12±0,96 | 74,07 |
| Контроль | 662±24 | 37,4±0,94 | 156±25,7 | 6,19±1,02 | 60,15 | ||
| Многократное | Опыт | 504±13,1 | 33,7±1,38 | 225±61,2 | 5,03±0,89 | 67,85 | |
| Контроль | 578±7,56 | 39,18±1,58 | 1±32,7 | 6,22±0,84 | 53,63 |
В контрольной и опытной группах после однократного лазерного воздействия не отмечено разницы в морфологической структуре роговиц, за исключением толщины (634±15,3 и 538±7,82 мкм соответственно). Толщина переднего эпителия роговицы контрольной группы несколько превышала аналогичное значение в опытной группе (43,2±1,3 против 39,7±1,8 мкм), главным образом, за счет увеличения размеров базалиоцитов (215±64 против 187±38,69 мкм). В строме особых различий не наблюдалось. В опытной группе более четко просматривался ламеллярный характер ее строения. Со стороны монослоя заднего эпителия роговицы отмечено незначительное снижение его толщины в опытной группе (4,81±0,37 против 6,39±1,01 мкм) и уменьшение линейной плотности ядер эндотелиоцитов на единицу длины (69,2 против 85,23 кл/мм).
При многократном ТГц-воздействии морфометрическая картина роговицы заметно не менялась. Средняя толщина роговицы была несколько большей в контрольной группе (606±17,5 против 578,7±15,3 мкм). Соответственно сохранялась разница в толщине переднего эпителия (40±1,0 против 3,12±1,88 мкм), главным образом за счет базального слоя эпителиоцитов (156±24 против 110±14,2 мкм).
Разница в толщине заднего эпителия роговицы в обеих группах оставалась несущественной (4,67±0,85 против 6,56±0,84 мкм), равно как и линейная плотность эндотелиоцитов (60,49 против 56,34 кл/мм).
Через 14 дней после однократного ТГц-воздействия при отсутствии визуальных внешних различий сохранялась некоторая разница толщины роговицы контрольной и опытной групп (662±24 против 535±10,6 мкм соответственно). Толщина переднего эпителия составляла 37,4±0,94 против 34,7±1,53 мкм. При этом в опытной группе эпителиальный пласт был представлен в большей степени слоем базалиоцитов, более крупных по сравнению с аналогичными клетками контрольной группы (264±104 против 156±25,7 мкм2), и одним слоем компактных плоских клеток. Это свидетельствовало о растянутой во времени регенерации эпителия за счет миграции и дифференцировки базалиоцитов через стадию их гипертрофии. Состояние заднего эпителия и его параметрические показатели были практически идентичны: линейная плотность ядер эндотелиоцитов — 74,07 против 60,15 кл/мм, толщина — 6,12±0,96 против 6,19±1,02.
Через 14 дней после многократного воздействия лазерным излучением на роговицу разница в толщине роговицы контрольной и опытной групп была минимальной: 578±7,56 против 504±13,1 мкм. Передний эпителий толщиной 33,7±1,38 против 39,18±1,58 мкм представлен слоями достаточно крупных базалиоцитов (средняя площадь 225±61,2 против 198,9±32,7 мкм), одного слоя шиповидных клеток и слоя десквамирующих плоских клеток. Строма хорошо структурирована. Задний эпителий по морфометрическим показателям идентичен в обеих группах: толщина — 5,03±0,89 против 6,22±0,84 мкм, линейная плотность — 67,85 против 53,63 кл/мм.
Результаты исследования роговиц на втором этапе эксперимента (14-е сутки) также не выявили морфологических изменений после ТГц-воздействия с указанными выше параметрами. Результаты, полученные в отдаленном периоде, демонстрировали незначительные обратимые морфологические изменения, вызываемые лазерным излучением с указанными параметрами, ограниченные лишь слоем переднего эпителия. Они заключались в конденсации поверхностных слоев эпителиоцитов, сопровождающейся снижением их проницаемости по отношению, в частности, к воде. Дальнейшая десквамация девитализированных эпителиоцитов приводила к значительному уменьшению рядности и толщины переднего эпителия. Некоторое истончение стромы, очевидно, связано с уменьшением транспорта жидкости из прекорнеальной слезной пленки через уплотненный передний эпителий и ее относительной дегидратацией. Следует отметить, что регенерация слоя шиповидных клеток переднего эпителия несколько быстрее наступала в подгруппе с многократным лазерным воздействием. Значительных достоверных морфологических различий в подгруппах с однократным и многократным лазерным воздействием выявлено не было.
Заключение
Проведенное исследование безопасности воздействия ТГц-излучения на роговицу глаза на модели кролика позволяет заключить, что однократное и многократное воздействие данного вида лазерного излучения (при плотности мощности, не превышающей 30 нВт/см2 и частотой не выше 0,1 ТГц) не вызывают видимых структурных изменений со стороны всех слоев роговицы кроликов.
Указанные выше параметры терагерцового и субтерагерцового излучения можно считать безопасными для оценки изменений гидратации эпителия роговицы с помощью приборов на основе ТГц-рефлектометрии.
Исследование выполнено при частичной поддержке Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского государственного университета «Фотонные и квантовые технологии. Цифровая медицина».
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Т.С., Е.С., И.О.
Сбор и обработка материала: Е.С., А.Ф., З.С.
Статистическая обработка: А.Ф., З.С., Е.С.
Написание текста: Е.С.
Редактирование: Т.С., А.Ф., З.С., И.О.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.