Хемокины — это разновидность низкомолекулярных регуляторных белков, обладающих разнонаправленным гомеостатическим, провоспалительным свойством и контролирующих процессы миграции и активации клеток врожденной и адаптивной иммунной системы [1].
В соответствии с данными литературы, классифицируют четыре семейства хемокинов в зависимости от расположения аминокислот цистеинов в белковой молекуле: CXC, CC, CX3C и C, где C обозначает остатки цистеина, а X — любой другой аминокислотный остаток, разделяющий цистеины [2].
Возникновение и развитие опухолей регулируются различными молекулярными системами организма человека, включающими цитокины, хемокины и факторы роста [3]. Воспаление является одним из компонентов, сопровождающих существование новообразований [4]. Ученые доказали, что хемокины играют ключевую роль не только в воспалительном ответе, развивающемся в ответ на появление чужеродных неопластических клеток [5], но и в усилении ангиогенеза, инвазивности опухолей, увеличении пролиферативного потенциала и метастазировании [1, 6, 7]. Хемокины продуцируются как опухолевыми клетками, так и макрофагами, ассоциированными с опухолью [8].
Увеальная меланома (УМ) — злокачественное новообразование с высоким метастатическим потенциалом, молекулярная биология которого до настоящего времени до конца не изучена [9—11]. Роль хемокинов в патофизиологии УМ исследована в немногочисленных работах [6, 8, 12—14]. Однако до настоящего времени не была проанализирована роль некоторых хемокинов семейств CXC и CC в сыворотке крови и слезной жидкости в зависимости от размеров УМ.
Цель работы — изучить роль хемокинов семейств CXC и CC в сыворотке крови и слезной жидкости у пациентов с УМ.
Материал и методы
Обследовано 118 человек (средний возраст — 53,7±12,2 года), в том числе 80 пациентов с УМ и 38 здоровых доноров. Пациентам с меланомой проведены магнитно-резонансная томография (МРТ) органов брюшной полости с контрастированием и рентгенография органов грудной клетки. Метастатическая болезнь на момент обследования исключена. Также проведено обследование с применением общеофтальмологических методов, включая офтальмоскопию, ультразвуковые исследования и оптическую когерентную томографию.
В соответствии с клиническими рекомендациями «Увеальная меланома» (пересмотр 2020 г.) для стадирования меланомы используют классификацию TNM (tumor, nodus, metastasis) Объединенного американского комитета по раку (American Joint Committee on Cancer, AJCC), опубликованную в 2017 г., и классификацию, разработанную в 1983 г. J. Shields [15].
Согласно классификации меланомы цилиарного тела и хориоидеи, предложенной J. Shields, пациентов распределили на три группы.
В 1-ю группу (малые опухоли — проминенция до 3 мм, диаметр основания до 10 мм) вошли 32 больных, во 2-ю (опухоли среднего размера — проминенция 3—5 мм, диаметр основания 10—15 мм) — 26 пациентов, 3-ю группу (большие опухоли — проминенция >5 мм, диаметр основания >15 мм) составили 22 пациента (см. рисунок).
Увеальная меланома малого (а), среднего (б) и большого (в) размера.
В 1-й группе у всех пациентов меланомы были локализованы в хориоидее, во 2-й группе у 25 пациентов — в хориоидее и у одного УМ распространялась на цилиарное тело, в 3-й группе у 21 больного УМ были в хориоидее и у одного пациента отмечалась цилиохориоидальная локализация меланомы.
В группу контроля вошли 38 практически здоровых доноров, сопоставимых по возрасту и полу с пациентами основных групп, без признаков офтальмопатологии.
Иммунологические исследования с целью определения хемоаттрактантных медиаторов проводили методом мультиплексного анализа по технологии xMAP (Luminex, США) в программе Xponent 3.1 с помощью магнитных флюоресцирующих микросфер и набора для определения концентрации хемокинов Procarta Plex (eBioscience, Австрия). В каждой тест-пробе сыворотки крови и слезной жидкости определяли хемокины семейств CC (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и CXC (CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α).
Статистическая обработка данных проведена с помощью программного комплекса Professional BioStat для Windows Version 2009 (t-критерий Стьюдента, критерии Фишера и χ2 Пирсона), уровень статистической значимости — p<0,05.
Результаты
Все изучаемые хемокины разделены по их преимущественному действию на следующие группы: провоспалительные (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES); обладающие пролиферативным эффектом и способствующие раннему метастазированию (CXCL10/IP-10, CCL11/Eotaxin); усиливающие неоангиогенез (CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, CXCL12/SDF-1α); ингибирующие ангиогенез (CCL4/MIP-1β).
Результаты мультиплексного анализа у пациентов с УМ показали значительное повышение концентраций хемокинов, усиливающих пролиферацию опухолевых клеток и обладающих провоспалительным эффектом.
Уровень провоспалительного хемокина семейства CC (CCL2/MCP-1), участвующего в хроническом воспалении, оказался резко увеличен в слезной жидкости больного и парного здорового глаз (более чем в 10 раз) и в сыворотке крови (в 1,5 раза) у больных с УМ малых, средних и больших размеров по сравнению с его содержанием у здоровых доноров (p<0,05; табл. 1, 2).
Таблица 1. Мультиплексный анализ хемокинов в сыворотке крови у пациентов с УМ по сравнению со здоровыми донорами
| Хемокины | Группа | |||||||
| 1-я (n=32) | 2-я (n=26) | 3-я (n=22) | контроль (n=38) | |||||
| частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | |
| CCL2/MCP-1 | 30 (94) | 84,6±9,2 | 26 (100) | 72,6± 10,5 | 22 (100) | 61,6±9,9 | 34 (89,5) | 51,2±16,2 |
| CCL3/MIP-1α | 23 (72) | 10,1±1,7 | 19 (73) | 11,5±2,1 | 20 (91) | 20,4±4,3 | 15 (39,5) | 9,7±3,4 |
| CCL5/RANTES | 32 (100) | 62,04±6,2* | 26 (100) | 54,2±2,1* | 22 (100) | 59,4±1,8* | 38 (100) | 19,7±5,6 |
| CXCL10/IP-10 | 32 (100) | 39,2±3,5* | 26 (100) | 31,5±3,5* | 22 (100) | 33,7±3,5* | 34 (89,5) | 14,1±2,8 |
| CCL11/Eotaxin | 32 (100) | 54,5±5,2 | 26 (100) | 60,7±6,1 | 22 (100) | 53,8±5,4 | 38 (100) | 43,4±8,97 |
| CXCL1/GRO-α | 11 (34) | 11,09±1,7 | 3 (12) | 7,4±2,5 | 4 (18) | 9,9±2,3 | 0 | 0 |
| CXCL8/IL-8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CXCL12/SDF-1α | 32 (100) | 555,7±20,9* | 26 (100) | 466,7±23,3* | 22 (100) | 539,1±1,8* | 38 (100) | 285,6±45,9 |
| CCL4/MIP-1β | 21 (66) | 46,7±5,2 | 12 (46) | 55,7±11,8 | 17 (77) | 48,3±5,7 | 19 (50) | 67,2±18,3 |
Примечание. * — значимое отличие от контроля (p<0,05).
Таблица 2. Мультиплексный анализ хемокинов в слезной жидкости у пациентов с УМ по сравнению со здоровыми донорами
| Хемокины | Группа | |||||||||||||
| 1-я (n=32) | 2-я (n=26) | 3-я (n=22) | контроль (n=38) | |||||||||||
| больной глаз | парный здоровый глаз | больной глаз | парный здоровый глаз | больной глаз | парный «здоровый» глаз | |||||||||
| частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | частота, абс. (%) | средний уровень, пкг/мл, M±m | |
| CCL2/MCP-1 | 31 (97) | 407,7±75,5* | 31 (97) | 386,01±61,1* | 26 (100) | 444,05±90,02* | 26 (100) | 411±88,1* | 22 (100) | 559,5±85* | 22 (100) | 486,1±66,5* | 38 (100) | 36,6±11,3 |
| CCL3/MIP-1α | 31 (97) | 24,3±3,6* | 30 (94) | 22,3±3,1* | 26 (100) | 29,8±7,4* | 26 (100) | 30,4±7,6* | 22 (100) | 22,7±5,8* | 22 (100) | 20,1±2,5* | 33 (86,8) | 6,2±0,71 |
| CCL5/RANTES | 31 (97) | 33,05±5,7* | 31 (97) | 38,6±7,5* | 26 (100) | 28,1±6* | 26 (100) | 31,04±5,5* | 22 (100) | 21±2,8* | 22 (100) | 28,6±9,7* | 38 (100) | 17,8±4,9 |
| CXCL10/IP-10 | 32 (100) | 728,9±100,9* | 30 (94) | 771,5±86,2* | 26 (100) | 738,6±95,4* | 26 (100) | 720,3±89,2* | 22 (100) | 824,7±173,8* | 22 (100) | 760,3±95,7* | 38 (100) | 236,6±88,7 |
| CCL11/Eotaxin | 32 (100) | 27,4±3,5* | 31 (97) | 27,5±3,5* | 26 (100) | 24,8±3,01* | 26 (100) | 24,6±3,3* | 22 (100) | 25,9±3,4* | 22 (100) | 28,2±3,4* | 38 (100) | 12,8±1,97 |
| CXCL1/GRO-α | 31 (97) | 315±35,2* | 31 (97) | 355,7±60,5* | 26 (100) | 315,9±34,9* | 26 (100) | 294,8±26,9* | 22 (100) | 253,7±34,5* | 22 (100) | 315,7±56,3* | 28 (73,7) | 152,9±20,9 |
| CXCL8/IL-8 | 31 (97) | 376,1±61,7* | 31 (97) | 374,7±53,8* | 26 (100) | 461,6±65,9* | 26 (100) | 367,4±32,9* | 22 (100) | 517±129,5* | 22 (100) | 537,7±107* | 28 (73,7) | 86,5±29,8 |
| CXCL12/SDF-1α | 31 (97) | 1192,3±103,8* | 30 (94) | 1199,8±87,9* | 26 (100) | 1073,1±102,2* | 26 (100) | 1123,1 ±86,2* | 22 (100) | 864,6±86,6* | 22 (100) | 1026,7±150,7* | 38 (100) | 240±24,5 |
| CCL4/MIP-1β | 29 (91) | 188,7±40,1 | 30 (94) | 154,8±28,2 | 26 (100) | 202,9±46,9 | 25 (96,2) | 194±46,2 | 20 (91) | 210±44,5 | 21 (95) | 168±26,8 | 0 | 0 |
Примечание. * — значимое отличие показателя от контроля (p<0,05).
Содержание хемокина CCL3/MIP-1α, активно участвующего в воспалительных реакциях, нарастало в слезной жидкости обоих глаз в трех исследуемых группах в 4 раза по сравнению с его концентрацией в слезе здоровых людей (p<0,05). Однако в сыворотке крови его увеличение в 2 раза отмечено только у пациентов с УМ больших размеров (см. табл. 1, 2).
Уровень провоспалительного хемоаттрактантного медиатора CCL5/RANTES оказался увеличен почти в 2 раза в слезной жидкости больного и парного «здорового» глаз у пациентов с УМ малых размеров по сравнению с его концентрацией у здоровых доноров (p<0,05). Те же тенденции отмечены у больных с опухолями средних и больших размеров. При этом в сыворотке крови выявлено также увеличение содержания хемокина, участвующего в воспалительных процессах, более чем в 3 раза во всех трех группах пациентов по сравнению с аналогичным показателем у здоровых людей (p<0,05).
Хемокины CXCL10/IP-10 и CCL11/Eotaxin обладают выраженным пролиферативным эффектом и способствуют раннему метастазированию опухолей [5].
Уровень CXCL10/IP-10 в слезной жидкости больного и парного здорового глаз оказался в 3 раза выше у пациентов с УМ малых, средних и больших размеров по сравнению с его концентрацией у здоровых людей (p<0,05). В сыворотке крови у пациентов всех трех групп отмечали значимое увеличение более чем в 2 раза хемокина CXCL10/IP-10 по сравнению с его концентрацией у здоровых людей (p<0,05).
Показатели хемокина CCL11/Eotaxin были увеличены в сыворотке крови у больных 1-й (54,5±5,2 пкг/мл), 2-й (60,7±6,1 пкг/мл) и 3-й (53,8±5,4 пкг/мл) групп с УМ по сравнению со здоровыми лицами (43,4±8,97 пкг/мл). Кроме того, содержание его в слезной жидкости больного и парного глаз при малых (27,4±3,5 и 27,5±3,5 пкг/мл соответственно), средних (24,8±3,01 и 24,6±3,3 пкг/мл соответственно) и больших (25,9±3,4 и 28,2±3,4 пкг/мл соответственно) размерах опухоли оказалось значимо выше по сравнению с показателями донорской слезы (12,8±3,4 пкг/мл; p<0,05).
Хемокинами, усиливающими неоангиогенез (что открывает большую возможность для гематогенного метастазирования злокачественных опухолей), являются CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, CXCL12/SDF-1α [5].
В группах исследуемых нами пациентов с УМ выявлено наличие хемокина CXCL1/GRO-α с максимальной концентрацией при опухолях малых размеров (1-я группа; 11,09±1,7 пкг/мл) и незначительным снижением у больных 2-й (7,4±2,5 пкг/мл) и 3-й (9,9±2,5 пкг/мл) групп; в то же время у здоровых доноров в сыворотке крови он не определялся. При опухолях малых, средних и больших размеров в слезной жидкости больного глаза (315±35,2; 315,9±34,9 и 253,7±34,9 пкг/мл соответственно) и здорового парного глаза (355,7±60,5; 294,8±26,9 и 315,7±56,3 пкг/мл соответственно) отмечали значимое увеличение уровня изучаемого хемокина по сравнению с таковым у здоровых людей (152,9±20,9 пкг/мл; p<0,05).
В группе исследуемых нами пациентов CXCL8/IL-8 не обнаружен в сыворотке крови ни у одного больного, однако отмечено его увеличение в 4 раза в слезной жидкости больного и парного глаз у пациентов с УМ по сравнению с группой контроля (p<0,05).
Уровень проангиогенного хемокина CXCL12/SDF-1α оказался значимо выше в сыворотке крови у пациентов с УМ малых (555,7±20,9 пкг/мл), средних (466,7±23,3 пкг/мл) и больших (539,1±1,8 пкг/мл) размеров по сравнению с его содержанием у здоровых людей (285,6±45,9 пкг/мл; p<0,05).
В слезной жидкости также отмечено увеличение концентрации CXCL12/SDF-1α у больных 1-й, 2-й и 3-й групп, как в больном, так и в парном глазу по сравнению со здоровыми донорами.
В большей степени к ингибирующим ангиогенез относят хемокин CCL4/MIP-1β [5]. В сыворотке крови отмечено уменьшение его содержания при всех стадиях УМ по сравнению с группой контроля. У здоровых доноров в слезной жидкости CCL4/MIP-1β не выявлен, однако у больных с УМ малых, средних и больших размеров в больном и здоровом глазу исследуемый хемокин обнаружен (см. табл. 1, 2).
Обсуждение
УМ является наиболее частым внутриглазным злокачественным новообразованием с неблагоприятным витальным прогнозом из-за высокой частоты метастазирования [16, 17]. Несмотря на то что в настоящее время разработаны и применяются локальные методы лечения УМ, течение опухолевого заболевания может быть непредсказуемым и смертность от метастатической болезни достаточно высока [16]. В современной медицине остро стоит вопрос о более углубленном изучении молекулярных механизмов, участвующих в прогрессировании и метастазировании опухоли, с целью улучшения витального прогноза при УМ [18].
Еще в 2000 г. D. Hanahan и R.A. Weinberg [19] предложили шесть основных концепций роста злокачественной опухоли (поддержание пролиферативной передачи сигналов, уклонение от влияния антиростовых факторов, сопротивление апоптозу, безграничный репликативный потенциал, индукция ангиогенеза, активация инвазивного роста и метастазирования), которые почти через 10 лет были дополнены F. Colotta и соавт. [4] седьмым показателем — наличием воспалительного микроокружения.
Многие исследователи считают, что воспалительные реакции и прогрессирование злокачественной опухоли связаны между собой [1, 3, 4, 11]. Медиаторы воспаления, по их мнению, могут регулировать направленную миграцию и инвазию как лейкоцитов, так и опухолевых клеток. Получены свидетельства прямой роли хемокинов, направляющих опухолевые клетки при метастазировании непосредственно к определенному органу-мишени [20].
Причиной появления этих симптомов служат генетические мутации, воспаление, перепрограммирование энергетического обмена, уклонение от влияния иммунных клеток хозяина, воздействие измененных нормальных клеток организма, создающих опухолевое микроокружение [11, 19].
В настоящее время представляет интерес изучение указанных молекулярных механизмов на ранних стадиях развития УМ с целью разработки таргетной терапии. Лишь немногочисленные источники отечественной и зарубежной литературы описывают роль хемокинов, которые потенциально регулируют миграцию клеток УМ [21—25]. Ранее были изучены некоторые хемокины при УМ. В исследовательской работе В.Г. Лихванцевой [21] проведен анализ содержания интерлейкина-8 (IL-8) и отмечено, что при малых опухолях у семи включенных в исследование пациентов его содержание в слезной жидкости практически не отличалось от такового в группе контроля, а при развитых стадиях выявлено резкое нарастание его уровня; в сыворотке крови — значимое повышение по сравнению с группой контроля.
Исследование L. Lattanzio и соавт. [22] показало, что IL-8 может быть активирован микроокружением меланомы и способствовать активному ангиогенезу. Повышение уровня ИФНγ-индуцируемого белка-10 (IP-10) коррелировало с увеличением инфильтрации регуляторных T-лимфоцитов (Tрег) [14].
Моноцитарный хемотаксический протеин-1 (MCP-1) направляет опухолеассоциированные макрофаги из циркулирующих моноцитов в ткань меланомы [23]. Некоторые исследователи обнаружили значительное повышение уровня MCP-1 в крови, что коррелировало с опухолеассоциированными макрофагами [24]. Кроме того, доказана роль MCP-1 в усилении ангиогенеза на модели мышей [25].
Нами проведен мультиплексный анализ содержания 9 хемокинов класса CC (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и CXC (CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α) при УМ на значительном числе больных. Уже при опухолях малых размеров отмечено увеличение уровней провоспалительных, проангиогенных хемокинов и доказано их нарастание не только в слезной жидкости больного и парного глаза, но и в сыворотке крови. Те же тенденции отмечены в отношении концентрации хемоаттрактантных медиаторов, обеспечивающих метастазирование. Особого внимания заслуживает провоспалительный хемокин CCL2/MCP-1, уровень которого повышался в слезной жидкости пациентов с меланомой малых размеров в 10 раз по сравнению с группой контроля и который может быть предиктором выраженных воспалительных неопластических реакций при УМ.
Определенная закономерность отмечена при изучении динамики содержания медиаторов при разных размерах меланомы. Так, при малых размерах опухоли отмечено повышение содержания хемокинов, при образованиях средних размеров — некоторое снижение относительно значений этого показателя при УМ малых размеров, а при опухолях больших размеров — вновь нарастание уровня белковых молекул. Возможно, это связано с некоторой адаптацией организма при средних стадиях опухоли и подготовке преметастатических ниш.
В настоящем исследовании отмечено, что ингибирующий ангиогенез хемокина CCL4/MIP-1β снижался в сыворотке крови во всех группах пациентов, тем самым открывая возможность для формирования сосудистых сетей опухоли. Собственные исследования показали, что CCL4/MIP-1β отсутствовал у здоровых доноров и определялся в слезной жидкости при манифестации меланомы на значительном уровне.
Интересным фактом, выявленным в результате проведенных исследований, стало значимое повышение уровней хемокинов в парном глазу у больных с опухолями малых размеров по сравнению с показателями у здоровых пациентов. Это явление можно объяснить феноменом содружественной иммунологической реакции [26].
Одним из ключевых звеньев, обеспечивающих иммунную привилегированность органа зрения, является феномен «иммунного отклонения, связанного с передней камерой глаза» (ИОПК, англ. anterior chamber associated immune deviation, ACAID) [27]. Результаты фундаментальных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что в норме ИОПК обеспечивается комплексом «пассивных» (морфоструктурных) и «активных» (растворимых) факторов, присутствующих во влаге передней камеры и обладающих «иммуносупрессивными» свойствами [27]. Реализация ИОПК осуществляется посредством цепи сигнальных «цитокиновых» эффектов, проходящих через фильтрующую зону трабекулы и достигающих селезенки, что приводит к селективной антиген-специфической супрессии системного Th1-клеточного иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа.
При сопровождающих опухоль патологических изменениях оболочек глаза в переднюю камеру попадают антигены, вызывающие иммунные реакции посредством активированных CD8+ T-цитотоксических лимфоцитов [28]. При этом изменяется проницаемость гематоофтальмического барьера, белки плазмы крови переходят в переднюю камеру, ингибируя ее иммуносупрессивные свойства и запуская воспалительный процесс не только в больном, но и в парном здоровом глазу. Дисфункция гематоофтальмического барьера, вызванная провоспалительными цитокинами, была доказана в эксперименте L. Claudio и соавт. [29], которые смогли инициировать ее с помощью интравитреальной инъекции IL-1 и фактора некроза опухоли, после чего меченные пероксидазой сывороточные белки были обнаружены в перицитах, мюллеровских и периваскулярных микроглиальных клетках.
Резюмируя вышеизложенное, можно сказать, что происходит нарушение иммунорегуляции с ослаблением иммуносупрессивных, антипролиферативных факторов и сдвигом в сторону усиления хемотаксических реакций и факторов иммунного воспаления. Таким образом, изучение хемокинов имеет важное значение в понимании молекулярных механизмов опухолевого роста и его прогрессирования.
Заключение
Проведенный комплексный мультиплексный анализ 9 хемокинов семейств CC (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и CXC (CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α) показал их дисбаланс при УМ, который играет роль в патофизиологии опухолевого процесса. Доказано, что в слезной жидкости и сыворотке крови при УМ малых размеров отмечено значимое увеличение изучаемых хемоаттарактантных медиаторов, обладающих провоспалительным, проангиогенным и пролиферативным, вызывающим метастазирование, действием. Этот факт может свидетельствовать о раннем локальном и системном нарушении иммунитета при УМ, а выявление изучаемых хемокинов может послужить поводом для разработки таргетной терапии для пациентов с опухолями малых размеров.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Е.М., И.К., Н.Б., Л.К., С.С.
Сбор и обработка материала: Е.М., И.К.
Статистическая обработка: И.К.
Написание текста: Е.М.
Редактирование: Е.М., И.К., Н.Б., Л.К., С.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.