Несмотря на то что современные технологии лечения пациентов с нарушением проходимости слезоотводящих путей (СОП) и дакриоциститом в настоящее время достигли высокого уровня, положительный результат дакриоцисториностомии (ДЦР) — операции, направленной на создание искусственного соустья (дакриостомы) между полостью слезного мешка и средним носовым ходом, — по данным S. Leong и соавт. [1], проанализировавших результаты 73 научных работ, наблюдают в 65—100% случаев после вмешательства с наружным доступом и в 84—94% случаев с эндоназальным доступом. Таким образом, проблема повышения результативности ДЦР и предупреждения рецидива после нее по-прежнему является актуальной.

Известно, что одна из основных причин неудачного исхода ДЦР — избыточное рубцевание дакриостомы [2]. В таких случаях образование рубцовой ткани приводит к закрытию просвета дакриостомы и рецидиву заболевания [3]. Считается, что наиболее важную роль в данном процессе играет особый тип клеток, сочетающих в себе секреторную активность фибробластов и сократительную способность гладких миоцитов и называемых миофибробластами [4].

С целью предотвращения этого исхода были предложены ряд методик, таких как интубация дакриостомы силиконовыми лакримальными имплантатами [5—7], модификации техники формирования дакриостомы при оперативном вмешательстве [8—11] и применение Митомицина C интраоперационно [12—14]. Тем не менее большинство перечисленных методов не обладают достаточной результативностью в предотвращении рубцевания, а эффективность некоторых из них ставится рядом авторов под сомнение [7, 11, 13—16]. Поэтому поиск новых методов предотвращения избыточного рубцевания соустья после проведенной ДЦР остается основной задачей современной дакриологии.

Пирфенидон — антифибротический низкомолекулярный препарат, механизм действия которого основан на угнетении экспрессии ряда ключевых медиаторов фиброза [17, 18]. Препарат показал высокую эффективность в терапии идиопатического легочного фиброза [19]. В исследованиях ряда авторов пирфенидон оказывал выраженный антифибротический эффект при использовании в качестве средства адъювантной терапии при антиглаукомной хирургии [20], при лечении фибротической стадии эндокринной офтальмопатии [21], при хирургии птеригиума для предотвращения рецидива [22]. Однако антифибротическое действие пирфенидона при ДЦР до настоящего времени изучено не было. В предшествующей работе [23] нами были выявлены высокая антифибротическая эффективность и низкая токсичность препарата при исследовании на клеточной культуре фибробластов слизистой оболочки полости носа.

Цель исследования — экспериментальное обоснование эффективности пирфенидона в предотвращении рубцового заращения искусственного соустья после ДЦР.

Материал и методы

Исследование применения препарата «Пирфенидон» на экспериментальной модели ДЦР у кроликов было проведено на базе Центрального вивария ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет) в соответствии с международными рекомендациями по работе с лабораторными животными, Стокгольмской декларацией о гуманном обращении с лабораторными животными и одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «НИИ глазных болезней». В исследовании были использованы 18 кроликов-самцов породы шиншилла массой от 2 до 2,5 кг (18 СОП). Лабораторные животные были размещены в индивидуальных клетках с циклом смены дня и ночи, равным 12 ч, их кормление осуществляли ad libitum. До начала исследования все животные проходили акклиматизацию в течение 1 нед.

Обезболивание осуществляли следующим образом: для премедикации за 15 мин до введения средства для наркоза использовали 0,1% раствор атропина сульфата («Дальхимфарм», Россия) из расчета 0,04 мг/кг подкожно, далее выполняли внутримышечную инъекцию тилетамина гидрохлорида в сочетании с золазепамом гидрохлоридом (Золетил 100, Virbac Sante Animale, Франция) из расчета 10 мг/кг, для местной инфильтрационной анестезии использовали 0,5% раствор лидокаина гидрохлорида («Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», Россия), в конъюнктивальный мешок инстиллировали 0,5% раствор проксиметакаина гидрохлорида (Алкаин, Alcon-Couvreur N.V. S.A., Бельгия).

Всем кроликам оперативное вмешательство проводили с одной стороны — слева.

ДЦР выполняли под эндоскопическим контролем. После наступления анестезии зондировали нижний слезный каналец коническими зондами Зихеля возрастающего диаметра. Дакриостому формировали с помощью специального трепана (рис. 1).

Рис. 1. Этапы эндоназальной эндоскопической ДЦР у кролика.

а — вид трепана, проведенного в полость носа через нижний слезный каналец; б — эндоскопическая картина сформированной дакриостомы с введенным в нее трепаном (указан стрелкой).

Для получения необходимой концентрации препарата пирфенидон разводили дистиллированной водой, нагревая получившийся раствор до 60 °C в течение 30 мин на водяной бане. В эксперименте были использованы концентрации препарата 0,15 и 0,3 мг/мл. Инъекцию 1 мл получившегося раствора осуществляли специальной иглой в пять точек (по 0,2 мл в каждую точку) по краям сформированной дакриостомы (рис. 2).

Рис. 2. Эндоскопическая картина этапа введения пирфенидона в область дакриостомы (игла указана стрелкой).

Животным контрольной группы инъекции не выполняли.

На завершающем этапе операции проводили промывание СОП 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида через нижний слезный каналец. В конъюнктивальный мешок инстиллировали 0,25% раствор хлорамфеникола.

В соответствии с использованной дозой пирфенидона экспериментальные животные были разделены на три группы:

— 1-й группе (n=6; 6 СОП) пирфенидон вводили в концентрации 0,15 мг/мл;

— 2-й группе (n=6; 6 СОП) пирфенидон вводили в концентрации 0,3 мг/мл;

— 3-й группе (контрольная; n=6; 6 СОП) препарат не вводили.

До и после оперативного вмешательства (на 1, 3, 7, 14, 28-й день) оценивали проходимость СОП, промывая их 0,9% раствором натрия хлорида в условиях топической анестезии 0,5% раствором проксиметакаина гидрохлорида (Алкаин, Alcon-Couvreur N.V. S.A., Бельгия). Исход хирургического лечения признавали неудачным, если развивалась непроходимость СОП при промывании или закрытии просвета дакриостомы рубцовой тканью, выявленная при осмотре материала после вывода животного из эксперимента.

Вывод животных из эксперимента осуществляли на 7-й (n=6), 14-й (n=6) и 28-й день (n=6): по два кролика (два СОП) из каждой группы. Для этого в краевую ушную вену вводили избыточное количество раствора тиопентала натрия. Наступление смерти фиксировали по остановке дыхания и сердечной деятельности, отсутствию рефлексов.

Для получения материала из области дакриостомы выполняли горизонтальный распил носовой перегородки вдоль крыши носа до заднего края наружного носа, получившийся лоскут откидывали назад, частично удаляли носовые раковины для обнажения области дакриостомы. Для облегчения ориентирования в дакриостому вводили зонд, проводя его через слезный каналец (рис. 3). Материал, полученный путем выпиливания из области дакриостомы вокруг зонда, немедленно фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина (pH 7,0±0,2) и передавали для гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследования.

Рис. 3. Обнаженная полость носа кролика после горизонтального распила и откидывания лоскута.

Пуговчатый зонд Боумена проведен через слезный каналец в полость носа через дакриостому (указан стрелкой).

Далее полученный материал продолжали фиксировать в течение 24 ч в 10% растворе нейтрального формалина (pH 7,0±0,2). Фрагменты ткани после обезвоживания в гистопроцессоре карусельного типа STP120 (Thermo Fisher Scientific, Германия) заливали в парафин в модульной системе заливки TES-99 (Medite, Германия). Гистологические срезы толщиной 4 мкм изготавливали на ротационном микротоме HM340E (Microm GmbH, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином в автомате для окрашивания срезов HMS 70 (Thermo Fisher Scientific, Германия) [24].

Для ИГХ-исследования было использовано коммерческое моноклональное антитело Actin, Smooth Muscle (клон 1A4) фирмы Cell Marque (США) в разведении 1:400. Срезы для ИГХ-исследования толщиной 4 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, высушивали в течение 2 ч при температуре 58 °C, затем 18 ч при температуре 37 °C. Восстановление антигенной активности проводили в водяной бане WB-4MS (BioSan, Латвия) в Target Retrieval Solution pH 6 (Dako Denmark A/S, Дания). Дальнейшие операции с препаратами выполняли во влажной камере Slide Master (Bio-Optica Milano SpA, Италия). Инактивацию эндогенной пероксидазной активности осуществляли посредством инкубирования с блокирующим раствором (Dako Denmark A/S, Дания) в течение 15 мин. Инкубацию с первичными антителами проводили при температуре 4—8 °C в течение 18 ч. Далее следовала инкубация со вторичными антителами системы детекции REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse (Dako Denmark A/S, Дания) в течение 30 мин при комнатной температуре, с последующей двукратной инкубацией с диаминбензидином в хромогенном растворе в течение 3 мин при комнатной температуре. После каждого этапа обработки антителами срезы промывали в фосфатном солевом буфере (Cell Marque, США). На последнем этапе препараты докрашивали гематоксилином Майера (Dako Denmark A/S, Дания) и заключали в синтетическую смолу Shandon-Mount (Thermo Fisher Scientific, Германия). Также были проведены реакции в положительных и отрицательных контролях.

Гистологические и ИГХ-срезы анализировали, используя микроскоп AxioImager Z1 (Carl Zeiss AG, Германия). Фотосъемку осуществляли при помощи камеры AxioCam (Carl Zeiss AG, Германия) с последующей обработкой изображений в программе AxoVision, version 4.7 (Carl Zeiss AG, Германия). При морфологическом анализе оценивали состояние поверхностного эпителия слизистой оболочки полости носа области дакриостомы, наличие, характер и состав инфильтратов собственной пластинки слизистой оболочки, наличие и степень выраженности субэпителиального фиброза, наличие и выраженность плоскоклеточной (сквамозной) метаплазии поверхностного эпителия. Среднее количество α-SMA-позитивных клеточных элементов на 1 мм² вычисляли на основании подсчета в нескольких полях зрения для каждого образца.

Ввиду того что позитивное окрашивание по α-SMA характерно как для миофибробластов, так и для ряда клеток, наблюдаемых в гистологических срезах слизистой оболочки полости носа в норме (например, гладких миоцитов сосудистой стенки), подсчет α-SMA-позитивных клеточных элементов проводили на отдалении от крупных сосудов, а также использовали усредненные показатели подсчета в нескольких полях зрения.

Статистический анализ полученных данных выполнен с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics v23 (IBM Corporation, США). Для определения характера распределения в выборке использовали критерии Колмогорова—Смирнова и Лилиефорса для нормального распределения. Распределение считали отличным от нормального при p<0,05, в противном случае оно считалось нормальным. Для определения корреляционных зависимостей между значениями выборок использовали критерии U-теста Манна—Уитни. Статистические гипотезы принимали как значимые при p<0,05. Количественные данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение (M±SD).

Результаты

Из 18 включенных в эксперимент животных (18 СОП) положительный результат оперативного вмешательства на момент вывода из эксперимента наблюдали у всех животных, получавших инъекции пирфенидона в концентрациях 0,15 и 0,3 мг/мл (n=12; 12 СОП) вне зависимости от времени вывода из эксперимента, а также у двух кроликов (два СОП) контрольной группы, выведенных из эксперимента на 7-й день после оперативного вмешательства, — 77,7% случаев (n=14; 14 СОП).

У четырех кроликов контрольной группы (четыре СОП), выведенных из эксперимента на 14-й и 28-й день (по два кролика, два СОП соответственно) после оперативного вмешательства, наблюдали неблагоприятный исход ДЦР (22,3% случаев), связанный с рубцовым заращением дакриостомы в промежутке между 7-м и 28-м днем послеоперационного наблюдения (по данным промывания СОП).

При гистологическом исследовании образцов слизистой оболочки полости носа области дакриостомы, полученных от лабораторных животных, во всех образцах были выявлены явления фиброза, наиболее выраженные в 3-й (контрольной) группе животных на 14-й и 28-й день после ДЦР, протекавшие на фоне воспалительной инфильтрации, особенно заметной в образцах, полученных у животных всех групп на 7-й день после хирургического вмешательства. В изучаемом материале лабораторных животных 1-й группы на 7-й день после хирургического вмешательства отмечали наиболее выраженную воспалительную инфильтрацию. На 14-й день ослаблению воспалительной инфильтрации сопутствовало появление фибробластов в умеренном количестве. На 28-й день было выявлено дальнейшее ослабление воспалительной инфильтрации и отсутствие выраженного фиброза (рис. 4). В изучаемом материале лабораторных животных 2-й группы гистологическая картина на 7, 14, 28-й день после хирургического вмешательства была идентична гистологической картине изучаемого материала лабораторных животных 1-й группы (рис. 5). В изучаемом материале лабораторных животных 3-й (контрольной) группы на 7-й день после хирургического вмешательства гистологическая картина изучаемого материала была аналогична таковой лабораторных животных 1-й и 2-й групп. На 14-й и 28-й дни ослаблению воспалительной инфильтрации сопутствовала массированная инфильтрация ткани α-SMA-позитивными клеточными элементами (рис. 6, рис. 7).

Рис. 4. Гистологические образцы, полученные у лабораторных животных 1-й группы на разных этапах послеоперационного периода.

Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 5. Гистологические образцы, полученные у лабораторных животных 2-й группы на разных этапах послеоперационного периода.

Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 6. Гистологические образцы, полученные у лабораторных животных 3-й (контрольной) группы на разных этапах послеоперационного периода.

Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 7. Гистологические образцы, полученные у лабораторных животных 3-й (контрольной) группы на 14-й и 28-й день послеоперационного периода.

ИГХ-окрашивание по α-SMA.

В таблице представлены средние значения количества клеточных элементов, положительно окрашенных по α-SMA, в образцах, полученных от лабораторных животных.

Количественная характеристика миофибробластной инфильтрации в образцах, полученных от лабораторных животных

Количественная характеристика миофибробластной инфильтрации статистически значимо различалась между 1-й и 2-й группами животных, а также между ними и контрольной группой животных (p<0,05). Средние значения количества α-SMA-позитивных клеточных элементов в образцах также различались в зависимости от времени их получения, достигая пика на 14-й день после вмешательства, что было особенно выражено в контрольной группе животных (рис. 8).

Рис. 8. Динамика количества α-SMA-позитивных клеточных элементов в зависимости от времени забора образца слизистой оболочки полости носа.

Обсуждение

В исследовании была проведена оценка влияния низкомолекулярного препарата «Пирфенидон» на исход хирургического вмешательства на экспериментальной модели ДЦР у кроликов. Полученные данные свидетельствуют о выраженном ингибирующем эффекте препарата по отношению к процессу рубцевания, подтвержденном на морфологическом уровне.

За период наблюдения у животных не было отмечено системных побочных эффектов, наиболее часто встречающихся при применении пирфенидона, таких как рвота, анорексия, диарея, снижение аппетита, утомляемость, кожные высыпания [25]. Кроме того, на момент вывода из эксперимента не было выявлено признаков местного цитотоксического действия препарата, что подтверждает результаты проведенного нами ранее исследования in vitro [23] и данные ряда исследований [22, 26]. Таким образом, можно сделать вывод о том, что антифибротический эффект пирфенидона не связан с цитотоксическим действием. В настоящем исследовании на экспериментальной модели ДЦР препарат показал высокую антифибротическую эффективность в сочетании с отсутствием выраженного побочного действия, что согласуется с результатами исследований эффективности применения препарата при других глазных заболеваниях [20—22].

По данным исследований ряда авторов, ингибирующий эффект пирфенидона на миофибробласты реализуется посредством его влияния на экспрессию суперсемейства цитокинов трансформирующего фактора роста β [17] — ключевых медиаторов фиброза, влияющих на превращение фибробластов в миофибробласты. Пик экспрессии трансформирующего фактора роста β и пик активности миофибробластов наблюдают на 10—14-е сутки раневого процесса [4]. В контрольной группе животных заращение дакриостомы наступало именно в этот период. В то же время в 1-й и 2-й группах животных под воздействием местного применения пирфенидона проходимость искусственного соустья сохранялась на всем протяжении послеоперационного наблюдения.

В данной работе были использованы две концентрации препарата в 1-й и 2-й группах животных — 0,15 и 0,3 мг/мл соответственно, что обусловлено результатами предшествующего исследования по применению пирфенидона на клеточной культуре фибробластов слизистой оболочки полости носа, которое показало, что меньшие концентрации препарата не оказывают достаточно выраженного антифибротического эффекта, а дальнейшее повышение концентрации препарата приводит к увеличению цитотоксичности без нарастания антифибротического эффекта [23]. Необходимо отметить, что во 2-й группе животных, в которой пирфенидон применяли в концентрации 0,3 мг/мл, выявлено более выраженное подавление активности миофибробластов, однако клинически заживление послеоперационной раны в 1-й и 2-й группах животных было идентичным.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности и безопасности применения пирфенидона при ДЦР с целью предотвращения заращения соустья. Определение концентрации препарата, наиболее целесообразной для местного применения при ДЦР, требует дальнейшего изучения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.А., Н.К.

Сбор и обработка материала: Н.К., А.А., А.Ф.

Статистическая обработка: Д.Р., А.Ф.

Написание текста: Д.Р., А.А.

Редактирование: Е.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.