Наблюдаемое в последнее десятилетие развитие молекулярно-генетических методов в медицине позволяет надеяться на успешную идентификацию аллельных вариантов генов, которые детерминируют развитие заболевания при соприкосновении с определенными пусковыми экзогенными факторами.
Современная комплексная диагностика синдрома сухого глаза (ССГ) строится на основании соответствующих жалоб пациента, анамнестических данных, совокупности результатов функционального, инструментального и морфофункционального обследований, которые дополняют друг друга и позволяют получить наиболее полную картину. Для сокращения диагностических ошибок необходим поиск новых способов прогнозирования и выявления ССГ с дальнейшим внесением их в алгоритм обследования пациентов, имеющих факторы риска его развития.
В проведенных нами ранее исследованиях показана роль некоторых аллельных вариантов генов TRIM21, MUC1, THBS1, GTF2I, STAT4, PTPN22 в развитии сухого кератоконъюнктивита при таких аутоиммунных заболеваниях, как ревматоидный артрит и синдром Шегрена [1, 2]. Полученные результаты стали основанием для предположения о возможной роли этих маркеров в развитии ССГ не только аутоиммунной этиологии. ССГ — это многофакторное заболевание глазной поверхности, характеризующееся изменениями гомеостаза глазной поверхности и сопровождающееся глазными симптомами, этиология которых связана с дестабилизацией слезной пленки, гиперосмолярностью, воспалением, поражением структур глазной поверхности и нейросенсорными нарушениями [3]. В большинстве отечественных публикаций рассматриваемый симптомокомплекс именуют синдромом сухого глаза, а его клинические проявления объединяют термином «роговично-конъюнктивальный ксероз» различной степени выраженности [4].
Для практической медицины на протяжении уже многих лет не ослабевает важность этой проблемы, связанная с неуклонным ростом заболеваемости ССГ и достаточно широким его распространением среди населения развитых стран мира. По статистическим данным, ССГ страдают 15—17% больных офтальмологического профиля в возрасте до 40 лет и свыше 67% пациентов старше 50 лет, причем чаще женщины. Так, если по данным R. Marquardt и F. Wenz, относящимся к 1980 г., это заболевание зафиксировано у 30% пациентов офтальмологического профиля, то к настоящему времени этот показатель достигает уже 45% и более [5—8]. Причинами этого явления служат широкое распространение среди населения методов контактной коррекции зрения, увеличение числа лазерных рефракционных операций, внедрение в повседневную жизнь компьютерной техники и мобильных устройств, приводящих к развитию компьютерного зрительного (КЗС) и офисного синдромов. Все перечисленное можно отнести к экзогенным факторам воздействия на орган зрения, которым подвержены в основном люди молодого возраста. Развитие у них рассматриваемого симптомокомплекса служит основной причиной снижения зрительной работоспособности [9, 10]. По данным мировой статистики, до 70% пользователей персональных компьютеров страдают КЗС. Изменения, которые могут происходить в органе зрения при длительной работе с компьютером, — это появление (или прогрессирование уже имеющейся) миопии и дисфункция мейбомиевых желез с последующим развитием ССГ. Кроме этого, риск развития КЗС многократно возрастает при постоянной работе за персональным компьютером по 8 ч в день более 6—7 лет. В дальнейшем это приводит к нарушению стабильности прероговичной слезной пленки и, как результат, к ксеротическим изменениям роговицы и конъюнктивы. По данным исследований, КЗС является основной причиной развития ССГ у молодых пациентов [11]. Около 65% пользователей контактных линз имеют ССГ [12—14].
Возникает закономерный вопрос: почему у некоторых пользователей персональных компьютеров или контактных линз при всех прочих равных условиях все-таки не развивается ССГ? Очевидно, имеются дополнительные механизмы, определяющие риск развития патологического процесса на глазной поверхности. Вероятно, одним из объяснений может служить наличие генетической предрасположенности у человека. В настоящее время отсутствует информация о генах, играющих роль в патогенезе ССГ, не связанного с аутоиммунной патологией. В связи с этим одним из актуальных направлений исследований является выявление полиморфных маркеров генов, наличие которых может повысить риск развития ССГ при воздействии экзогенных факторов.
Цель исследования — определить взаимосвязь полиморфных маркеров rs7947461 гена TRIM21 и rs33996649 гена PTPN22 с риском развития синдрома сухого глаза экзогенной этиологии.
Материал и методы
Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с действующими нормативно-правовыми документами. В исследование включены 57 человек с клиническими факторами риска развития ССГ (основная группа), из которых 25 человек более 10 лет использовали контактные линзы; 32 человека около 8 ч в сутки проводили за монитором компьютера. Из числа обследованных 31 человек (17 мужчин, 14 женщин) в возрасте от 32 до 54 лет (средний возраст — 40,5 года) предъявляли жалобы на сухость глаз, покраснение, жжение, ощущение инородного тела, 26 человек жалоб не имели. С целью выявления признаков развития ССГ проведено стандартное и дополнительное офтальмологическое обследование.
При биомикроскопии переднего отрезка глаза у 31 человека, имевших субъективные жалобы, отмечены наличие гиперемии, незначительный отек век и конъюнктивы. Роговица прозрачная, влажная, сферичная. Среднее значение показателей теста Ширмера I — 7,3±1,0 мм; проба Норна — 6,1±1,0 с. Тесты с витальными красителями не выявили признаков поражения эпителия глазной поверхности. В результате у этих обследованных установлен диагноз двустороннего ССГ экзогенной этиологии; они составили 1-ю подгруппу.
У остальных 26 человек зафиксировано только снижение значений показателей теста Ширмера I (среднее значение — 11,3±1,0 мм); они выделены во 2-ю подгруппу.
В группу контроля включены 75 добровольцев без офтальмологической патологии в анамнезе и отягощенной наследственности, сопоставимые по полу и возрасту с участниками основной группы.
Оценку состояния глазной поверхности проводили с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и импрессионно-цитологического исследования конъюнктивы.
Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови с помощью протеинкиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Выделенные образцы ДНК хранили при температуре –20°C.
Для анализа частоты распределения генотипов полиморфных маркеров в исследуемых генах использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с последующим анализом кривых плавления продукта амплификации.
При работе использовали набор qPCRmix-HS SYBR, предназначенный для ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем SYBR Green I, в соответствии с протоколом производителя (ЗАО «Евроген», Россия). ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1х qPCRmix-HS SYBR, по 0,4 мкМ каждого праймера (табл. 1), 50—100 нг ДНК матрицы, в 96-луночных планшетах Optical Reaction Plate на амплификаторе Bio-Rad CFX96 qPCR System (Bio-Rad, США) по следующей программе: предварительная денатурация: 1 цикл, 95°C, 5 мин; ПЦР: 40 циклов (95°C — 30 c; 60°C — 30 с; 72°C — 30 с).
Таблица 1. Характеристика праймеров, условий и продуктов полимеразной цепной реакции
| № | Ген | SNP/Замена | Последовательность олигонуклеотидов | Тотж, °C | Продукт ПЦР, п.н. |
| 1 | TRIM21 | rs7947461/C>T | F: ACTCCAATTCTGTGGGCTGTCTCTTC R: GCTACCAAGAACATACAGTGAGGAAAGGAC | 60,0 | 354 |
| 2 | PTPN22 | rs33996649/C>T | F: TATTACCCCATGTTAGAAGAGCAGATGC R: GATGGAGCAAGACTCAGACACATGTTC | 60,0 | 240 |
Плавление продуктов амплификации производили в диапазоне 55—95°C с увеличением температуры на 0,5°C каждые 10 с. Обработка полученных данных осуществлена в программной среде Precision Melt Analysis Software (Bio-Rad Laboratories, США).
Статистическую обработку результатов при оценке частоты распределения генотипов полиморфных маркеров генов проводили с использованием закона генетического равновесия Харди—Вайнберга для аутосомных признаков. Вся статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета программ Statistica 6.1 RUS.
Корреляция предрасполагающих генотипов с результатами функциональных тестов, импрессионной цитологии конъюнктивы, лазерной конфокальной томографии роговицы (Heidelberg Retina Tomograph (HRT), Heidelberg Engineering GmbH, Германия) проведена в программе GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США). Для анализа хода и структуры нервных волокон роговицы (НВР) использовали авторское программное обеспечение Liner 1.2S [15—18]. При сравнении частот выявления генотипов применяли критерий Пирсона, а для малых выборок — точный критерий Фишера. Комплексная оценка связей между показателями основной группы и группы контроля заключалась в использовании логистической регрессии, определении отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI) и уровнем значимости, равным 0,05.
Результаты
Важными и информативными методами исследования роговицы и конъюнктивы принято считать HRT и импрессионно-цитологическое исследование конъюнктивы. В данном исследовании применены обе методики, позволяющие оценить степень тяжести поражения глазной поверхности.
При анализе данных HRT незначительные изменения структуры и хода НВР выявлены только у пациентов 1-й подгруппы (рис. 1). Значение коэффициента анизотропии составило 3,6.
Рис. 1. Сканограмма конфокальной биомикроскопии пациента с экзогенным синдромом сухого глаза.
Нервные волокна роговицы однонаправленны, вытянуты, местами четкообразной формы, хорошо контрастируют на темном фоне. Количество волокон не изменено.
При проведении импрессионно-цитологического исследования конъюнктивы изменения эпителия конъюнктивы по типу сухого глаза в стадии компенсации зафиксированы также только у пациентов 1-й подгруппы. Отмечены признаки асептического воспаления, по-видимому, в результате механического раздражения глазной поверхности. Выявлены дистрофические изменения эпителия: клеточный полиморфизм, сглаженные межклеточные границы, встречающиеся нечеткие контуры ядер, гомогенизированная цитоплазма, неравномерно распределенные (единичные в поле зрения или участки заместительной гиперплазии) бокаловидные клетки, отмечена выраженная лейкоцитарная инфильтрация (рис. 2, а, 2, б).
Рис. 2. Импрессионно-цитологическое исследование конъюнктивы пациента с экзогенным синдромом сухого глаза.
а — клеточный полиморфизм, сглаженные межклеточные границы, нечеткие контуры ядер, гомогенизированная цитоплазма; б — неравномерное распределение бокаловидных клеток. Выраженная лейкоцитарная инфильтрация. Окраска по Романовскому—Гимзе, ув. 400.
С помощью метода ПЦР в реальном времени с последующим анализом кривых плавления продукта амплификации проведен анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7947461 гена TRIM21 на выборке обследованных с установленным диагнозом экзогенного ССГ (n=31) и группы контроля (n=75) (рис. 3).
Рис. 3. Результат анализа полиморфного маркера rs7947461 (C>T) в гене TRIM21 с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени с последующим анализом кривых плавления продукта амплификации.
а — кривые накопления амплификации фрагмента ДНК полиморфного маркера rs7947461; б — температурные кривые плавления продукта амплификации фрагмента ДНК полиморфного маркера rs7947461. СС — контроль верхней гомозиготы (норма); СТ — контроль гетерозиготы; ТТ — контроль нижней гомозиготы (мутант).
Показано статистически значимое увеличение частоты встречаемости у исследуемых предрасполагающего генотипа ТТ полиморфного маркера rs7947461 гена TRIM21 в 1-й подгруппе по сравнению с группой контроля (p=0,004). При этом относительный риск развития ССГ оказался повышен в 2,5 раза. Сопоставляя данные генетических и клинических результатов обследований, можно говорить о корреляции между наличием генотипа ТТ маркера rs7947461 и развитием экзогенного ССГ (табл. 2, 3).
Таблица 2. Распределение частот генотипов полиморфного маркера rs7947461 гена TRIM21 у пациентов 1-й подгруппы и группы контроля
| Генотип | 1-я подгруппа (n=31) | Группа контроля (n=75) | χ2 | p | OR | |
| значение | 95% CI | |||||
| CC | 0,032 | 0,338 | 11,04 | 0,004 | 0,40 | 0,21—0,75 |
| CT | 0,516 | 0,338 | 1,11 | 0,61—2,00 | ||
| TT | 0,452 | 0,324 | 2,51 | 1,33—4,72 | ||
Примечание. n — объем выборки; χ2 — значение критерия хи-квадрат; p — статистическая значимость; OR (odds ratio) — отношение шансов; 95% CI — 95%-й доверительный интервал (confidence interval).
Таблица 3. Распределение частот генотипов полиморфного маркера rs33996649 гена PTPN22 у пациентов 1-й подгруппы и группы контроля
| Генотип | 1-я подгруппа (n=31) | Группа контроля (n=75) | χ2 | p | OR | |
| значение | CI95% | |||||
| CC | 0,506 | 0,871 | 12,37 | 0,002 | 0,21 | 0,08—0,55 |
| CT | 0,390* | 0,097 | 1,58 | 0,87—2,88 | ||
| TT | 0,104 | 0,032 | 4,86 | 1,83—12,90 | ||
Примечание. * — распределение частот не соответствует равновесию Харди—Вайнберга; n — объем выборки; χ2 — значение хи-квадрат; p — статистическая значимость; OR (odds ratio) — отношение шансов; CI95% — 95% доверительный интервал (Confidence Interval).
Выявлена ассоциация полиморфного маркера rs33996649 гена PTPN22 с риском развития ССГ (рис. 4). Показано статистически значимое — в 3,3 раза увеличение частоты предрасполагающего генотипа у пациентов 1-й подгруппы по сравнению с участниками группы контроля (p=0,002). При этом относительный риск оказался повышен в 4,86 раза.
Рис. 4. Результат анализа мутации полиморфного маркера rs33996649 гена PTPN22 с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени с последующим анализом кривых плавления продукта амплификации.
а — кривые накопления полиморфного маркера rs33996649 гена PTPN22 в реальном времени; б — температурные кривые плавления продукта амплификации полиморфного маркера rs33996649 гена PTPN22. СС — контроль верхней гомозиготы (норма); СТ — контроль гетерозиготы; ТТ — контроль нижней гомозиготы (мутант).
При сравнении результатов генотипирования, полученных при обследовании пациентов 2-й подгруппы (n=26) (без клинико-функциональных признаков ССГ, но имеющих в анамнезе длительное воздействие экзогенных факторов) и участников группы контроля (n=75), статистически значимые различия не обнаружены (p=0,3).
Обсуждение
Традиционно комплексная диагностика ССГ основана на анализе жалоб пациента, анамнестических данных, совокупности результатов клинико-функционального, инструментального и морфологического обследований. Исследования дополняют друг друга и позволяют получить наиболее полную картину изменений глазной поверхности.
Проведенная HRT не выявила выраженных отклонений от нормы у пациентов 1-й подгруппы. Лишь местами определяли четкообразное строение нервных волокон. С помощью импрессионно-цитологического исследования конъюнктивы обнаружены изменения эпителия конъюнктивы по типу сухого глаза в стадии компенсации. У пациентов 2-й подгруппы при сниженном общем объеме слезопродукции изменений показателей HRT и импрессионно-цитологического исследования не было.
В ходе проведенных генетических исследований обнаружено значимое увеличение частоты предрасполагающего генотипа обоих полиморфных маркеров у пациентов 1-й подгруппы. При сравнении результатов с данными мировых исследований установлено, что полиморфный маркер rs7947461 гена TRIM21 для этого вида патологии не изучен. Следует отметить, что, как и в ситуации с предыдущим полиморфным маркером, мировые данные о маркере rs33996649 гена PTPN22 в отношении развития ССГ не представлены. Однако оба маркера известны, показана их роль в риске развития других многофакторных заболеваний, в частности диабета и системной красной волчанки [18, 19].
Заключение
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что наличие маркера rs7947461 гена TRIM21 и маркера rs33996649 гена PTPN22 может служить фактором риска развития синдрома сухого глаза. Поскольку одной из наших задач была попытка найти способ малоинвазивной ранней диагностики синдрома сухого глаза, можно заключить, что оценка распределения частот данных полиморфных маркеров исследованных генов способна служить инструментом первичного скрининга синдрома сухого глаза экзогенной этиологии.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Сафонова Т.Н., Зайцева Г.В.
Сбор и обработка материала: Сафонова Т.Н., Зайцева Г.В.
Статистическая обработка данных: Зайцева Г.В.
Написание текста: Зайцева Г.В., Сафонова Т.Н.
Редактирование: Сафонова Т.Н., Логинов В.И., Бурденный А.М.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.