Микрофлора глаза в норме представляет собой микробиоценоз, состоящий из грамположительных бактерий, к которым относятся коагулазонегативные стафилококки (КНС), в частности Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, и коагулазоположительные стафилококки — Staphylococcus aureus, ряд других бактерий, например Propionbacterium spp., а также грамотрицательные бактерии Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, различные плесневые грибы, такие как Fusarium spp., Cephalosporium spp. В ходе исследования влияния антибактериальной терапии на состав и свойства микрофлоры конъюнктивы при интравитреальных инъекциях [1—3] нами выявлен рост микрофлоры в 48,3% мазков. Среди изолятов, которые были выделены с конъюнктивы у пациентов разных групп, преобладали грамположительные стафилококки (93,2%), а среди них — КНС (87,3%).
Вследствие травмы, операции или в условиях иммунодефицита бактерии, заселяющие глазную поверхность, могут вызывать инфекционные заболевания глаз (кератит, эндофтальмит и др.), часто приводящие к потере зрения вследствие несвоевременной и некорректной антимикробной терапии. Терапия инфекционных заболеваний глаз обычно назначается эмпирически: до получения результатов микробиологических исследований — идентификации возбудителя инфекции и оценки его резистентности к антимикробным средствам [4, 5].
При исследовании микрофлоры конъюнктивы у пациентов с инфекционными заболеваниями глаз выделяются как грамположительные (68,5%), так и грамотрицательные (29,8%) виды бактерий [6]. Грамотрицательные бактерии, наиболее часто вызывающие глазные инфекции, включают P. aeruginosa, E. coli и Enterobacter spp. [7], причем самым часто выделяемым патогеном является P. aeruginosa [8]. Среди представителей рода Pseudomonas распространена множественная лекарственная устойчивость, а острота зрения у пациентов после перенесенного эндофтальмита, вызванного этими бактериями, очень низкая. P. aeruginosa известна своей высокой степенью адаптации к различным средам [9]. Сниженная чувствительность к антибиотикам и дезинфицирующим средствам широко распространена у клинических изолятов P. aeruginosa [10—12], что затрудняет лечение инфекционных заболеваний, вызванных этими бактериями. P. aeruginosa обладает не только хромосомными генами устойчивости ко многим противомикробным препаратам, но также способностью приобретать мобильные генетические элементы (англ. mobile genetic elements — MGE) [13, 14]. Этот механизм лежит в основе возникновения и быстрого распространения лекарственной устойчивости [9].
E. coli относится к группе колиморфных бактерий, является комменсалом в кишечнике человека и других теплокровных млекопитающих [15] и обладает высокой степенью генотипического и фенотипического разнообразия. E. coli также обитает на поверхности глаза и внутренней поверхности век и является возбудителем примерно 1,1% всех глазных инфекций [16], таких как кератит [17], эндофтальмит [18, 19], панофтальмит [20], абсцесс века [21] и конъюнктивит [22]. Обычно инфекция, вызванная данной бактерией, быстро проходит после лечения антибактериальными средствами. Однако в последние годы обнаруживается возрастающая устойчивость E. coli к противомикробным препаратам. Так, 10 из 12 изолятов E. coli с конъюнктивы, роговицы, из стекловидного тела или слезного мешка пациентов были устойчивы по меньшей мере к одному или нескольким из девяти протестированных антибиотиков. У большинства (8/10) устойчивых к антибиотикам глазных изолятов E. coli обнаружена тесная связь между устойчивостью к антибиотикам и способностью образовывать биопленки [23, 24]. Бактерии в биопленке проявляют повышенную устойчивость к антибиотикам благодаря нескольким факторам: связыванию антибиотиков с внеклеточными полимерными веществами, выработке ферментов, которые инактивируют антибиотики, повышению эффективности эффлюксных насосов, тонкой регуляции генов, связанных с лекарственной устойчивостью [25, 26]. Подавляющее количество изолятов (85%), выделенных с поверхности искусственных оптических линз, представляющих собой P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, Micrococcus luteus, Serratia marcescens, Neisseria spp., Moraxella spp., Bacillus spp., E. coli, Proteus mirabilis, Enterobacter agglomerans, Klebsiella spp., продемонстрировали способность образовывать биопленки и были устойчивы к антибиотикам [27].
В глазной хирургии, в частности в хирургии интравитреальных инъекций (ИВИ), существует сложная проблема выбора оптимального средства антибактериальной терапии для профилактики или борьбы с инфекционными послеоперационными осложнениями. Инфекционный эндофтальмит, возникающий после проведения ИВИ, является наиболее опасным осложнением из-за плохого прогноза, связанного с тяжелой и необратимой потерей зрения. Первоначально, на заре эпохи ИВИ, с целью антимикробной профилактики широко использовали антибиотики местного действия, поскольку их применение указано во многих протоколах клинических исследований. Однако антибиотики местного действия, используемые при ИВИ, имеют ряд недостатков, в том числе узкий спектр антибактериальной активности, длительное время, необходимое для проявления бактерицидного эффекта, низкий уровень концентрации в стекловидном теле [28]. Показано, например, что 0,5% моксифлоксацин и 0,3% гатифлоксацин достигают витреальной полости в невоспаленном глазу, однако все показатели концентрации в стекловидном теле были ниже 90% минимальной ингибирующей концентрации для основных бактериальных патогенов, вызывающих острый бактериальный эндофтальмит [29]. Во многих исследованиях доказано отсутствие эффективности антибиотиков местного использования в профилактике постинъекционного эндофтальмита [30—32], а также, что повторное использование данных антибиотиков может потенциально привести к селекции резистентных штаммов [33—35] и даже повысить риск развития указанного заболевания [36]. Прекращение применения местных антибиотиков при ИВИ не увеличивало частоту возникновения эндофтальмита [37]. При выполнении 12 523 инъекций антибиотики не использовали ни до, ни после ИВИ, а применяли лишь повидон-йод во время процедуры — и эндофтальмит не развился [28].
Альтернативным методом обработки глаза, используемым в хирургии ИВИ и по эффективности сопоставимым с действием повидон-йода, является применение антисептиков из группы бигуанидов. Водный раствор хлоргексидина, используемый как антисептическое средство до ИВИ, хорошо переносится пациентами и эффективен, что подтверждается низкой частотой случаев развития эндфотальмита [38]. После обработки 0,05% раствором хлоргексидина наблюдалось значительное уменьшение общей бактериальной нагрузки конъюнктивы (82%), а еще более убедительные результаты отмечены по отношению к КНС (90%) [39].
Как показано в наших исследованиях [2, 3], другой бигуанид — пиклоксидина дигидрохлорид (N,N’’-бис[[(4-хлорфенил)амино]иминометил]-1,4-пиперазиндикарбоксимидамид дигидрохлорид) проявляет высокую активность в отношении конъюнктивальных изолятов стафилококков. Независимо от антибиотикорезистентности изолятов минимальная бактерицидная концентрация пиклоксидина дигидрохлорида составляет 31,25 мкг/мл. С учетом важнейшей роли грамотрицательных бактерий в развитии посттравматических и постоперационных инфекций представляется интересным изучить бактерицидное действие пиклоксидина в отношении этих минорных в микрофлоре глаза видов бактерий.
Цель исследования — изучить влияние антисептика пиклоксидина гидрохлорида на выделенные с конъюнктивы грамотрицательные бактерии E. coli, P. luteola и P. aeruginosa.
Материал и методы
В исследование включены изоляты E. coli, P. luteola и P. aeruginosa, полученные из посевов проб конъюнктивы пациентов. Посев выполняли на транспортную систему со средой Эймса, при взятии материала контакт с кожей ресниц и веками исключен. Идентификацию микроорганизмов и исследование антибиотикочувствительности проводили на панели NMIC/ID-400 с помощью автоматизированного бактериологического анализатора BD Phoenix 100 (Becton Dickinson, США).
Для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) использовали метод серийных разведений антисептика пиклоксидина дигидрохлорида в жидкой питательной среде. Выращивание культур осуществлялось при 37°C в течение 24 ч на агаре Columbia (Becton Dickinson, США) с добавлением 5% бараньей крови. Материал агаровых культур суспендировали в фосфатном буфере (PBS, pH 7,4) до показателя мутности 0,5 МакФарланда (McF). По 20 мкл суспензий бактерий вносили в 200 мкл триптиказо-соевого бульона (TSB; Becton Dickinson, США) без добавок или с разведениями, соответствующими концентрациям пиклоксидина дигидрохлорида 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 62,5 мкг/мл и 31,25 мкг/мл. Культуры выращивали в стерильных 96-луночных планшетах при 37°C. О росте изолятов судили по увеличению оптической плотности культур, которую регистрировали при 490 нм с помощью анализатора Wallac 1420 (Victor 2) (Perkin Elmer, США) в начальный момент времени, при внесении бактерий в жидкую питательную среду, а также через 24 ч и 96 ч роста. МПК определяли как минимальную концентрацию, при которой рост тест-культур отсутствовал через 24 ч культивирования, а МБК — через 96 ч культивирования.
Влияние кратковременных (до 1 ч) воздействий пиклоксидина дигидрохлорида на бактерии в суспензиях (108 КОЕ/мл) проводили или непосредственно в глазных каплях, содержащих пиклоксидина дигидрохлорид в концентрации 500 мкг/мл, или при их разведении от 1:1 до 1:16 натрий-фосфатным буферным раствором. После инкубации пробы высевали на агар Columbia (Becton Dickinson, США) и культивировали в течение 24 ч. О связывании катионных молекул пиклоксидина с клетками грамотрицательных бактерий судили по нейтрализации поверхности бактерий возрастающими количествами антисептика с помощью измерения поверхностного потенциала (дзета-потенциала). Бактериальные клетки, выращенные при 37°C в течение 24 ч, суспендировали (до показателя мутности 0,3 McF) в среде, содержащей глюкозу 50 мг/мл, Твин 80 0,25 мг/мл (входят в качестве дополнительных компонентов в содержащие пиклоксидина дигидрохлорид глазные капли) без добавления антисептика, а также в глазных каплях, содержащих 500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида без разведения или в разведениях до 1:50 натрий-фосфатным буфером. Через 5—15 мин после суспендирования проводили измерение дзета-потенциала с использованием анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания).
Исследование ультраструктуры бактериальных клеток проводили с помощью двухлучевого сканирующего ионно-электронного микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, США). Образцы не подвергали дегидратации, напыляли электронопроводящим слоем золота толщиной 5 нм (проба Au999), используя модуль для напыления SPI-MODULE Sputter Coater (SPI Supplies, США).
Результаты
Чувствительность к антибиотикам
Среди грамотрицательных бактерий, выделенных из 120 конъюнктивальных проб, полирезистентные изоляты не выявлены. Изоляты E. coli и P. luteola были чувствительны ко всем исследуемым антибиотикам панели NMIC/ID-400. Изолят P. aeruginosa обладал резистентностью к триметоприм/сульфаметоксазолу и промежуточной резистентностью к азтреонаму.
Действие пиклоксидина дигидрохлорида на изоляты грамотрицательных бактерий
В соответствии с динамикой роста в жидкой питательной среде, содержащей пиклоксидина дигидрохлорид в концентрациях от 62,5 до 250 мкг/мл, увеличение плотности культур E. coli не наблюдалось как через 24 ч, так и через 96 ч культивирования. При концентрации антисептика 31,25 мкг/мл отмечали увеличение плотности культур. Таким образом, для E. coli МПК=МБК и составляла 62,5 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида (табл. 1).
Таблица 1. Минимальные подавляющие рост и минимальные бактерицидные концентрации пиклоксидина дигидрохлорида в отношении конъюнктивальных изолятов бактерий при росте на жидкой питательной среде
| Изоляты | МПК, мкг/мл | МБК, мкг/мл |
| Escherichia coli | 62,5 | 62,5 |
| Pseudomonas luteola | 15,625 | 31,25 |
| Pseudomonas aeruginosa | Больше 250 | Больше 250 |
| Staphylococcus aureus (данные по 5 изолятам)* | 15,625 | 15,625 |
| КНС (данные по 43 изолятам)* | 15,625 | 15,625 |
Примечание. * — по данным [2, 3]; МПК — минимальная подавляющая концентрация; МБК — минимальная бактерицидная концентрация; КНС — коагулазонегативные стафилококки.
Изолят P. aeruginosa обладал существенно большей устойчивостью к антисептику: через 24 ч и 96 ч культивирования рост отмечен даже при наибольшей используемой в данном тесте концентрации — 250 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида. Чувствительность к антисептику другого вида псевдомонад — P. luteola оказалась на уровне грамположительных изолятов: МПК составила 15,625 мкг/мл, а МБК — 31,25 мкг/мл (см. табл. 1).
Инкубация E. coli или P. aeruginosa (108 КОЕ/мл) непосредственно в неразведенных глазных каплях с содержанием 500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида в течение 15 мин приводила к полной потере жизнеспособности бактерий (табл. 2), что подтверждалось при последующем высевании и культивировании изолятов на твердой питательной среде при 37°C в течение 24 ч.
Таблица 2. Бактерицидное и нейтрализующее поверхностный заряд клеток действие пиклоксидина дигидрохлорида при инкубации конъюнктивальных изолятов бактерий в глазных каплях без разведения (500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида)
| Изоляты | Инкубация | |||
| без пиклоксидина дигидрохлорида | с добавлением пиклоксидина дигидрохлорида 500 мкг/мл в течение 15 мин | |||
| КОЕ/мл | Дзета-потенциал, мВ | КОЕ/мл | Дзета-потенциал, мВ | |
| Escherichia coli | 108 | –14,7 | 0 | +3,3 |
| Pseudomonas aeruginosa | 108 | –24,2 | 0 | –3,1 |
Примечание. КОЕ — колониеобразующие единицы.
Увеличение времени инкубации бактерий с антисептиком до 60 мин позволило достичь полной инактивации микроорганизмов при сниженной в 16 раз концентрации пиклоксидина дигидрохлорида (31,25 мкг/мл; глазные капли с разведением 1:16 натрий-фосфатным буфером). Полученные данные свидетельствуют о том, что для достижения полной инактивации грамотрицательных бактерий в буферном растворе требуются более низкие концентрации пиклоксидина дигидрохлорида по сравнению с жидкой питательной средой. Очевидно, компоненты питательной среды влияют на процесс взаимодействия пиклоксидина дигидрохлорида с бактериальными клетками, ослабляя действие антисептика.
В отсутствие антисептика клетки бактерий несли отрицательный поверхностный заряд: дзета-потенциал составлял –14,7 мВ для E. coli и –24,2 мВ для P. aeruginosa. При добавлении возрастающих количеств пиклоксидина дигидрохлорида наблюдали сдвиг дзета-потенциала клеток E. coli в сторону менее отрицательных (нейтральных) значений (см. табл. 2, рис. 1). В неразведенном препарате глазных капель, содержащих 500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида, клетки E. coli принимали положительный заряд: +3,3 мВ. Нейтрализация дзета-потенциала клеток P. aeruginosa происходила только в неразведенном препарате глазных капель, содержащих 500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида, при этом клетки P. aeruginosa приобретали слабоотрицательный дзета-потенциал: –3,12 мВ.
Рис. 1. Дзета-потенциал клеток E. coli и P. aeruginosa в присутствии 10—500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида и без него.
Ультраструктура бактериальных клеток при воздействии пиклоксидина дигидрохлорида
У клеток E. coli, потерявших способность к колониеобразованию при воздействии 500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида в течение 15 мин или 31,25 мкг/мл в течение 60 мин, наблюдали образование пор в клеточных стенках размером 23—82 нм, разрывы клеточных стенок на полюсах клеток, уменьшение длины клеток (рис. 2).
Рис. 2. Результат сканирующей электронной микроскопии. Морфология клеток E. coli.
а1, а2 — без воздействия пиклоксидина дигидрохлорида; при воздействии пиклоксидина дигидрохлорида: б1, б2 — 500 мкг/мл 15 мин; б3, б4 — 31,25 мкг/мл 60 мин.
У клеток P. aeruginosa, которые инактивировали пиклоксидина дигидрохлоридом в концентрации 31,25 мкг/мл в течение 60 мин, наблюдали уменьшение длины клеток (рис. 3). При воздействии 500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида (неразведенные глазные капли) происходило слипание клеток, образование конгломератов клеток, погруженных в аморфное вещество.
Рис. 3. Результат сканирующей электронной микроскопии. Морфология клеток P. aeruginosa.
а1, а2 — без воздействия пиклоксидина дигидрохлорида; при воздействии пиклоксидина дигидрохлорида: б1, б2 — 500 мкг/мл 15 мин; б3, б4 — 31,25 мкг/мл 60 мин.
Обсуждение
Бактерии-комменсалы глазной поверхности играют роль в поддержании гомеостаза, а нарушение микробиоценоза (дисбиоз), вызванное каким-либо заболеванием или применением лекарственных средств (антисептиков, антибиотиков, противовоспалительных препаратов), может приводить к развитию воспалительной реакции.
Бактерии рода Pseudomonas, которые обычно не являются частью нормальной микрофлоры глаза, тем не менее обнаружены во многих исследованиях, даже в тех, в которых использовались строгие процедуры фильтрации, что подтверждает гипотезу о том, что глазная поверхность регулярно подвергается воздействию потенциально опасных микроорганизмов и должна им противостоять [40].
В настоящее время соблюдение строгих правил асептики и антисептики с применением местного антисептика повидон-йода является признанным методом профилактики эндофтальмита после внутриглазных хирургических вмешательств [29, 37]. Повидон-йод обладает следующими достоинствами: (1) отсутствием риска селекции устойчивых бактерий, (2) широким антимикробным спектром и (3) коротким сроком реализации бактерицидного эффекта [28]. Повидон-йод проявляет бактерицидный эффект в течение 15—120 с, в то время как для достижения такого же эффекта антибактериальным глазным каплям с антибиотиками требуется 15—60 мин [41]. Хлоргексидин, катионный антисептик из группы бигуанидов, также успешно зарекомендовал себя как средство для стерилизации глазной поверхности при проведении операций. Однако в исследовании, проведенном К.Г. Косяковой и соавт., установлен высокий уровень устойчивости грамотрицательных бактерий к хлоргексидину (МИК90 от 16 мг/л до 256 мг/л) [42]. В тестах in vitro мы показали высокую бактерицидную активность другого бигуанида, пиклоксидина дигидрохлорида, в отношении конъюнктивальных изолятов стафилококков при концентрациях 15,6—31,2 мкг/мл, близких к таковым для хлоргексидина. В этих концентрациях пиклоксидина дигидрохлорид обладает деструктивным свойством в отношении поверхностных структур КНС, преобладающих в микробиоме глаза [2].
В данном исследовании мы установили, что чувствительность E. coli к антисептику выше по сравнению с P. aeruginosa, однако при воздействии препарата в концентрации 500 мкг/мл (в составе глазных капель) в течение 15 мин происходила полная гибель обеих бактерий. При сравнении с результатами, полученными в аналогичном исследовании грамположительной флоры [2], чувствительность грамотрицательной флоры к пиклоксидина дигидрохлориду оказалась ниже, чем у грамположительных стафилококков. Бактерицидный эффект пиклоксидина дигидрохлорида по отношению к P. aeruginosa достигался только при воздействии полной концентрации препарата в глазных каплях.
Клеточные стенки являются первой линией защиты бактерий от действия различных биоцидов. У грамотрицательных видов клеточные стенки содержат наружную мембрану — асимметричный бислой, внешний листок которого построен преимущественно из липополисахаридов. Как показано для P. aeruginosa, снижение общей проницаемости наружной мембраны является одним из механизмов выработки перекрестной резистентности к антимикробным агентам [43]. В то же время отрицательный заряд клеточных стенок бактерий способствует электростатическому связыванию положительно заряженных молекул биоцидов, например антисептиков из группы бигуанидов. Как показано в данном исследовании, в присутствии 10—500 мкг/мл пиклоксидина дигидрохлорида происходит нейтрализация отрицательного дзета-потенциала E. coli, а при 500 мкг/мл — P. aeruginosa. Уменьшение заряда поверхности бактериальных клеток приводит к их слипанию, что мы наблюдали у обоих видов бактерий при обработке пиклоксидина дигидрохлоридом.
Для хлоргексидина показано, что молекулы этого бигуанида быстро, в течение 20 с, поглощаются клетками бактерий, преодолевают (вероятно, путем пассивной диффузии) клеточную стенку и наружную мембрану, атакуя цитоплазматическую мембрану [44]. Последняя является основной мишенью бигуанидов [44—47], в то время как повреждения наружной мембраны, как предполагалось, не критичны и не вызывают лизиса клеток [44]. Действительно, мы не наблюдали видимых нарушений целостности клеточных стенок у инактивированных пиклоксидина дигидрохлоридом клеток P. aeruginosa (см. рис. 3). У некоторых клеток E. coli, обработанных пиклоксидина дигидрохлоридом в концентрации 500 мкг/мл в течение 15 мин, обнаруживались повреждения клеточных стенок в виде пор и разрывов на полюсах, которые особенно ярко проявлялись при длительных, до 60 мин, сроках обработки пиклоксидина дигидрохлоридом даже в сниженной до 31,25 мкг/мл концентрации (см. рис. 2). Катионные антисептики хлоргексидин и пиклоксидина дигидрохлорид связываются с содержащей отрицательно заряженные липиды цитоплазматической мембраной бактерий за счет электростатических сил. Методами молекулярного моделирования нами показано, что при действующих концентрациях антисептиков, соответствующих соотношению с липидами 1:4, 1:8 и 1:24, молекулы антисептиков полностью адсорбируются на мембране, принимая форму скобы, при этом их незаряженные участки ориентированы в сторону гидрофобной части бислоя, а положительно заряженные группы колокализованы с отрицательно заряженными фосфатными группами липидов на поверхности мембраны. Внедрение молекул антисептиков вызывало локальные флуктуации толщины мембраны, подвижности липидов, снижало порог электропорации бактериальных мембран [48]. На снимках, полученных в настоящей работе при исследовании морфологии клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии, видно, что инактивированные пиклоксидина дигидрохлоридом клетки P. aeruginosa окружены аморфным веществом, что, очевидно, отражает выход содержимого клеток через разрушенную цитоплазматическую мембрану.
Заключение
В данном исследовании in vitro впервые исследованы эффективность и механизм бактерицидного действия антисептика пиклоксидина дигидрохлорида в отношении грамотрицательных конъюнктивальных изолятов. Результаты исследования позволяют сделать вывод о достаточно высоком бактерицидном потенциале антисептика. Это открывает перспективу использования данного антисептика как альтернативы частому профилактическому использованию местных антибактериальных средств без риска выработки лекарственной устойчивости микрофлоры глазной поверхности, в частности при проведении ежемесячных курсов интравитреальных инъекций.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Будзинская М.В., Страховская М.Г., Халатян А.С., Жуховицкий В.Г., Шевлягина Н.В.
Сбор и обработка материала: Халатян А.С., Страховская М.Г., Холина Е.Г., Шевлягина Н.В.
Статистический анализ данных: Страховская М.Г., Халатян А.С.
Написание текста: Халатян А.С., Страховская М.Г.
Редактирование: Будзинская М.В., Страховская М.Г., Жуховицкий В.Г.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.