Наследственные оптические нейропатии (НОН) — группа генетически гетерогенных заболеваний зрительного нерва, которые в зависимости от наследования подразделяются на несколько групп. Наследственная оптическая нейропатия Лебера (НОНЛ) возникает при мутациях митохондриальной ДНК (мтДНК), которые передаются только от матери детям (материнское наследование). Чаще болеют лица мужского пола, соотношение мужчины:женщины — 8,2:1. По данным наблюдаемой в НИИ глазных болезней выборки из 83 пациентов с НОНЛ, женщины преимущественно являются бессимптомными носителями мутантного гена. Аутосомно-доминантная оптическая нейропатия (АДОН) возникает при мутациях ядерной ДНК (яДНК), которые переходят или от отца, или от матери. Среди наблюдаемых в институте 114 пациентов с НОН на долю АДОН приходится 6,1% (7 пациентов из 5 семей: 4 женщины, 3 мужчин), на долю аутосомно-рецессивной оптической нейропатии (АРОН), несиндромальную форму которой ранее связывали в основном с близкородственными браками, — 21% случаев.
НОН относят к группе митохондриальных заболеваний, в основе патогенеза которых лежит нарушение функции митохондрий вследствие повреждения митохондриального или ядерного генома. Количество митохондрий в каждой клетке может варьировать в широких пределах, от сотен до тысяч, что напрямую связано с энергетическими потребностями клетки. Процесс передачи визуальной информации требует больших затрат энергии [1], поэтому содержание митохондрий в клетках зрительного анализатора, в частности в ганглиозных клетках сетчатки (ГКС), повышено и качество зрения непосредственно зависит от функции митохондрий, что подтверждают снижение контрастной и цветовой чувствительности, развитие оптической нейропатии, пигментной ретинопатии или слепоты у подавляющего большинства пациентов с митохондриальной патологией [2].
Это орфанные заболевания, которые встречаются с частотой 1 случай на 10 000 или 50 000 населения в зависимости от региона и являются причиной слепоты и слабовидения преимущественно у людей молодого и среднего возраста. Среди всех пациентов с неглаукомной оптической нейропатией НОН по обращаемости в 2019 г. в НИИ глазных болезней составила 6,5%.
Клиническая картина НОН выражена специфическими изменениями: двусторонним одновременным или последовательным безболезненным снижением зрения с развитием центральных скотом и нарушением цветового зрения. Характерным для НОН является то, что заболевание начинается с первичного поражения ГКС, в большинстве случаев отмечена пастозность диска зрительного нерва (ДЗН) с отеком перипапиллярного слоя нервных волокон сетчатки (СНВС). По мере прогрессирования заболевания происходит повреждение аксонов ГКС и развивается частичная атрофия зрительного нерва (ЧАЗН) с преимущественной потерей СНВС папилломакулярного пучка [3].
Такие структурные изменения специфичны для НОН в острой стадии заболевания. Среди выборки из 114 пациентов с генетически подтвержденной НОН только у 47% пациентов были обнаружены подобные изменения, так как они обратились за консультацией в острую стадию заболевания.
Однако в хронической стадии заболевания формируется ЧАЗН с истончением и СНВС, и ГКС. Выявление этиологии заболевания на этой стадии требует тщательной дифференциальной диагностики с оптической нейропатией другого генеза.
Проблема диагностики НОН у таких пациентов также возникает в том случае, если снижение зрения на втором глазу происходит отсроченно, иногда через 4—12 мес. За это время пациент с некорректным диагнозом «неврит зрительного нерва» успевает получить кортикостероидную, противовирусную и антибактериальную терапию, которая еще более ухудшает митохондриальный биогенез.
Как правило, при НОНЛ потеря зрительных функций происходит резко, в основном у лиц молодого и среднего возраста, возраст дебюта заболевания составляет 18—31 год. При АДОН снижение зрения постепенное, начиная с раннего детства, что важно учитывать при дифференциальной диагностике наследственной патологии.
В нашем исследовании было замечено, что у пациентов с НОНЛ снижается уровень фолиевой кислоты ниже или на границе нижней цифры референсных значений, а также по сравнению с этим показателем у пациентов с оптической нейропатией иного генеза и в группе здоровых добровольцев. Содержание витамина В12 в сыворотке крови у большинства пациентов с НОНЛ находится в пределах референсных значений, однако значимо отличается от указанного содержания в группе здоровых добровольцев.
Предполагается, что дефицит фолиевой кислоты в организме может приводить к нарушению переноса электронов по электронтранспортной цепи митохондрий, приводя к истощению запасов энергии (из-за снижения продукции АТФ) и накоплению активных форм кислорода. Недостаток фолиевой кислоты не только препятствует процессу переноса электронов, но и способствует повышению уровня токсичного формиата (соли муравьиной кислоты), который сам по себе блокирует перенос электронов, усугубляя условия окислительного стресса, а также делает клетку более чувствительной к нему [4]. Метаболизм фолиевой кислоты регулируется последовательным каскадом реакций фолатного цикла. Коферментом в заключительной реакции этого цикла, в результате которой фолиевая кислота переходит в активную форму (тетрагидрофолат), выступает витамин В12 (цианокобаламин). При его недостатке работа фолатного цикла нарушается, а фолиевая кислота в неактивной форме не воспринимается организмом.
Данные наследственного анамнеза не всегда указывают на наследственный генез оптической нейропатии. Так, при первичном осмотре только 18% пациентов из нашей выборки указывали на наличие ЧАЗН у родственников.
У части пациентов постановка правильного диагноза бывает отсрочена из-за особенностей фенотипического проявления генетического дефекта у индивида и его родственников (неполная пенетрантность, вариабельная экспрессия), а также разнообразия клинических проявлений НОН, маскирующих основную причину снижения зрения (например, у пациентов с НОНЛ могут быть обнаружены очаги демиелинизации в головном мозге) [5].
Таким образом, хотя проблемы в клинической диагностике НОН есть, с помощью полученных клинических данных начала, течения заболевания с учетом опыта практикующего офтальмолога в большинстве случаев клинически можно установить диагноз НОН. Своевременная детекция мутации ДНК позволяет верифицировать заболевание и незамедлительно рекомендовать энерготропную терапию и изменение образа жизни для пациента и его родственников.
Поэтому второй этап диагностики — это молекулярно-генетический анализ. Для молекулярно-генетического подтверждения НОН с учетом наследования проводят поиск мутаций в мтДНК и яДНК. В подавляющем большинстве случаев (90—95%) причиной НОНЛ является одна из трех мутаций: m.11778G>A в гене ND6 MT-ND4, m.3460G>A в гене MT-ND1 и m.14484T>С в гене MT-ND6. Существует еще 16 более редких мутаций, которые признаны первичными для НОНЛ (согласно Международной базе мутаций митохондриальной ДНК Mitomap. https://www.mitomap.org/bin/view.pl/MITOMAP/MutationsLHON).
Практически каждый год открывают новые мутации мтДНК, которые получают статус кандидатных. Признание кандидатных мутаций первичными происходит только после того, как они будут обнаружены в двух и более независимых семьях с проявлениями НОНЛ, а также после проведения биохимических исследований на клеточных культурах пациентов для поиска дефекта дыхательной цепи митохондрий.
В нашем исследовании на 2014 г. три частые первичные мутации мтДНК были обнаружены в 94% случаев, 34 из 36 пациентов с выявленными мутациями мтДНК на указанную дату; на 2021 г. — 80,7% случаев (67 из 83 пациентов). Уменьшение частоты встречаемости трех первичных мутаций отмечено за счет увеличения количества пациентов с редкими (10 человек, m.3472Т>С, m.3635G>A, m.4171C>A) и кандидатными (6 человек, m.13379A>G, m.13513G>A, m.14597A>G) мутациями. Несомненно, это связано и с техническими возможностями автоматического секвенирования мтДНК и новыми знаниями.
АДОН связывают с мутациями генов OPA1, OPA3. В выборке из 114 пациентов с генетически верифицированной НОН мутации гена OPA1 были идентифицированы в 6,1% случаев.
Тем не менее у части пациентов с клиническим диагнозом НОН мутации долгое время не были верифицированы. В 2018 г. идентифицирован ген яДНК DNAJC30, мутации которого ассоциированы с типичной клинической картиной НОНЛ, но с аутосомно-рецессивным наследованием. Таким образом, и мать и отец имеют по одной мутации, которые могут передать 25% своих детей. У 24 пациентов из нашей выборки была выявлена гомозиготная мутация c.152A>G (p.Tyr51Cys) в гене DNAJC30 [6]. Следует отметить, что эти пациенты не из близкородственных браков.
На рис. 1 представлена родословная пациента Б., у которого в возрасте 38 лет развилась НОН с типичной клинической картиной НОНЛ. Однако мутаций мтДНК у него не было обнаружено, выявлена мутация c.152A>G (p.Tyr51Cys) в гене DNAJC30. Исследование членов семьи, в которой 10 сестер и братьев пациента, выявило носительство мутаций у трех сестер без клинических проявлений на данный момент.
Рис. 1. Родословная пациента Б. с АРОН.
Таким образом, в выборке из 114 пациентов с НОН три частые мутации мтДНК составили 59%, редкие и кандидатные мутации мтДНК выявлены в 14% случаев, мутации яДНК, ассоциированные с АДОН, — в 6,1% случаев, мутации в гене DNAJC30 яДНК, явившиеся причиной АРОН, — в 21% случаев. Среди пациентов с клинической картиной НОНЛ мутации мтДНК выявлены в 77,6% случаев, мутации гена DNAJC30 яДНК — в 22,4% случаев, т.е. практически четверть всех случаев с клинической картиной НОНЛ приходится на аутосомно-рецессивную оптическую нейропатию, ассоциированную с геном DNAJC30.
У 4 пациентов с клиническим диагнозом НОН нуклеотидную замену мтДНК и яДНК обнаружить не удалось, однако проведенные цитологические исследования в дальнейшем подтвердили митохондриальную дисфункцию и митохондриальную природу оптической нейропатии. Отсутствие положительного результата по итогам генетического обследования не исключает наследственную этиологию заболевания зрительного нерва.
Для того чтобы убедиться в патогенности впервые описанной или кандидатной мутации, одного биоинформатического анализа недостаточно, важно обнаружение митохондриальной дисфункции [7]. Для этой цели исследуют клетки крови, фибробласты, гибридные клетки на предмет снижения работы комплексов дыхательной цепи митохондрий (ДЦМ) (в первую очередь I комплекса), митохондриального потенциала, повышения количества активных форм кислорода (АФК) [8]. Пациентам с клиническим диагнозом НОН и отсутствием выявленной мутации также можно проводить цитологические исследования для подтверждения митохондриальной дисфункции.
Основная функция митохондрий — это клеточное аэробное дыхание, оно осуществляется на четырех дыхательных комплексах внутренней мембраны митохондрии и АТФ-синтазе.
Белки дыхательных комплексов кодируются мтДНК и яДНК. Поэтому мутации, возникающие в обоих геномах, могут приводить к нарушению структуры и снижению активности комплексов ДЦМ, в первую очередь I комплекса, снижению мембранного потенциала, росту продукции АФК, снижению выработки клеточной энергии — АТФ, т.е. к различным по тяжести митохондриальным дисфункциям.
Таким образом, с помощью цитологических исследований возможно подтвердить биохимический дефект окислительного фосфорилирования (ОФ) в митохондриях, в частности на фибробластах кожи пациентов.
Высокоразрешающая респирометрия является методом, позволяющим функционально в условиях, максимально приближенных к in vivo, на клетках или тканях оценить работу ДЦМ в целом либо оценить функционирование отдельного комплекса [9, 10]. Данный метод основан на использовании сверхчувствительного кислородного электрода, который измеряет скорость потребления кислорода клетками или тканями в режиме реального времени. Чем интенсивнее идет выработка энергии, тем больше потребление кислорода. Для проведения цитологических исследований осуществляют биопсию небольшого участка кожи пациентов.
Материалом для клеточных исследований в нашем исследовании служили фибробласты кожи и тромбоциты пациентов с НОН с первичными мутациями, а также с новыми кандидатными мутациями для доказательства их патогенности.
На рис. 2 показана скорость потребления кислорода интактных (целостность цитоплазматической мембраны не нарушена) фибробластов пациента и нормального контроля, регистрировали базовое дыхание на эндогенных субстратах, дыхание после добавления ингибитора V комплекса ДЦМ олигомицина, максимальную скорость дыхания при добавлении разобщителя ОФ карбонилцианид-n-трифторметоксифенилгидразона (FCCP). В интактных фибробластах кожи пациентов с НОНЛ выявили достоверное отклонение от контроля показателей клеточного дыхания, что говорит о снижении мощности дыхательной цепи митохондрий и мембранного потенциала.
Рис. 2. Скорость потребления кислорода интактными фибробластами пациента и контрольной культуры при добавлении 5 мМ пирувата и 0,5 мМ малата (мал/пир); 2,5 мкМ олигомицина (олиго); титрование по 0,05 мкМ FCCP (F); 0,5 мкМ ротенона.
Высокоразрешающую респирометрию проводили на пермеабилизированных фибробластах (с мембраной, ставшей проницаемой после добавления в культуру дигитонина), дополнительно изучали скорость потребления кислорода после добавления субстрата I комплекса ДЦМ глютамата — CI и после добавления субстрата II комплекса сукцината — CII, дыхание после ингибирования I комплекса ротеноном (Rot). В пермеабилизированных фибробластах пациентов наблюдали изменение представленных на рис. 3 показателей, что говорит о снижении уровня окислительного фосфорилирования в основном за счет дисфункции I комплекса дыхательной цепи митохондрий и об относительном компенсаторном повышении активности II комплекса.
Рис. 3. Данные респирометрии пермеабилизированных фибробластов пациента в сравнении с контрольными фибробластами при добавлении 5 мМ пирувата и 0,5 мМ малата (пир/мал); 0,5 мкг/мл дигитонина (дигит); 1 мМ ADP (АДФ); 10 мМ глутамата (глут); 10 мМ сукцината (сукц); титрование по 0,05 мкМ FCCP (F); 0,5 мкМ ротенона; 2,5 мкМ антимицина А (ант).
Проведенные клеточные исследования подтвердили митохондриальную дисфункцию в клетках пациентов не только с патогенными мутациями, но и с новыми заменами.
Таким образом:
1. Выявленные клинические симптомы, характерные для НОН, а также первичное поражение ГКС в острой стадии заболевания позволяют клинически диагностировать НОН.
2. Алгоритм генетической верификации НОН с учетом наследования включает исследование на наличие 19 первичных мутаций мтДНК, а в случае отрицательного результата — секвенирование всей мтДНК, а также исследование генов яДНК, ассоциированных с аутосомно-доминантной и аутосомно-рецессивной НОН. Подобный алгоритм позволил генетически верифицировать диагноз в 96% случаев.
3. Комплекс цитологических исследований позволяет выявлять митохондриальный патогенез заболевания и незаменим при подтверждении патогенности новых или кандидатных мутаций.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.