Известно, что в основе развития хронического отека роговицы лежит повышение проницаемости эндотелиального слоя для внутриглазной жидкости передней камеры глаза, возникающее из-за необратимой гибели эндотелиальных клеток (ЭК) с разрушением межклеточных контактов и снижением плотности ионных каналов [1—3]. Так, к причинам ускорения апоптоза ЭК относят их механическое повреждение при интраокулярных хирургических вмешательствах [4], инфекционные заболевания структур переднего отрезка глаза [5], отсутствие компенсации внутриглазного давления (ВГД) в течение длительного времени [6, 7], а также цитотоксическое действие вспомогательных компонентов (в том числе бензалкония хлорида) антиглаукомных лекарственных препаратов [8, 9]. Прогрессирование дисфункции эндотелиального слоя сопровождается увеличением степени стромального отека с формированием лакун, а также разрушением базальной мембраны эпителия, появлением микрокист и развитием буллезной кератопатии (БК).

К причинам развития хронического отека роговицы также относят генетически детерминированные патологические изменения эндотелия и десцеметовой мембраны (ДМ). Среди них чаще всего встречается эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса (ЭД Фукса) раннего (30—40 лет) и позднего (старше 40 лет) начала [10]. Данное состояние характеризуется постепенной трансформацией ЭК в фибробласты, вероятно, обусловленной механизмом эпителиально-мезенхимального перехода [11]. В результате клетки с измененным фенотипом приобретают способность синтезировать коллагеновые структуры — гутты, которые постепенно сливаются с ДМ, приводя к ее утолщению за счет формирования дополнительных задних слоев [12]. В то же время происходит разрушение плотных и щелевидных межклеточных контактов с прекращением функционирования ионных каналов и белков-переносчиков и необратимым уменьшением плотности ЭК. ЭД Фукса в фазе декомпенсации, как и БК, проявляется выраженным отеком стромы и буллезными изменениями эпителия роговицы, приводящими к снижению остроты зрения и появлению болевого синдрома [13].

Радикальным патогенетически ориентированным способом лечения псевдофакичной БК и ЭД Фукса является кератопластика, включающая замену измененного эндотелиального слоя. В настоящее время операцией выбора считают изолированную трансплантацию ДМ с эндотелием (Descemet membrane endothelial keratoplasty, DMEK) или автоматизированную эндотелиальную кератопластику (Descemet stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) [14—16]. К основным осложнениям задней послойной кератопластики относят формирование локальных и протяженных ложных камер между трансплантатом и роговицей реципиента.

Причинами нарушения адаптации донорского лоскута считают относительную гипотензию, возникающую на фоне быстрого исчезновения пузыря газовоздушной смеси из передней камеры [17], а также из-за наличия остаточных фрагментов ДМ на задней поверхности стромы реципиента [18, 19].

С учетом представленных особенностей патогенеза псевдофакичной БК и ЭД Фукса, а также возможных осложнений эндотелиальной кератопластики актуальным является подробное изучение морфологических изменений задних слоев роговицы при этих заболеваниях.

Цель работы — исследование морфологических особенностей задних слоев роговицы при псевдофакичной БК и ЭД Фукса.

Материал и методы

В исследование были включены 44 пациента (45 глаз): 1-ю группу составили 20 пациентов (20 глаз) с псевдофакичной БК (12 мужчин и 8 женщин; средний возраст — 73,8±7,8 года); 2-я группа была представлена 24 пациентами (25 глаз) с диагнозом ЭД Фукса (8 мужчин и 16 женщин; средний возраст — 72,5±10,6 года; табл. 1).

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Критериями исключения пациентов из исследования были острые воспалительные заболевания глаз, отсутствие компенсации ВГД, наличие гемофтальма, а также аутоиммунных и неопластических заболеваний любой локализации.

До операции всем больным, включенным в исследование, выполняли стандартное офтальмологическое обследование, а также пахиметрию центральной зоны роговицы (RTvue-100, Optovue, США). Пациентам обеих групп была выполнена эндотелиальная кератопластика (DSAEK или DMEK; см. табл. 1).

В послеоперационном периоде оценивали адаптацию эндотелиального трансплантата по данным оптической когерентной томографии переднего отрезка глаза (ОКТ ПОГ; RTvue-100, Optovue, США).

У пациентов обеих групп при проведении операции были получены образцы ДМ с эндотелием. Для морфологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей (Pool Scientific Instruments, Швейцария) и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала, как правило, не превышало 48 ч. Затем готовили серийные парафиновые срезы (не менее 12 серийных срезов), которые фиксировали на предметные стекла, покрытые полилизином (Mainzel Glaser, Polylisine, Германия) и инкубировали в термостате при 37 °C в течение 12 ч. Потом срезы депарафинировали и обезвоживали в батарее из трех ксилолов, двух абсолютных спиртов, двух 95% спиртов, 80% и 70% спиртов и дистиллированной воды. По одному препарату от каждого случая окрашивали гематоксилином и эозином. Для изучения состояния ДМ применяли инвертированный микроскоп Leica DM-2500 с фотокамерой Leica DFC 295. Как и в работе T. Brockmann и соавт. [18], оценку структуры ДМ проводили с учетом особенностей ее окрашивания гематоксилином и эозином. Зона ДМ, определяемая как передний «полосатый» слой, отличалась менее интенсивным окрашиванием, что позволило выявить границу между ней и областью, соответствующей заднему «неполосатому» слою, и провести морфометрический анализ с использованием программы ImageScope M.

Статистический анализ данных выполняли с использованием программы SPSS 23 (IBM). При применении теста Колмогорова—Смирнова был выявлен ненормальный тип распределения переменных, в связи с чем использовались методы непараметрической статистики. Для оценки значимости различий между двумя независимыми выборками применяли U-критерий Манна—Уитни. Полученные данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Статистически значимыми различия считали при p<0,05.

Результаты и обсуждение

При морфологическом исследовании парафиновых срезов ДМ пациентов 1-й группы во всех случаях она была представлена передним «полосатым» и задним «неполосатым» слоями (рис. 1). Ее стромальную (переднюю) поверхность формирует тонкая зона плотного экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), которая, по данным некоторых авторов, содержит большое число белковых молекул (фибронектина, витронектина, фибулина и т.п.), обладающих способностью к адгезии коллагеновых стромальных волокон [20, 21]. По данным проведенного нами морфометрического анализа, толщина пренатального переднего «полосатого» слоя составляет 2,58±0,49 мкм, в то время как постнатальный задний «неполосатый» слой имеет толщину 11,30±2,64 мкм (табл. 2). Интересно, что во всех препаратах отсутствуют ЭК на задней поверхности ДМ, что, вероятно, обусловлено истончением эндотелия и его слабой адгезией к «неполосатому» слою при БК, а также механическим повреждением на этапе десцеметорексиса в ходе DMEK или DSAEK (см. рис. 1).

Рис. 1. Морфологическое строение ДМ при псевдофакичной БК.

Парафиновый срез, окраска гематоксилином и эозином, ув. 100.

Зона плотного экстрацеллюлярного матрикса (1); пренатальный передний «полосатый» слой (2); постнатальный задний «неполосатый» слой (3); передняя (стромальная) поверхность ДМ отмечена черными стрелками, задняя (эндотелиальная) поверхность ДМ — красными стрелками.

Таблица 2. Морфометрический анализ ДМ при псевдофакичной БК и ЭД Фукса, M±m

Как известно, ДМ состоит из коллагеновых волокон и протеогликанов — компонентов ЭЦМ, синтезируемых ЭК роговицы на протяжении всей жизни человека, начиная со 2-го месяца гестации [22]. По данным электронной микроскопии, на 12-й неделе пренатального периода она представляет собой типичную базальную мембрану, состоящую из прилежащей к эндотелиальному слою «светлой» и расположенной над ней «темной» пластинок. Постепенный рост ДМ сопровождается синтезом взаимно перпендикулярных волокон коллагена IV и VII типов, формирующих отдельные слои. В результате к завершению пренатального этапа ДМ имеет нетипичную для базальной мембраны ламеллярную структуру, а ее толщина составляет 3 мкм. Постнатальный период роста десцеметовой оболочки связан с постоянной секрецией ЭК протеогликанов, формирующих задний «неполосатый» слой, размер которого достигает 10—12 мкм [23].

Результаты, полученные нами при морфометрическом анализе ДМ пациентов с псевдофакичной БК, соответствуют данным, полученным ранее при электронной микроскопии роговиц без офтальмопатологии [24]; это свидетельствует о том, что патологический процесс затрагивает ЭК, строму и эпителиальный слой роговицы, практически не приводя к структурным изменениям ДМ.

Сравнительный морфометрический анализ ДМ пациентов 1-й (псевдофакичная БК) и 2-й (ЭД Фукса) групп показал статистически значимое увеличение толщины ДМ у всех больных, включенных во 2-ю группу (см. табл. 2). По данным морфологического исследования, при ЭД Фукса ДМ также представлена тонким слоем плотного ЭЦМ и фиксированной к нему пренатальной передней «полосатой» зоной (рис. 2, а). В связи с тем что при световой микроскопии невозможно на всем протяжении оценить истинную границу между задним «неполосатым» слоем и нетипичной коллагеновой зоной, нами был проведен морфометрический анализ пренатального переднего «полосатого» слоя и совокупности синтезированных в постнатальном периоде заднего «неполосатого» и коллагенового слоев, а также гутт.

Рис. 2. Морфологическое строение ДМ при ЭД Фукса.

Парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

а — зона плотного экстрацеллюлярного матрикса (1), пренатальный передний «полосатый» слой (2), постнатальные слои (3); гутты отмечены белой звездочкой, эндотелиальные клетки — синими стрелками, передняя (стромальная) поверхность ДМ — черными стрелками, задняя (эндотелиальная) поверхность ДМ — красными стрелками; б — передняя (стромальная) поверхность ДМ отмечена черными стрелками, гутты — белой звездочкой, постнатальные слои — черной звездочкой.

В 22 глазах (21 пациент) при световой микроскопии отмечено достоверное утолщение постнатального заднего «полосатого» слоя (16,62±4,34 мкм) за счет синтеза измененными ЭК гутт различной формы и размера (см. табл. 2). При этом на задней поверхности ДМ определяются отдельные ЭК (см. рис. 2, а). В то же время в трех глазах (три пациента) визуализируется дополнительный задний коллагеновый слой с погруженными в него гутами (см. рис. 2, б).

Впервые анализ структурных особенностей роговицы при ЭД Фукса был проведен J. Kayes и соавторы в 1964 г. [25]. По данным электронной микроскопии ими было установлено появление гутт и утолщение ДМ за счет синтеза ЭК заднего коллагенового слоя. В дальнейшем W. Bourne и соавт. [26] определили, что в среднем толщина этой зоны составляет 16,6 мкм, а по своей структуре она напоминает передний «полосатый» слой. Кроме того, по мнению этих авторов, активный синтез коллагена и ЭЦМ ЭК замедляет формирование заднего «неполосатого» слоя, размер которого достигает только 3,6 мкм. При этом передний «полосатый» слой остается интактным.

Выявленное нами достоверное утолщение ДМ за счет формирования дополнительных слоев согласуется с приведенными W. Bourne и соавт. [26] данными электронной микроскопии, что подтверждает вовлечение десцеметовой оболочки в патологический процесс при ЭД Фукса.

По результатам морфологического исследования образцов ДМ пациентов обеих групп была обнаружена зона плотного ЭЦМ. Известно, что ее основной функцией является адгезия подлежащего переднего «полосатого» слоя ДМ к задней поверхности стромы [21]. В связи с этим был проведен анализ состояния стромальной поверхности ДМ во всех биоптатах, полученных при задней послойной кератопластике. Так, в 40 образцах ДМ (16 и 24 случая из 1-й и 2-й групп соответственно) отмечается неизмененная, гладкая зона плотного ЭЦМ (рис. 3, а). По данным ОКТ ПОГ, выполненной после рассасывания пузыря воздушной (DSAEK) и газовоздушной (DMEK) смеси в передней камере, у этих больных отмечено полное прилегание эндотелиального кератотрансплантата вне зависимости от вида задней послойной кератопластики (рис. 3, б).

В то же время при ОКТ ПОГ у четырех пациентов с псевдофакичной БК и одного больного с ЭД Фукса после операции DMEK определяются локальные ложные камеры, вероятно, обусловленные нарушением регулярности задней поверхности стромы реципиента за счет разрозненных волокон, проминирующих в переднюю камеру (рис. 3, г). При морфологическом исследовании в биоптатах, полученных у этих пациентов во время кератопластики, визуализируются фиксированные к передней поверхности ДМ стромальные волокна (рис. 3, в). Вероятно, данные морфологические изменения связаны с индивидуальными структурными особенностями зоны плотного ЭЦМ.

Рис. 3. Варианты адаптации эндотелиального трансплантата в зависимости от повреждения задних слоев стромы роговицы реципиента.

а, в — парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином, а — ув. 200, в — ув. 400; б, г — оптические когерентные томограммы переднего отрезка глаза.

а — гладкая передняя (стромальная) поверхность ДМ отмечена черными стрелками; б — эндотелиальный трансплантат (полное прилегание) указан белыми стрелками; в — ДМ отмечена белой звездочкой, стромальные волокна — черными звездочками (неполное прилегание); в — эндотелиальный трансплантат (неполное прилегание) указан белыми стрелками, стромальные волокна отмечены желтой стрелкой.

Заключение

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что хронический отек роговицы обусловлен различными патоморфологическими изменениями ее задних слоев при псевдофакичной БК и ЭД Фукса. Эндотелиальная дисфункция, приводящая к развитию псевдофакичной БК, не сопровождается изменением показателей толщины передней «полосатой» и задней «неполосатой» зон ДМ. Между тем при ЭД Фукса отмечается достоверное увеличение размеров ДМ за счет синтеза ЭК заднего коллагенового слоя и гутт в постнатальном периоде.

Индивидуальные особенности зоны плотного ЭЦМ ДМ могут иметь значение для адаптации эндотелиального трансплантата при DMEK, что влияет на исход оперативного вмешательства при псевдофакичной БК и ЭД Фукса.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.Т., Т.Д., Н.Ф.

Сбор и обработка материала: С.Т., Н.Ф., Т.Д.

Статистическая обработка: Н.Ф.

Написание текста: Н.Ф.

Редактирование: С.Т., Т.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.