Опухоли век являются наиболее распространенными новообразованиями в повседневной офтальмологической практике и охватывают широкий спектр доброкачественных и злокачественных новообразований. Примерно 5—10% всех видов рака кожи и 15% всех опухолей лица образуются на веках [1]. При больших размерах опухоли век могут вызывать выраженные деформации, вывороты век с развитием несмыкания глазной щели — лагофтальма, что негативно отражается на зрительных функциях, а также создает косметический дефект. При злокачественных опухолях век в случае отсутствия своевременной терапии возможен летальный исход.
Несмотря на доступность диагностики опухолей кожи век, частота, обращения в запущенных стадиях болезни достигает 12—15%. По гистогенезу среди злокачественных опухолей век превалирует базальноклеточный рак (94,7%), реже встречаются плоскоклеточный и метатипический рак (4%), аденокарцинома мейбомиевой железы (0,7%), меланома кожи (0,6%) [2]. Среди других опухолей век встречаются лимфома, а также злокачественные мезенхимальные опухоли (фибросаркома и ангиосаркома).
В лечении злокачественных опухолей век используют хирургический способ, криодеструкцию, лазеротерапию, лучевую терапию. Однако частота рецидивов остается высокой [3, 4]. Применимость этих методов локальной терапии ограничивается небольшими размерами опухоли; в случае распространенных опухолей век после хирургического лечения и гамма-терапии требуется пластика для замещения дефектов.
Химиотерапия не занимает видного места в лечении опухолей век, ее использование ограничивается чувствительными опухолями [3, 5].
В ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России было получено противоопухолевое соединение 2-[3-(2-хлорэтил)-2-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол (хлонизол), отличающееся высокой терапевтической активностью на широком спектре экспериментальных опухолей у мышей и крыс [6]. Широкий спектр противоопухолевой активности хлонизола позволяет считать целесообразным изучение его терапевтического эффекта также и при опухолях век различного гистогенеза.
Цель исследования — изучить влияние отечественного противоопухолевого соединения хлонизол на рост перевиваемых опухолей различного гистогенеза, трансплантированных в нижнее веко мышей.
Материал и методы
Исследование проводилось на мышах линии 129/SN, BALB/c и C57BL/6, самцах и самках, с перевитыми под кожу нижнего века карциномой Эрлиха, саркомой 37, лимфосаркомой ЛИО-1 и меланомой В16. Опухоль перевивали посредством инъекции 0,05 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида (NaCl), содержащего 106 клеток карциномы Эрлиха, саркомы 37, лимфосаркомы ЛИО-1 или 10% взвеси опухолевой ткани меланомы B16. Инъекция производилась в нижнее правое веко в направлении от наружного к внутреннему углу глаза тонкой иглой (29G). После трансплантации опухоли мышей рандомизировали на две группы: мыши 1-й группы служили контролем, мышам 2-й группы вводили хлонизол внутрибрюшинно (в/б) в максимально переносимой дозе (20 мг/кг) или в меньшей дозе (15 мг/кг). Субстанцию хлонизола растворяли в стерильном 0,9% растворе NaCl до концентрации 2 мг/мл (опыты 1—3) и 1,5 мг/мл (опыт 4).
Животные содержались в конвенциональном виварии в полипропиленовых клетках при температуре воздуха 20—24°C и относительной влажности 50—60% с 12-часовым циклом светлого/темного времени суток. Мыши получали полнорационный брикетированный комбикорм производства компании «Лабораторкорм» (Москва, Россия) и водопроводную питьевую воду без ограничений. Уход и все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), и директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС о защите животных, используемых для научных целей. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России.
Критериями оценки терапевтического эффекта были торможение роста опухоли и увеличение общей выживаемости (ОВ) животных.
Торможение роста опухоли (Т%) оценивали по формуле:
,
где T% — процент торможения роста опухоли; Vk — средний объем опухоли у мышей контрольной группы; Vэ — средний объем опухоли у мышей экспериментальной группы, получавших хлонизол.
Объем опухоли V определяли по формуле:
,
где A — наибольший диаметр опухоли; B — перпендикулярный ему диаметр.
ОВ определялась как время со дня перевивки опухоли до дня гибели животного. Животные, прожившие без опухоли более 90 дней, считались излеченными.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистического пакета GraphPad Prism v. 8.0. Для сравнения относительных показателей использовали точный критерий Фишера. Данные об ОВ животных графически представлены в виде кривых Каплана—Мейера. Для сравнения кривых ОВ применяли логранговый критерий. Все критерии были двусторонними. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Отношение риска (hazard ratio — HR) и границы его 95% доверительного интервала (ДИ) рассчитывали с помощью регрессионной модели Кокса.
Результаты
Опыт 1. Влияние хлонизола на рост мышиной карциномы Эрлиха, трансплантированной в нижнее веко.
Исследование проведено на 16 мышах-самцах линии 129/SN. После трансплантации опухоли мыши были рандомизированы на две группы: 1-я группа (контроль) — 0,9% раствор NaCl в/б в объеме 10 мл/кг (n=8); 2-я группа — хлонизол 20 мг/кг в/б через 24 ч после перевивки опухоли (n=8).
К 10-му дню после перевивки у всех восьми мышей контрольной группы развились четко определяемые опухоли в области правого нижнего века; ни у кого из восьми мышей, получивших хлонизол, опухолей не было. На 15-й день при наличии опухолей у всех восьми мышей контрольной группы ни у одной из мышей в группе хлонизола опухоли еще не развились (рис. 1). Лишь на 20-й день в этой группе опухоль появилась у одной мыши, на 40-й день опухоли имелись у шести мышей. У двух из восьми мышей, получивших хлонизол, опухоли отсутствовали в период наблюдения свыше 90 дней.
Рис. 1. Влияние хлонизола на рост карциномы Эрлиха, перевитой в нижнее веко.
Измерение объемов опухолей, производившееся с 10-го по 20-й день после перевивки, свидетельствует о значительном противоопухолевом эффекте хлонизола (рис. 2). Торможение роста опухоли под влиянием хлонизола достигало 100%.
Рис. 2. Влияние хлонизола на кинетику роста карциномы Эрлиха, трансплантированной в нижнее веко.
Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего (SEM).
Введение хлонизола обусловило значимое увеличение продолжительности жизни животных по сравнению с контролем (рис. 3). Медиана ОВ в группах контроля и хлонизола у мышей с перевитой под кожу нижнего века карциномой Эрлиха составила 18,5 дня и 33,5 дня соответственно. Различия ОВ статистически значимы (логранговый тест, p=0,0464). В группе хлонизола наблюдался тренд к снижению риска смерти животных (HR=0,41; 95% ДИ 0,12—1,13).
Рис. 3. Влияние хлонизола на ОВ мышей с трансплантированной в нижнее веко карциномой Эрлиха.
Указана медиана ОВ. Различие ОВ статистически значимо (логранговый тест, p=0,0464).
Все мыши контрольной группы погибли от опухоли к 40-му дню после перевивки. Из восьми животных, получивших хлонизол, от опухоли погибли шесть мышей, а две мыши прожили без опухоли свыше 90 дней (точный критерий Фишера, p=0,4667).
Опыт 2. Влияние хлонизола на рост мышиной саркомы 37, трансплантированной в нижнее веко.
Исследование проведено на 19 мышах-самках линии BALB/c. После трансплантации опухоли мыши были рандомизированы на две группы: 1-я группа (контроль) — 0,9% раствор NaCl в/б в объеме 10 мл/кг (n=10); 2-я группа — хлонизол 20 мг/кг в/б через 24 ч после перевивки опухоли (n=9).
За мышами вели ежедневное наблюдение. На 10-й день после перевивки у всех 10 мышей контрольной группы развились опухоли нижнего века; ни у одной из девяти мышей, получивших хлонизол, опухолей еще не было. К 15-му дню опыта опухоли имелись у всех 10 мышей в контроле и отсутствовали у всех девяти мышей, которым через 24 ч после перевивки был введен хлонизол 20 мг/кг в/б (рис. 4).
Рис. 4. Влияние хлонизола на рост саркомы 37, трансплантированной в нижнее веко.
В группе мышей, получивших хлонизол, опухоли полностью отсутствовали до 35-го дня после перевивки, когда опухоль была обнаружена у одной мыши из девяти (рис. 5). Торможение роста опухоли под влиянием хлонизола в различные сроки после перевивки составляло 92—100%.
Рис. 5. Влияние хлонизола на кинетику роста саркомы 37, трансплантированной в нижнее веко.
Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего (SEM).
Медиана ОВ в группе контроля у мышей с перевитой под кожу нижнего века саркомой 37 равнялась 35,5 дня, а в группе хлонизола она не была достигнута при 90-дневном периоде наблюдения. Различия ОВ статистически значимы (логранговый тест, p<0,0001) (рис. 6). В группе хлонизола риск смерти животных значимо (на 91%) ниже в сравнении с контрольной группой (HR=0,09; 95% ДИ 0,03—0,30).
Рис. 6. Влияние хлонизола на ОВ мышей с трансплантированной в нижнее веко саркомой 37.
Указана медиана ОВ. Различие ОВ статистически значимо (логранговый тест, p<0,0001).
Все 10 контрольных мышей погибли от опухоли к 48-му дню после перевивки. Из девяти животных, получивших хлонизол, опухоль развилась только у двух мышей. Остальные семь (78%) мышей прожили без опухоли свыше 90 дней (точный критерий Фишера, p=0,0007).
Опыт 3. Влияние хлонизола на рост лимфосаркомы ЛИО-1, трансплантированной в нижнее веко.
Исследование проведено на 16 мышах-самках линии BALB/с. После трансплантации опухоли мыши были рандомизированы на две группы: 1-я группа (контроль) — 0,9% раствор NaCl в/б объеме 10 мл/кг (n=10); 2-я группа — хлонизол 20 мг/кг в/б через 24 ч после перевивки опухоли (n=6)
За всеми мышами вели ежедневное наблюдение. На 10-й день после перевивки у всех 10 мышей контрольной группы развились опухоли нижнего века; ни у кого из шести мышей, получивших хлонизол, опухолей не было. К 15-му дню опыта опухоли имелись у всех 10 мышей контрольной группы и отсутствовали у всех шести мышей, которым через 24 ч после перевивки был введен хлонизол 20 мг/кг в/б (рис. 7). Ни у одной из шести мышей, получивших хлонизол, опухолей не было до 20-го дня. На 20-й день в этой группе опухоль развилась у одной мыши из шести, и только на 30-й день наблюдения опухоль была обнаружена еще у одной мыши. Торможение роста опухоли под влиянием хлонизола в различные сроки после перевивки составляло 84—100%. Влияние хлонизола на рост лимфосаркомы ЛИО-1 показано на рис. 8.
Рис. 7. Влияние хлонизола на рост лимфосаркомы ЛИО-1, трансплантированной в нижнее веко.
Рис. 8. Влияние хлонизола на кинетику роста лимфосаркомы ЛИО-1 у мышей линии BALB/c.
Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего (SEM).
Медиана ОВ в контрольной группе у мышей с перевитой под кожу нижнего века лимфосаркомой ЛИО-1 составила 36 дней, а в группе хлонизола она не была достигнута при 90-дневном периоде наблюдения. Различия ОВ статистически значимы (логранговый тест, p=0,0122) (рис. 9). В группе хлонизола риск смерти животных значимо (на 80%) ниже в сравнении с контрольной группой (HR=0,20; 95% ДИ 0,07—0,63).
Рис. 9. Влияние хлонизола на ОВ мышей с трансплантированной в нижнее веко лимфосаркомой ЛИО-1.
Указана медиана ОВ. Различие ОВ статистически значимо (логранговый тест, p=0,0122).
В группе хлонизола число животных, проживших более 90 дней, составило 4 (67%), различия с контрольной группой статистически значимы (точный критерий Фишера, p=0,0082).
Опыт 4. Влияние хлонизола на рост меланомы В16, трасплантированной в нижнее веко.
Исследование проведено на 18 мышах-самках линии С57BL/6. Всем мышам под кожу правого нижнего века была трансплантирована меланома В16. После трансплантации опухоли мыши были рандомизированы на две группы: 1-я группа (контроль) — 0,9% раствор NaCl в/б в объеме 10 мл/кг (n=10); 2-я группа — хлонизол 15 мг/кг в/б через 24 ч после перевивки опухоли (n=8).
На 7-й день после перевивки у всех мышей контрольной группы имелись четко определяемые визуально опухоли нижнего века; ни у кого из восьми мышей в группе хлонизола опухолей не было. К 15-му дню опыта опухоли имелись у всех 10 мышей в контроле и отсутствовали у всех восьми мышей, которым через 24 ч после перевивки был веден хлонизол в дозе 15 мг/кг в/б (рис. 10). Всего в группе хлонизола опухоли век развились у шести из восьми мышей. Торможение роста опухоли составляло в разные сроки 92—100%. Кинетика роста опухолей представлена на рис. 11.
Рис. 10. Влияние хлонизола на рост меланомы В16, трансплантированной в нижнее веко.
Рис. 11. Влияние хлонизола на кинетику роста меланомы В16, трансплантированной в нижнее веко.
Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего (SEM).
Медиана ОВ в контрольной группе у мышей с перевитой под кожу нижнего века меланомой B16 составила 21 день, а в группе хлонизола — 35,5 дня. Различия ОВ статистически значимы (логранговый тест, p<0,0001) (рис. 12). Применение хлонизола ассоциировано со статистически значимым (на 81%) снижением риска смерти животных в сравнении с контрольной группой (HR=0,19; 95% ДИ 0,06—0,59).
Рис. 12. Влияние хлонизола на ОВ мышей с трансплантированной в нижнее веко меланомой B16.
Указана медиана ОВ. Различие ОВ статистически значимо (логранговый тест, p<0,0001).
В группе хлонизола без опухоли более 90 дней прожили две (25%) мыши, что статистически незначимо в сравнении с контролем (точный критерий Фишера, p=0,1830).
Обсуждение
Отечественное противоопухолевое соединение 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол (хлонизол) принадлежит к особой группе производных нитрозоалкилмочевин — алкилнитрозоуреидопропандиолам. Соединение обладает выраженной терапевтической активностью в отношении самого широкого спектра экспериментальных опухолей и имеет высокую биодоступность [6]. Хлонизол является перспективным противоопухолевым агентом при новообразованиях разного гистогенеза и различных локализаций, в том числе и в онкоофтальмологии, в частности при опухолях век, возможности химиотерапии которых остаются ограниченными. В проведенных исследованиях однократное введение хлонизола в максимально переносимой дозе (20 мг/кг) или в меньшей дозе (15 мг/кг) оказывало выраженный терапевтический эффект у мышей с перевиваемыми опухолями, трансплантированными под кожу нижнего века. При опухолях различного гистогенеза введение хлонизола вызывало достигавшее 100% угнетение роста опухолей век и увеличение ОВ животных с карциномой Эрлиха (логранговый тест, p=0,0464), саркомой 37 (логранговый тест, p<0,0001), лимфосаркомой ЛИО-1 (логранговый тест, p<0,0122) и меланомой B16 (логранговый тест, p<0,0001).
Заключение
В серии проведенных экспериментов хлонизол продемонстрировал выраженную противоопухолевую активность в отношении перевиваемых в нижнее веко опухолей у мышей. Полученные доклинические результаты свидетельствуют о перспективах дальнейшего изучения хлонизола в офтальмоонкологии.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: А.С., Н.Х., А.К., Я.М., К.С., Л.Ф., Д.Л., Т.С.
Сбор и обработка материала: А.С., С.В., Ю.З., Е.Е.
Статистическая обработка: Я.М.
Написание текста: А.С., Н.Х., С.В., Я.М.
Редактирование: А.К., К.С., Г.Т., Т.С., Л.Ф., Д.Л.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.