Наследственные оптические нейропатии (НОН) входят в группу митохондриальных заболеваний, главной особенностью которых является нарушение работы электротранспортной цепи митохондрий, приводящее к снижению мембранного потенциала, росту продукции активных форм кислорода, снижению уровня аденозинтрифосфата (АТФ) — основного источника клеточной энергии [1]. Нарушение работы митохондрий приводит к разнообразным метаболическим сдвигам, возникающим вторично.
Хотя основной причиной НОН являются мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) при наследственной оптической нейропатии Лебера (НОНЛ) и мутации ядерной ДНК при аутосомно-рецессивной оптической нейропатии (АРОН), аутосомно-доминантной оптической нейропатии, однако в настоящее время пристальное внимание уделяется вторичным факторам, приводящим к развитию клинической симптоматики заболевания [2].
Ткань сетчатки обладает высокими метаболическими потребностями, поэтому она особенно чувствительна даже к минимальным изменениям местного гомеостаза. Важную роль в жизненном цикле клетки играет обмен фолиевой кислоты (витамина В9). Производные фолиевой кислоты — фолаты действуют как коферменты в реакциях с переносом одноуглеродных групп и играют исключительно важную роль в биосинтезе ДНК, РНК, гормонов, нейротрансмиттеров, мембранных липидов и белков [3]. Производные фолиевой кислоты также взаимодействуют с витамином В12, являясь донором метильной группы при превращении гомоцистеина в метионин [4]. Таким образом, недостаток коферментов фолиевой кислоты влияет на большое количество метаболических путей и может привести к нарушению биосинтеза важнейших соединений.
Предположительно, в развитии митохондриальной дисфункции при дефиците фолиевой кислоты задействованы несколько патогенетических механизмов. Во-первых, фолатная недостаточность вызывает нарушение митохондриального метаболизма из-за изменений фолатного цикла, влияя на работу электронтранспортной цепи митохондрий и, таким образом, снижая выработку АТФ [5, 6]. Во-вторых, недостаток фолиевой кислоты не только препятствует процессу переноса электронов, но и способствует повышению уровня токсичного формиата (соли муравьиной кислоты), который сам по себе блокирует перенос электронов на кислород, усугубляя условия окислительного стресса, а также делает клетку более чувствительной к нему. Формиат ингибирует цитохромоксидазу, тем самым блокируя окислительное фосфорилирование митохондрий [5, 7]. В-третьих, фолатная недостаточность приводит к накоплению гомоцистеина, который вызывает гибель нейронов сетчатки, воздействуя на ее внутренний и внешний слои, на ганглиозные клетки [4, 5]. В-четвертых, недостаток фолиевой кислоты ведет к снижению активности ряда фолат-зависимых ферментов и нарушению процессов выживания, созревания и миелинизации олигодендроцитов [8, 9].
Предполагается, что дефицит фолиевой кислоты может сам по себе обусловливать развитие симптомов алиментарной оптической нейропатии, а может выступать в качестве триггерного фактора при наличии мутаций, характерных для НОН [2, 10]. Таким образом, поиск метаболических нарушений, которые сопровождают НОН, является актуальной задачей.
Цель исследования — провести сравнительный анализ результатов определения содержания фолиевой кислоты, витамина В12 и гомоцистеина в сыворотке крови пациентов с НОНЛ и АРОН, оптическими нейропатиями другого генеза и группы контроля (ГК).
Материал и методы
Обследованы 58 пациентов с НОНЛ с мутациями мтДНК: m.1778G>А (n=20), m.3460 G>A (n=7), m.14484T>C (n=3), m.3635G>A (n=2), m.13513 G>A (n=3), m.4171C>A (n=1), m.3472Т>С (n=1), m.13379A>G (n=1), m.14597 A>G (n=1), m.14477A>G (n=1), а также пациенты с АРОН, ассоциированной с гомозиготной мутацией в ядерной ДНК [11, 12] с.152 A>G (n=18). Средний возраст пациентов составил 25,6±7,9 года. В ГК вошли 49 пациентов с оптической нейропатией (ОН) ишемического, воспалительного, травматического, компрессионного генеза (средний возраст 52,3±8,1 года). В группу сравнения (ГС) включены 20 здоровых добровольцев (средний возраст 26,1±7,1 года), не отличающихся по возрастному критерию от пациентов основной группы (p>0,05).
Для определения уровня фолиевой кислоты в сыворотке крови применяли микробиологический тест с использованием микропланшета, покрытого Lactobacillus rhamnosus. Рекомендованные референсные значения для фолиевой кислоты представлены в диапазоне 3,1—17,5 нг/мл. Уровень витамина В12 в сыворотке крови определяли с помощью хемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах (анализатор Architect i2000, Abbott, США; рекомендованные референсные значения 187—883 пг/мл). Уровень гомоцистеина в сыворотке крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией (рекомендованные референсные значения 5,46—16,20 мкмоль/л).
Статистическая обработка материала выполнена с помощью программы Statictica 6.0. Данные количественных переменных представлены в виде средних значений и стандартного отклонения от среднего значения (M±SD), минимального и максимального значений параметра. Статистический анализ результатов проводили с использованием дисперсионного анализа Краскела—Уоллиса.
Результаты
В сыворотке крови пациентов с НОН выявлено снижение уровня фолиевой кислоты до нижней границы или ниже референсных значений — в среднем уровень составил 4,0±1,6 (1,4—7,8) нг/мл. В ГК, в которую вошли пациенты с заболеванием зрительного нерва иного генеза, содержание фолиевой кислоты составило 8,2±3,8 (3,1—22,0) нг/мл, а в группе сравнения (ГС), состоящей из здоровых людей соответствующего пациентам с НОН возраста, — 17,1±5,4 (10,9/28,0) нг/мл (рис. 1). Получены значимые различия при сравнении уровней фолиевой кислоты в группах НОН и ГК (p=1,3·10–8), НОН и ГС (p=1·10–17), а также при сравнении ГК и ГС (p=0,003). Выявленная разница между пациентами с ОН иного генеза (ГК) и ГС получена в связи с включением в ГК пациентов широкой возрастной группы, в том числе с ишемической ОН, у которых метаболические нарушения, возникшие с возрастом, могли быть причиной развития сосудистых нарушений.
Рис. 1. Содержание фолиевой кислоты в сыворотке крови у пациентов с НОН (группа 1), пациентов ГК (группа 2) и лиц из ГС (группа 3).
Содержание фолиевой кислоты в плазме крови не различалось в группах пациентов с НОНЛ и АРОН (таблица). При сравнении групп с различными мутациями выявлена и продемонстрирована вышеописанная тенденция.
Содержание фолиевой кислоты, витамина В12 и гомоцистеина в сыворотке крови в группах пациентов с НОНЛ и АРОН, в ГК и ГС
| Группы | Число обследованных | Содержание фолиевой кислоты, нг/мл | Содержание витамина В12, пг/мл | Содержание гомоцистеина, мкмоль/л |
| НОНЛ | 40 | 4,0±1,6 1,4—7,8 pНОНЛ–ГК=0,00001 pНОНЛ–ГС =4·10–11 | 394,9±184,9 143,0—806,0 pНОНЛ–ГС=0,001 | 13,9±5,5 6,7—32,6 pНОНЛ–ГС=0,00003 |
| АРОН | 18 | 4,0±1,5 2,1—7,4 pАРОН–ГК=0,0001 pАРОН–ГС=1·10–8 | 345,6±113,2 161,0—536,0 pАРОН–ГС=0,0006 | 14,3±5,9 7,2—32,2 pАРОН–ГС=0,0002 |
| ГК | 49 | 8,1±3,9 3,1—22,0 pГК–ГС=0,007 | 424,3±138,6 191,0—700,0 pГК–ГС=0,02 | 12,3±4,2 5,6—23,6 pГК–ГС=0,001 |
| ГС | 20 | 17,1±5,4 10,9—28,0 | 564,8±64,9 418,0—683,0 | 8,0±1,3 5,6—10,1 |
Примечание. * — данные представлены в виде: среднее значение ± стандартное отклонение; диапазон минимальных и максимальных значений; значимость различий между группами (р).
Содержание витамина В12 составляло 380,8±168,1 (143,0—806,0) пг/мл в группе пациентов с НОН, 426,4±139,8 (191,0—700,0) и 564,8±64,9 (418,0—683,0) пг/мл соответственно в ГК и ГС (рис. 2). Только в группе с НОН получено снижение уровня витамина В12 ниже референсных значений у 6 пациентов. Получены значимые различия при сравнении пациентов с НОН и ГС (p<0,0001), а также ГК и ГС (p<0,01). Кроме того, значимые различия получены между группами пациентов с НОНЛ и АРОН по сравнению с показателями здоровых добровольцев (ГС) (см. таблицу).
Рис. 2. Содержание витамина В12 в сыворотке крови у пациентов с НОН (группа 1), пациентов ГК (группа 2) и лиц из ГС (группа 3).
Содержание гомоцистеина составляло 14,1±5,6 (6,7—32,7) мкмоль/л в группе пациентов с НОН, 12,3±4,2 (5,6—23,6) и 8,0±1,3 (5,6—10,1) мкмоль/л соответственно в ГК и ГС (рис. 3). При этом у 20 (34,5%) пациентов с НОН, средний возраст которых составлял 28,4±8,8 года, содержание гомоцистеина превышало верхнюю границу референсных значений, в то время как среди пациентов зрелого и пожилого возраста (57,8±17,9 года) с ОН ишемического генеза подобные изменения отмечены только у 5 (9,3%), а в ГС они отсутствовали. При сравнении трех групп выявлена значимая разница между ГС и группой пациентов с НОН (p<0,000003), а также ГК (p<0,0007). Получены значимые различия между группами пациентов с НОНЛ и АРОН по сравнению с показателями здоровых добровольцев (см. таблицу). Такое повышение уровня гомоцистеина в сыворотке крови молодых пациентов с НОН обусловлено пониженным содержанием фолиевой кислоты практически у всех этих пациентов и витамина В12 у части из них.
Рис. 3. Содержание гомоцистеина в сыворотке крови у пациентов с НОН (группа 1), пациентов ГК (группа 2) и лиц из ГС (группа 3).
Обсуждение
Концентрация гомоцистеина в плазме зависит от двух реакций метаболизма, включающих деметилирование гомоцистеина с образованием цистеина и реметилирование до метионина. Витамин В12 и фолат являются кофакторами в процессе реметилирования [4]. Основной причиной гипергомоцистеинемии является снижение активности и уровня ферментов, обеспечивающих метаболизм гомоцистеина.
Ранее было показано, что уже при уровне гомоцистеина >10 мкмоль/л, т.е. формально в пределах так называемых нормальных значений, отмечается значимое увеличение риска артериальных и венозных тромбозов. Снижение уровня гомоцистеина при значениях >10 мкмоль/л обязательно при вторичной профилактике тромбообразования в группах высокого риска, таких как курильщики, пациенты с артериальной гипертензией, нарушениями углеводного обмена, наличием протромботических мутаций [13]. В настоящее время большое внимание уделяется изучению содержания гомоцистеина при аутоиммунных заболеваниях, включая рассеянный склероз, и нейродегенеративных процессах [6, 8, 14, 15]. При обследовании 50 пациентов с рассеянным склерозом концентрация гомоцистеина, превышающая нормальные значения, была выявлена более чем в половине случаев [16]. Авторы отмечают, что полученные данные подтверждают возможное участие гипергомоцистеинемии в развитии эндотелиальной дисфункции при рассеянном склерозе, а также то, что она может быть одним из вероятных механизмов прогрессирования нейродегенерации.
В настоящем исследовании в выборке пациентов с НОН уровень гомоцистеина >10 мкмоль/л выявлен в 75% случаев, в ГК — в 5% случаев.
Снижение уровней фолиевой кислоты и витамина В12 может наблюдаться у людей, злоупотребляющих алкоголем. Так, U. Lachmund и D.S. Mojon в своем исследовании выявили в сыворотке крови низкие уровни фолиевой кислоты и витамина В12 у пациента с мутацией m.11778G>A, ассоциированной с НОНЛ. Однако в анамнезе пациента исследователи отмечают злоупотребление алкоголем, который сам по себе является триггерным фактором для развития клинической симптоматики НОНЛ, а также причиной снижения уровня фолиевой кислоты [15]. Дефицит витамина В12 и в отсутствие генетических нарушений может приводить к развитию симптомов ОН. Согласно исследованиям, цианокобаламин инактивирует пероксидные радикалы и обладает нейропротекторной активностью [4, 10]. При его выраженном дефиците (при недостаточном поступлении с пищей или ввиду нарушений всасывания в желудочно-кишечном тракте) у пациентов развиваются симптомы, характерные для алиментарной ОН.
A. Aleyasin и соавторы, учитывая существующую связь между митохондриями и производными фолиевой кислоты, провели исследование по выявлению полиморфизмов генов MTHFR и MTRR, участвующих в синтезе 5-метилтетрагидрофолата и метионина соответственно, у 21 иранского пациента с НОНЛ и 150 лиц группы контроля [17]. Между пациентами с НОНЛ и контрольной группой наблюдалась значительная разница в частотном распределении генотипов MTHFR C677T и MTRR A66G. Была выявлена сильная ассоциация между НОНЛ и полиморфизмами C677T гена MTHFR (p=0,00) и A66G гена MTRR (p=0,00). По мнению авторов, нарушение метаболизма митохондрий в сочетании с изменением генов фолатного цикла может повлиять на транспорт электронов и приводить к митохондриальной дисфункции и снижению уровня АТФ, что может способствовать тяжести НОНЛ.
Несмотря на имеющиеся публикации, посвященные роли фолиевой кислоты при митохондриальных заболеваниях, сообщений о дефиците фолатов у пациентов с НОН нам не удалось обнаружить.
На сегодняшний день зарегистрированы генетические дефекты почти каждого фермента метаболизма фолиевой кислоты, и большинство из них имеют неврологические последствия. Относительно часто встречается церебральный фолатный дефицит, который определяют как дефицит 5-метилтетрагидрофолата в спинномозговой жидкости в сочетании, как правило, с нормальными показателями фолиевой кислоты в плазме крови. Были описаны различные причины церебрального фолатного дефицита, начиная от врожденных метаболических нарушений, таких как недостаточность дигидрофолатредуктазы (DHFR) и метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и нарушения всасывания фолатов в кишечнике (например, дефекты рецептора фолата 1FRA, кодируемого FOLR1 и связанного с протоном переносчика фолата PCFT, кодируемого SLC46A1), и заканчивая другими нарушениями транспорта фолатов [8, 18, 19].
В литературе приводятся различные доказательства, подтверждающие потенциальную вовлеченность нарушенного метаболизма фолатов в патофизиологию митохондриальных нарушений. Многие исследователи предполагают, что глубокий системный дефицит фолата может способствовать его митохондриальному дефициту. Ключевая роль цитозольного фолата в биосинтезе нуклеотидов, дефицит которого, в свою очередь, может повлиять на механизм репликации мтДНК, заключается в обеспечении энергии транспорта фолата в митохондрии. При этом дефицит АТФ является ключевым патофизиологическим фактором при митохондриальных заболеваниях [8].
Причины дефицита фолиевой кислоты у пациентов с НОН на настоящий момент не определены. Однако их поиск является чрезвычайно актуальным для определения роли фолатного дефицита в развитии НОН, а также возможности его фармакологической компенсации.
Заключение
Таким образом, у пациентов с НОН выявлено выраженное снижение уровней фолиевой кислоты и витамина В12, а также распространенность гипергомоцистеинемии по сравнению с пациентами с ОН иного генеза и группой здоровых добровольцев. Полученные результаты свидетельствуют о значительных метаболических нарушениях у пациентов с НОН. Поиск причин метаболических нарушений является чрезвычайно актуальным для определения роли фолатного дефицита в развитии НОН, а также возможности его фармакологической коррекции.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Н.Ш.
Сбор и обработка материала: Н.Ш., Н.А., Н.Ж., Ю.М., М.Ш.,Т.К.,Т.Ц.
Статистический анализ данных: Н.Ш.
Написание текста: Н.Ш., М.Ш.
Редактирование: Н.Ш., Н.А., Ю.М.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.