Своим возникновением сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) обязана Манфреду Фон Ардену, работавшему в 1937—1938 гг. над изобретением первого сканирующего электронного микроскопа с субмикронным зондом. Первые публикации с результатами изучения биологических образцов с помощью СЭМ появились гораздо позже — в 1960—1970 гг.
В офтальмологии СЭМ начинают применять в 1970—1980 гг. — для изучения ультраструктуры глаза в норме и при патологических состояниях. Отечественная школа электронной микроскопии в офтальмологии началась с работ И.П. Хорошиловой-Масловой [1, 2]. В ФГБНУ «НИИГБ им. М.М. Краснова» методика электронной микроскопии была внедрена при поддержке первого директора института М.М. Краснова, который старался оснащать институт сообразно с новейшими на тот момент мировыми тенденциями в биофотонике, биомеханике, биохимии и изучении заболеваний на ультраструктурном уровне. Сформированная группа электронной микроскопии успешно работала с конца 1980-х годов под руководством А.А. Федорова и являлась поставщиком фундаментальной аналитической информации для многих офтальмологических направлений. Налаженная в XX в. приборная база позволяла проводить актуальные исследования вплоть до начала 2010-х годов [3—5]. В 2014 г. в ФГБНУ «НИИГБ им. М.М. Краснова» был закуплен современный сканирующий электронный микроскоп биологического класса с возможностью проведения исследований в условиях пониженного вакуума. Приблизительно в это же время под руководством А.А. Федорова была сформирована отдельная структура института — лаборатория фундаментальных исследований в офтальмологии. Новая приборная база и новая структура в совокупности дали возможность приступить к разработке нескольких уникальных методик СЭМ, которые раскрыты в настоящем сообщении.
Основные проблемы использования сканирующей электронной микроскопии в медико-биологических исследованиях
Среди всех распространенных в медицине и биологии методов визуализации со СЭМ традиционно конкурируют различные варианты оптической микроскопии. С появлением нескольких технических решений оптической микроскопии под общим названием Super Resolution (микроскопия сверхвысокого разрешения) такая конкуренция распространилась и на область субмолекулярных наблюдений, в которой ранее методы электронной микроскопии были незаменимы.
Возникает ситуация, при которой электронная микроскопия, требующая в отличие от оптических методов многочасовой, а иногда и многодневной подготовки образца к визуализации, перестает давать принципиально бóльшие разрешения и отстает при этом по информативности. В самом принципе современных оптических методов заложено маркирование специфическими метками, в то время как отдельные структуры биологического объекта очень тяжело избирательно маркировать для визуализации с помощью СЭМ.
Специфичность окрашивания отдельных структур можно повысить, привлекая иммунные механизмы, такие как, например, конъюгирование иммуноглобулинов с коллоидным золотом. Однако пробоподготовка при этом сильно усложняется. Это сопровождается проблемами, связанными с различной проницаемостью биологических систем по отношению к конъюгатам и относительно низкой воспроизводимостью результатов. Отчасти по этой причине такая методика имеет весьма ограниченное применение в практической медицине и биологии.
В качестве примера медико-биологического направления, где популярность СЭМ непрерывно снижается, можно привести фундаментальную онкологию. В этой области с начала 1990-х годов неуклонно снижается количество публикаций с новыми технологиями электронной микроскопии, предлагаемыми для изучения биологических объектов [6].
Итак, при рассмотрении основных недостатков, присущих электронной микроскопии как технологии, применяемой для медико-биологических исследований, становится очевидным, что причина падения ее популярности кроется в сочетании трудоемкости и низкой информативности, то есть в непосредственной технологии и методологии применения СЭМ, которые ограничиваются сложностью классической пробоподготовки. Можно сделать вывод, что создание метода подготовки биологического образца к СЭМ, который бы позволил просто, быстро и экономично визуализировать отдельные элементы ультраструктуры с присущим электронному микроскопу разрешением, сделало бы СЭМ снова востребованным методом у исследователей.
Сканирующая электронная микроскопия в качестве экспресс-метода получения информации
Ряд инструментальных диагностических задач в клинической медицине, в частности в офтальмологии, не требуют высокоспецифичной идентификации наблюдаемых объектов, но нуждаются в высокой скорости выполнения теста. Традиционно такими методиками являются морфометрические, тензиометрические и некоторые биохимические тесты.
Есть области, в которых отсроченное получение результата считается допустимым. Одна из таких областей — микробиологическая диагностика. Традиционные методы микробиологической диагностики делятся на две группы. Первая — это все реже применяемая в современной практической офтальмологии низкоспецифичная визуальная идентификация посредством оптической микроскопии мазка или соскоба (срок выполнения 0,5—1 ч). Вторая — культуральный метод с идентификацией дифференциальным культивированием или молекулярными методами: MALDI-TOF, высокопроизводительным секвенированием и т.п. (срок выполнения от 4 сут до 3 нед). Первая группа почти потеряла практическое значение, так как способна с небольшой оценочной надежностью ответить только на четыре вопроса, интересующие клинического специалиста: есть ли признаки простейших в пробе; есть ли признаки грибковой инфекции; есть ли бактериальная контаминация; и в случае положительного ответа на последний вопрос: можно ли быстро оценить гистохимическую принадлежность микроорганизмов к разным группам, например применяя окрашивание по Граму. Сегодня ограниченно применяют этот быстрый тест в связи с большим количеством ошибок, критически значимо влияющих на выбор антагонистических направлений медикаментозного лечения инфекционного поражения. Именно низкая надежность такого теста приводит к тому, что клинический специалист либо готов дожидаться результатов более сложных, культуральных, методов, либо пользуется менее традиционными, молекулярными или молекулярно-генетическими, диагностическими технологиями. Очевидно, что потеря времени при таком ожидании приводит к ухудшению ситуации в результате неадекватных или отложенных назначений. Также очевидно, что повышение качества низкоспецифичной экспресс-диагностики за счет привлечения новой технологии смогло бы значительно улучшить ситуацию с быстрым выбором адекватной стратегии антимикробного лечения. Какова бы могла быть роль электронного микроскопа для решения этой проблемы?
До последнего десятилетия XX в. СЭМ не могла рассматриваться как быстрый метод визуализации биологического объекта. Соответственно, на базе СЭМ невозможно было построить никаких методик экспресс-диагностики. Но в 1970-х годах появились метод и оборудование, позволяющие визуализировать любые объекты вовсе без пробоподготовки [7, 8]. Это так называемая СЭМ в условиях пониженного вакуума (Environmental scanning electron microscopy — ESEM). Объекты размером с крупную молекулу или группы молекул стали доступными для наблюдения без подготовки, то есть с минимальными затратами времени на получение изображений. Однако при визуализации биологических объектов с помощью такого метода качество изображения оставалось относительно невысоким, так как без подготовки контрастность объектов оказывалась очень низкой, а все методики контрастирования требуют времени. Кроме этого, совсем не подготовленные биологические объекты, в том числе микроорганизмы, непрерывно деформируются за счет обезвоживания, которое происходит даже в условиях пониженного вакуума в камере электронного микроскопа. Это сильно затрудняет наблюдение.
Только в 2014 г. удалось принципиально решить проблему низкой контрастности при экспресс-визуализации на сканирующем электронном микроскопе: была предложена так называемая суправитальная схема контрастирования биологических объектов.
Эволюция суправитального контрастирования в качестве метода подготовки биологических образцов для сканирующей электронной микроскопии
Для создания контраста на электронном микроскопе требуется увеличить количество электронных взаимодействий между пучком электронного микроскопа и атомами биологического объекта. Известно, что живая природа состоит в основном из легких элементов таблицы Менделеева: водорода, кислорода, углерода, азота, в меньшей степени кальция, натрия, фосфора, хлора и серы [9]. В атомах этих элементов относительно небольшое количество электронов, что уменьшает интенсивность взаимодействия биологического объекта с электронным пучком микроскопа. Таким образом, техническая задача по созданию любого контрастирующего вещества сводится к дополнению или замещению биогенных элементов атомами с большим количеством электронных орбиталей, то есть с высокими порядковыми номерами в таблице Менделеева. В классической подготовке используются следующие элементы: уран, осмий, свинец. Схемы подготовки, основанные на легировании биологической пробы этими элементами, являются длительными, требуют аккуратного с ними обращения вследствие их токсичности, а также приводят к серьезным искажениям наблюдаемых структур.
В основе предложенной схемы суправитального контрастирования лежит состав, включающий неодим — один из элементов группы лантана. Его атомный номер ниже, чем у классических легирующих элементов, но зато с ним можно сформировать условно физиологичный хлоридный раствор. С 2013 по 2015 г. коллектив ФГБНУ «НИИГБ им. М.М. Краснова» проводит работы по поиску метастабильной композиции, которая бы не приводила к моментальной гибели животной, растительной или бактериальной клетки. Отсроченное на 1—4 с ингибирование клетки позволяет ей самостоятельно вовлечь в клеточный обмен заметную долю этого тяжелого элемента, что в дальнейшем делает контрастными отдельные элементы клеточных ультраструктур на электронном микроскопе.
В 2016 г. в результате коллаборации с малым инновационным предприятием ООО «Глаукон» появляется первый коммерческий продукт — реактив для быстрого контрастирования биологических объектов. В 2016 г. за демонстрацию возможностей этого продукта ФГБНУ «НИИГБ им. М.М. Краснова» получает первое место среди академических организаций на государственной выставке «Импортозамещение».
Применение неодима в суправитальной схеме контрастирования дает возможность в течение 20 мин от поступления пробы в лабораторию получить изображение любого биологического объекта на тканевом, клеточном и ультраструктурном уровнях (рис. 1).
Рис. 1. Изображения, полученные при помощи СЭМ (BSE, контрастирование неодимом) на культуральном пластике.
а — культура клеток лимбального эпителия человека, сформировавших монослой (стрелки указывают на клеточные контакты); б — культура астроцитов человека (сплошная стрелка указывает на ядро, пунктирные стрелки — на митохондрии, звездочками отмечен цитоскелет клетки).
Основными ультраструктурами, которые удерживают неодим, являются белки клеточной адгезии, а также транспортеры кальция и системы, связанные с синтезом или гидролизом аденозинтрифосфорной кислоты, то есть те, где фигурирует свободный фосфатный остаток [10]. Соответственно, на изображениях дополнительную яркость получают клеточные контакты и практически все системы, где происходят энергетические процессы, такие как, например, сборка цитоскелета клетки [11, 12].
Очевидно, что на базе предложенного метода, учитывая его легкость и скорость подготовки биологического образца, может быть построена схема экспресс-визуализации посредством СЭМ. И для ряда медико-биологических задач деликатное контрастирование неодимом и другими лантаноидами является методом выбора [13—16]. Однако если рассматривать СЭМ в качестве диагностического метода, то одного суправитального контрастирования оказывается недостаточно.
В 2017 г., в рамках заседания Федерации лабораторной медицины, комиссия ведущих микробиологов РФ под председательством С.В. Поликарповой дала рекомендацию на доработку набора контрастирующих агентов. Среди прочих было дано указание повысить тропность контрастирующего агента к микроорганизмам и полностью обезопасить работу с опасными патогенами. В 2018 г. нашему коллективу при взаимодействии с ведущим микробиологом России доктором медицинских наук И.В. Чеботарем удалось предложить дополнительный контрастирующий раствор на основе ацетата свинца, который решает поставленные задачи, при этом не удлиняя цикл подготовки пробы для визуализации на сканирующем электронном микроскопе [6].
Двухступенчатая схема контрастирования дополнительно позволяет визуализировать липофильные объекты и увеличить контрастность фосфатов, которыми богаты микроорганизмы. При этом проявляется специфичный для конкретного микроорганизма паттерн контрастирования, что помогает в дифференциальной диагностике. Примеры изображений, получаемых на сканирующем электронном микроскопе при последовательном применении суправитального контрастирования хлоридом неодима и дополнительного окрашивания ацетатом свинца, приведены на рис. 2.
Рис. 2. Изображения осажденных на культуральном пластике колоний микроорганизмов, полученные при помощи СЭМ (BSE, двухступенчатое контрастирование неодимом и ацетатом свинца).
а — колонии Staphylococcus aureus; б — колонии Rothia mucilaginosa. Стрелки указывают на схемы специфичного точечного паттерна на поверхности микроорганизмов.
В качестве примера использования СЭМ как методики экспресс-диагностики выше нами рассматривалась микробиологическая диагностика, а именно ниша низкоспецифичной визуализации микрофлоры в пробе. Стоит отметить, что, несмотря на высокое пространственное разрешение, СЭМ проигрывает оптической микроскопии с гистохимическим окрашиванием в ключевом аспекте диагностики, не позволяя установить наличие или отсутствие капсулы у бактерий. Однако эта проблема может быть решена за счет использования реакции образования минеральной пленки у амфотерных элементов в присутствии воды, то есть за счет создания некоторого аналога реакции окрашивания по Граму. В настоящий момент в институте идет тестирование нового реактива на основе ацетата-нитрата висмута — одного из амфотерных элементов. Предварительные данные демонстрируют высокую тропность образующегося при окрашивании образца минерального полимера (BiOH) к первой от поверхности оболочке многооболочечного объекта (рис. 3).
Рис. 3. Изображение бактерий Escherichia coli на поверхности лабораторного пластика, полученное совмещением двух последовательных съемок на сканирующем электронном микроскопе.
Фиолетовый канал — изображение сразу после контрастирования неодимом, зеленый канал — изображение после дополнительной обработки ацетат-нитратом висмута Bi3+.
И хотя работа нашего института над расширением линейки реактивов для нужд фундаментальной и практической медицины, включая офтальмологию, не завершена, имеющиеся в нашем арсенале реактивы позволяют решать некоторые практические задачи в качестве дополнения к легитимным, сертифицированным методам лабораторной диагностики.
Примеры практического использования сканирующей электронной микроскопии для решения задач клинической офтальмологии
СЭМ с контрастированием образца неодимом или с двухступенчатым последовательным контрастированием неодимом и свинцом может быть использована в исследованиях дистрофических заболеваний роговицы [14, 16], в исследованиях роговичного и конъюнктивального микробиома в норме и при инфекционных поражениях [17, 18], а также в исследованиях микробиома придаточного аппарата глаза [19]. В качестве примера практического использования СЭМ как методики экспресс-диагностики приведем некоторые клинические наблюдения.
В первом случае пациенту был поставлен диагноз кератита неясной этиологии. При первичном приеме с глазной поверхности правого глаза стерильным гибким полистироловым носителем была взята импрессионная проба. Носитель с адгезированными микробными и эпителиальными клетками обработали реактивами из набора, предполагающего двухступенчатую схему контрастирования неодимом и ацетатом свинца. Затем провели визуализацию носителя в камере сканирующего электронного микроскопа EVO LS 10 (Zeiss, Германия). В результате уже через 20 мин удалось получить изображение множественных палочковидных микроорганизмов с умеренным удлинением без образования спор с четкими контурами внешних оболочек (рис. 4).
Рис. 4. Изображение участка импрессионной пробы с поверхности роговицы пациента на пластиковом носителе, полученное при помощи СЭМ (BSE, двухступенчатое контрастирование неодимом и ацетатом свинца).
Палочковидные микроорганизмы показаны стрелками.
При сравнении получившегося изображения с базой изображений эталонных коллекционных штаммов, подготовленной совместно с доктором медицинских наук И.В. Чеботарем [20], было сделано предположение, что этиологический агент относится к роду Pseudomonas. Пациенту назначили соответствующее этиотропное лечение, в результате была быстро достигнута положительная динамика.
Параллельно при первичном осмотре пациенту осуществляли забор биологического материала с поверхности роговицы для проведения микробиологического анализа, который предусматривал выделение чистых культур и последующую их идентификацию с использованием комплекса микробиологических тестов, включая микроскопию, биохимические тесты, масс-спектрометрию. В результате только на 7-й день был идентифицирован этиологический агент воспаления — бактерия вида Pseudomonas aeruginosa. Данный результат подтвердил предположение об этиологическом агенте, сделанное при проведении СЭМ с двухступенчатым контрастированием. При этом на микробиологический анализ было затрачено гораздо больше времени, что в случае начала инфекционного процесса, вызванного синегнойной палочкой, может быть критичным.
Во втором случае при первичном обращении пациенту был поставлен диагноз герпесвирусного кератита с присоединением вторичной инфекции. В процессе сбора анамнеза выяснили, что пациент страдает хроническим алкоголизмом. При первичном приеме с глазной поверхности левого глаза была взята импрессионная проба, которую также подвергли двухступенчатому контрастированию неодимом и ацетатом свинца, и провели визуализацию носителя в камере сканирующего электронного микроскопа. В результате получили изображения нитевидных бактерий, диплококков и явные признаки дрожжеподобных грибов (рис. 5, а). При этом следует отметить, что по результатам микробиологического исследования, проведенного при первичном обращении, у пациента был выявлен только бактериальный компонент комплекса: Streptococcus viridans и Acinetobacter lwoffii.
Рис. 5. Изображения, полученные при помощи СЭМ (BSE, двухступенчатое контрастирование неодимом и ацетатом свинца).
Пунктирные стрелки указывает на дрожжеподобные клетки, сплошные стрелки — на нитевидные микроорганизмы. а — импрессионная проба с поверхности роговицы пациента на пластиковом носителе, звездочками отмечены коккоморфные бактерии; б — поверхность выстилки носослезного канала.
Интересно отметить, что сходный комплекс микроорганизмов, включающий нитевидные бактерии и объекты, сходные с грибами рода Candida, обнаруживается при контрастировании неодимом образцов слезного мешка и носослезного канала у лиц с хроническим алкоголизмом (рис. 5, б), это может свидетельствовать о специфичности микробиома глаза при данном заболевании.
Дальнейшая эволюция экспресс-диагностики на базе сканирующей электронной микроскопии
Недостатком любого метода, основанного на визуальной оценке объектов, является субъективный вклад эксперта в результат. Исключение человека из контура принятия решения в процессе диагностики не только увеличивает объективность получаемых результатов, но и существенно ускоряет проведение теста.
В настоящее время при активном участии нашего института проводится работа над созданием системы автоматизированного анализа изображений, полученных с помощью СЭМ с применением суправитальных методов контрастирования (рис. 6). Система тестируется прежде всего для применения в офтальмологии, но может быть легко экстраполирована на любое направление клинической медицины. В основе экспертной системы лежат перспективные методы компьютерного зрения, машинного обучения и искусственного интеллекта (ответственный разработчик ЦИТП РАН, Одинцово) [21]. Создаваемая аппаратно-программная масштабируемая архитектура включает базы данных и знаний о микробиологических объектах, что необходимо как для начального обучения системы, так и для ее дальнейшего функционирования на основе уже накопленного опыта. Предусмотрена возможность оперативной подстройки параметров при поступлении новой информации и выявлении дополнительных признаков исследуемых образцов. Ключевой особенностью системы является многофакторная процедура выделения и распознавания исследуемых объектов на изображениях, базирующаяся как на методах машинного обучения с использованием нейросетевого подхода и нечеткой логики, так и на традиционных формализованных процедурах обработки визуальных данных и правилах логического вывода с их последующим комплексированием. Применение интеллектуального анализа данных способно обеспечить извлечение новых, неизвестных заранее характеристик микроорганизмов, а также закономерностей их взаимодействия с форменными элементами тканей и клеток человека. Такие закономерности могут быть неочевидными для специалиста-эксперта, но при этом оказывать влияние на качество диагностики. На текущий момент предлагаемый метод не сможет исключить проведения регламентированных микробиологических тестов, но может их эффективно дополнить.
Рис. 6. Примеры статистически успешного автоматического распознавания до ранга рода и вида бактерий рода Staphylococcus epidermidis (а) и рода Pseudomonas aeruginosa (б) на тестовых изображениях коллекционных штаммов микроорганизмов.
В настоящий момент полностью завершена работа над технологической частью методики. Дальнейшая работа предполагает окончательное создание базы коллекционных штаммов (текущая готовность 63%) и доработку механизмов машинного обучения. В результате создаваемый аппаратно-программный комплекс позволит исключить ложноотрицательные результаты диагностики при одновременной постановке любых существующих микробиологических лабораторных исследований, что существенно повысит качество оказания медицинской помощи населению. После завершения данных работ Россия по праву будет претендовать на появление нового быстрого метода, позволяющего определять причину одной из самых значимых проблем мирового здравоохранения — инфекционных болезней. Конкурентов с близкой или аналогичной диагностической технологией в мире не существует.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.