По данным Всемирной организации здравоохранения, от нарушений зрительных функций во всем мире страдают свыше 285 млн человек, из которых 39 млн полностью лишены зрения [1]. Одно из лидирующих мест (более 10 млн человек) среди причин потери зрения занимают поражения роговицы, уступая по частоте возникновения слепоты только катаракте и глаукоме.

Не удивительно, что к роговице приковано пристальное внимание не только практических врачей-офтальмологов, но и специалистов смежных с медициной специальностей, включая клеточных биологов (табл. 1).

Таблица 1. Публикационная активность в области исследований роговицы (по данным pubmed.ncbi.nlm.nih.gov по состоянию на июнь 2022 г.)

Анатомия роговицы

Роговица — уникальная и высокоорганизованная многослойная система, образующая внешнюю прозрачную часть глаза [2—4]. Основные функции роговицы включают оптическую (обеспечивающую беспрепятственное прохождение света к сетчатке) и барьерную (защита более глубоких структур глаза от механического и химического повреждения).

Наружный, контактирующий с окружающей средой слой роговицы сформирован четырьмя-шестью слоями плоского неороговевающего эпителия, внутри которых клетки соединены с помощью плотных контактов. Базальный слой эпителиальных клеток покоится на боуменовой мембране, отделяющей его от стромального слоя. Наружный слой эпителия омывается слезной жидкостью, защищающей его от высыхания и различных патогенов. Еще одной функцией эпителиальных клеток является взаимодействие с нейронами и их аксонами, расположенными в толще эпителиального слоя, где они играют роль, аналогичную таковой шванновских клеток периферических нервов.

Корнеальная строма — самый толстый (около 90% от общей толщины) слой роговицы — сформирована несколькими классами белковых молекул: коллагенами, гликозаминогликанами и кристаллинами, организованными таким образом, чтобы не препятствовать прохождению света и не вызывать его рассеивание. Главным клеточным элементом стромы роговицы являются кератоциты, а также дендритные клетки и макрофаги, участвующие в локальных иммунных и воспалительных реакциях.

Задний (внутренний) слой роговицы покрыт монослоем эндотелиальных клеток, отделенных от стромального слоя базальной (десцеметовой) мембраной, компоненты которой эти же клетки и синтезируют. И сами эндотелиальные клетки, и их базальная мембрана определяют ионный баланс стромы, а также регулируют транспорт жидкости из внутренней камеры глаза.

Поражения роговицы. Выбор тактики лечения

К числу наиболее частых причин повреждений роговицы могут быть отнесены механические, физические и химические поражения, бактериальные и/или вирусные инфекции (включая COVID-19), возрастные изменения и т. д., приводящие к нарушению ее как клеточных, так и структурных компонентов [5—9].

Существующие классификации поражений роговицы учитывают не только причины, но и глубину поражения: повреждение может ограничиваться лишь поверхностными структурами, такими как эпителий, либо распространяться на ее более глубокие слои (строма и эндотелий), а также на переднюю камеру глаза и хрусталик [10, 11]. Еще одним фактором, определяющим последующую тактику лечения, является протяженность поражения — вовлечение в патологический процесс зоны лимба, склеры и слизистой оболочки. И, наконец, возможности методов регенеративной медицины напрямую зависят от того, поражен только один или оба глаза.

В случае тяжелых поражений единственным способом восстановления зрения являются различные техники кератопластики, трансплантация донорской роговицы или (пока в экспериментальных условиях) ее биосинтетических аналогов [12, 13] — ежегодно в мире проводится более 180 тыс. подобных операций, и по их числу офтальмология превосходит даже гематологию, где трансплантация кроветворных стволовых клеток на протяжении нескольких последних десятилетий стала уже практически рутинной процедурой [14, 15].

В остальных, менее драматичных ситуациях внимание специалистов привлекают способы, направленные на стимуляцию регенерации и призванные естественным путем привести к восстановлению структур роговицы и ее функциональности [3, 9, 10, 16—21]. Разумеется, никто не отрицает необходимость применения фармацевтических средств, снижающих дальнейшее распространение поражения, воспаление и последующий фиброз, а также ингибирующих избыточный ангиогенез.

Стволовые клетки роговицы и их дефицит

Как и многие другие типы эпителиальных клеток, эпителий роговицы имеет относительно небольшую продолжительность жизни — 7—10 дней. Обновление эпителиального слоя осуществляется при участии лимбальных стволовых клеток (ЛСК), основной пул которых расположен в области крипт лимба — палисада Фогта, а также менее многочисленной популяции клеток-предшественников в базальном слое эпителия [19]. Основные свойства и характеристики ЛСК уже хорошо изучены и описаны в литературе, равно как и различные способы их применения в офтальмологии [19, 22, 23]. В покое ЛСК обладают минимальной пролиферативной активностью, тем не менее достаточной для постоянной физиологической регенерации эпителия. В ответ на повреждение и они сами, и (преимущественно) их низкодифференцированные потомки демонстрируют всплеск пролиферации, миграции и последующей дифференцировки, восполняя дефицит эпителиальных клеток в области поражения.

К сожалению, так происходит не всегда: при поражениях, затрагивающих зону лимба, страдают и сами ЛСК. В результате возникает состояние, известное сегодня как «дефицит лимбальных стволовых клеток» (в более ранних публикациях можно также встретить термины «конъюнктивализация» или «неоваскулярный паннус»). Помимо травм роговицы есть и другие причины, приводящие к дефициту ЛСК: некоторые генетические аномалии, эндокринные нарушения, синдром Стивенса—Джонсона, длительное ношение контактных линз, возрастные изменения и т.д. [24].

Одним из подходов к лечению дефицита ЛСК является трансплантация небольших биопсийных фрагментов аутологичной лимбальной ткани (при условии, что второй глаз не поврежден) или самих ЛСК, выделенных и дополнительно размноженных in vitro [23, 25, 26]. В противном случае приходится прибегать к трансплантации аллогенного (донорского, чаще трупного) материала, что связано с риском отторжения и диктует необходимость последующей иммуносупрессивной терапии [13, 18, 25].

Ткани перинатального происхождения

К числу тканей, в разные годы и с разным успехом применявшихся в медицине, можно отнести различные части последа: плодные оболочки, пуповину и плаценту (включая выделенные из них клетки), а также пуповинную кровь и амниотическую жидкость. Сведения об их целебных свойствах можно найти как в литературе начала XX в. [27], так и в более поздних публикациях, однако сегодня подобные «биологические отходы», за редким исключением, подлежат утилизации [28].

Амниотическая мембрана

Амниотическая мембрана — один из компонентов амниона, состоящий из одного слоя эпителиальных клеток, базальной мембраны и аваскулярного соединительнотканного матрикса с вкраплением фибробластоподобных клеток. Первые успешные попытки применения амниотической мембраны в офтальмологии были сделаны еще в начале 40-х годов прошлого столетия при лечении дефектов конъюнктивы [29], однако в последующие несколько десятилетий этот подход не нашел широкого применения в связи как с проблемами получения свежего материала, так и с высоким риском его инфицирования. Интерес к амниотической мембране вновь возник уже в 1990-х и особенно 2000-х годах, когда были получены убедительные данные об эффективности ее трансплантации в лечении дефектов роговичного эпителия, дефицита ЛСК, химических и термических ожогов роговицы и т.п. [30—35].

Терапевтические эффекты амниотической мембраны связаны с присутствием в ее составе широкого спектра биологически активных молекул, включая гепатоцитарный и эпидермальный ростовые факторы (HGF и EGF соответственно), фактор роста фибробластов (FGF) и трансформирующий ростовой фактор β (TGF-β), а также компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов I, III, IV и V типов), способствующих адгезии, миграции и дифференцировке эпителия in vitro и in vivo [36, 37]. Эти и другие компоненты амниотической мембраны, вместе и по отдельности, обладают противовоспалительным, антиапоптотическим и антифибротическим действием в отношении эпителиальных клеток, а также предотвращают воспалительную инфильтрацию роговицы клетками гематогенного происхождения [30, 38].

Все сказанное выше справедливо в отношении нативной амниотической мембраны. Однако, как уже отмечалось, трансплантация аллогенного биологического материала, как правило, разнесена во времени с его получением и характеристикой, а также несет риск инфицирования реципиента. В связи с этим отдельного внимания заслуживают способы увеличения сроков хранения трансплантата и снижения степени его биологической опасности. К их числу можно отнести криоконсервацию и изготовление лиофильно высушенных препаратов [39]. С одной стороны, это позволяет продлить сроки хранения до нескольких месяцев, с другой — дает возможность провести необходимые диагностические процедуры в полном объеме и/или стерилизацию гамма-облучением.

Говоря о возможностях применения амниотической мембраны в офтальмологии, нельзя не остановиться еще на одной возможности использования входящих в ее состав «полезных» компонентов, в данном случае в составе глазных капель/искусственной слезы. Гомогенат и последующий экстракт амниотической мембраны содержат те же биологически активные соединения, что и нативный амнион, и, по данным большинства исследователей, обладают сходным терапевтическим эффектом [31, 36, 40—43]. Еще одним преимуществом получаемых глазных капель можно считать возможность более строгого соблюдения условий производства и стерильность продукта, достигаемую фильтрацией через мембранные фильтры.

Сыворотка пуповинной крови

Широкое применение в лечении поражений роговицы различного генеза нашли заменители слезы на основе сыворотки аутологичной или донорской периферической крови [44, 45]. По биохимическим показателям сыворотка крови весьма близка к составу слезной жидкости [46, 47]. В ней присутствуют в достаточно высоких концентрациях многие из ростовых факторов и цитокинов, участвующих в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток роговичного эпителия: EGF, TGF-β, инсулиноподобный ростовой фактор-1 (IGF-1), фактор роста нервов (NGF) [48], а также витамин A и фибронектин. Поскольку концентрация большинства из перечисленных факторов в сыворотке, как правило, в разы превышает их содержание в слезной жидкости, это позволяет использовать данный продукт в разведенном виде с содержанием сыворотки порядка 20%. Подобные глазные капли уже несколько десятилетий успешно применяются в клинической практике для лечения тяжелых форм синдрома сухого глаза, персистирующих эпителиальных дефектов, кератоконъюнктивитов и эрозий роговицы [44, 49—51].

Следует отметить, что при изготовлении глазных капель на основе сыворотки крови предпочтение обычно отдается аутологичному продукту. Это позволяет минимизировать риск инфицирования пациента гемотрансмиссивными патогенами, не входящими в перечень обязательного тестирования донора, либо вероятность аллоиммунизации белками групповой или резус-принадлежности. Однако забор крови и использование аутологичной сыворотки не всегда возможны из-за наличия у пациента сопутствующих заболеваний либо вследствие его возраста. Так, у детей получение достаточного объема крови бывает затруднительно, а у лиц преклонного возраста концентрация в крови ростовых факторов недостаточна для получения желаемого терапевтического эффекта. С одной стороны, это диктует необходимость использования аллогенной сыворотки от проверенных доноров крови, с другой — делает актуальным поиск ее альтернативных источников.

Практически идеальным материалом, пригодным для клинического применения, является сыворотка пуповинной крови. В условиях современных родовспомогательных учреждений пуповинная кровь может заготавливаться в неограниченных количествах, а последующее изготовление сыворотки в сертифицированных лабораториях способно удовлетворить нужды не только офтальмологии, но и других областей регенеративной медицины.

По содержанию факторов роста, цитокинов и других биологически активных соединений сыворотка пуповинной крови выгодно отличается от сыворотки периферической крови взрослых доноров [48, 52]. При культивировании клеток in vitro ее применение позволяет не только отказаться от использования ксеногенных компонентов (сыворотки крови крупного рогатого скота, традиционно используемой для этих целей), но и существенно повысить эффективность экспансии различных типов клеток, включая эпителий роговицы, лимбальные и мезенхимальные стволовые клетки [53—55, 75].

В клинической практике использование глазных капель на основе сыворотки пуповинной крови нашло применение в терапии большинства известных поражений роговицы: рецидивирующих эрозий и тяжелых поражений роговичного эпителия, химических ожогов и т. п. [17, 38, 56—58].

Еще одной областью применения глазных капель на основе сыворотки пуповинной крови является синдром «сухого глаза», часто встречающийся у лиц преклонного возраста или как результат болезни «трансплантат против хозяина» — одного из осложнений аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [45, 59].

Мезенхимальные стромальные клетки

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) — единственный тип клеток нелимбального аллогенного происхождения, нашедший применение в офтальмологической практике для лечения различных поражений роговицы, включая дефицит ЛСК [25, 60—62, 76]. Традиционными источниками МСК как для экспериментального, так и для клинического применения являются костный мозг и подкожная жировая ткань, хотя эти клетки можно получить и из более «экзотических» источников, например менструальной крови или пульпы выпавших молочных зубов.

Несмотря на то что МСК способны непосредственно дифференцироваться в клеточные элементы различных тканей in vitro и in vivo, их терапевтический эффект достигается преимущественно благодаря паракринной активности — синтезу и секреции целой плеяды биологически активных молекул (цитокинов, хемокинов, факторов роста и т.д.), обладающих иммуномодулирующим и противовоспалительным действием [62—64]. Даже апикального применения суспензии МСК бывает достаточно для снижения воспалительной реакции роговицы и стимуляции ее регенерации [62]. Сходным образом действуют клетки, заключенные в трехмерный матрикс или растущие на его поверхности (иногда для этих целей используют амниотическую мембрану), а также клетки, введенные под конъюнктиву глаза [60].

В плане получения и последующего клинического использования МСК ткани перинатального происхождения заслуживают особого внимания. В отличие от костного мозга или жировой ткани их получение не требует специальных хирургических манипуляций, поскольку проводится уже после свершившихся родов. По содержанию МСК и их функциональной (в том числе синтетической и секреторной) активности ткани последа выгодно отличаются от своих «взрослых» аналогов [63, 64]. Даже при наличии у матери инфекционных заболеваний патоген редко проникает в кровоток плода благодаря плацентарному барьеру, что повышает биологическую безопасность используемого клеточного продукта. Наконец, МСК практически не поддерживают репродукцию патогенных вирусов, включая SARS-CoV-2 [65].

Среди прочих перинатальных источников (плаценты, амниотической жидкости) наибольшими перспективами для клинического использования обладают МСК, получаемые из ткани пупочного канатика (МСК-ТПК). Эти клетки могут быть легко выделены, размножены до необходимого количества, охарактеризованы и сохранены в криогенных условиях, что делает данный клеточный продукт практически «продуктом с полки», востребованным в различных областях регенеративной медицины [66].

Однако, несмотря на то что в отношении культивируемых эпителиальных клеток роговицы и ЛСК, а также при экспериментальных поражениях роговицы МСК-ТПК продемонстрировали положительный эффект в виде стимуляции пролиферации и миграции клеток [67—69], найти в литературе отчеты об их терапевтической эффективности не удалось. Что же касается проводимых в настоящее время клинических исследований с использованием МСК, то по ключевым словам mesenchymal AND cornea/corneal в базе www.clinicaltrials.gov таковых нашлось всего 10, из которых активными или законченными оказались лишь половина, и то применительно к МСК костного мозга или жировой ткани. Единственным исследованием на эту тему, удовлетворяющим условиям поиска, оказалось NCT03237442 (Placebo-Controlled, Randomized, Double-blind Trial of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Injection for Ocular Corneal Burn [Плацебо-контролируемое рандомизированное двойное слепое исследование инъекции мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика при ожогах роговицы глаза]), стартовавшее в Китае в 2018 г. с неизвестным результатом.

Расширенный поиск (mesenchymal AND eye/ocular/optic) все же позволил найти несколько ссылок на исследования с применением МСК-ТПК (NCT05147701, NCT04877067, NCT04224207, NCT04315025 и NCT04763369), но все они оказались посвящены лечению пигментного ретинита (retinitis pigmentosa). Для сравнения, в других областях медицины, по данным того же портала, МСК-ТПК являются «участниками» более 350 клинических исследований (табл. 2).

Таблица 2. Клинические исследования с использованием МСК, МСК-ТПК и компонентов их секретома (по данным www.clinicaltrials.gov по состоянию на июнь 2022 г.)

Бесклеточные терапевтические средства на основе МСК

Как уже отмечалось, большинство эффектов МСК являются паракринными, т.е. определяются набором ростовых факторов и цитокинов, выделяемых ими в окружающее пространство. В случае культивируемых клеток этим пространством оказывается среда культивирования, которую МСК «кондиционируют» на протяжении нескольких суток. В результате формируется бесклеточный «коктейль», содержащий достаточно высокие концентрации практически всех компонентов, необходимых для стимуляции процессов регенерации [63, 64]. Помимо растворимых молекул, МСК, равно как и другие типы клеток, способны формировать экзосомы и микровезикулы, являющиеся уже мембранными образованиями [70]. Считается, что экзосомы могут выступать в качестве контейнеров для доставки к клеткам-мишеням различных биологически активных молекул: белков, липидов, мРНК и микроРНК, причем двухслойная структура мембраны экзосом позволяет им «путешествовать» на значительные расстояния, не подвергаясь дегенерации.

В последние годы терапевтический потенциал секретома МСК исследуется не менее активно, чем применение самих клеток [71, 72]. Об этом свидетельствует не только возрастающее количество публикаций, но и появление пока немногочисленных клинических исследований по применению как секретома МСК в целом, так и выделенных из него микровезикул в различных областях медицины (см. табл. 2).

Однако исследованию продуктов секреции МСК в офтальмологии вообще и применительно к поражениям роговицы в частности уделяется крайне мало внимания, несмотря на обнадеживающие результаты доклинических исследований [10, 61, 73]. Между тем, в силу относительной простоты получения, хорошей сохранности входящих в него компонентов при хранении, возможности строгого контроля качества при производстве, а также отсутствия потенциальных рисков, связанных с использованием целых клеток [74], секретом МСК, и в особенности МСК-ТПК, мог бы стать еще одним «продуктом с полки», применимым для лечения поражений роговицы различного генеза.

Заключение

На протяжении нескольких десятилетий ткани перинатального происхождения успешно применяются для лечения поражений роговицы различной этиологии. С развитием клеточных технологий и методов регенеративной медицины арсенал доступных терапевтических подходов к регенерации роговицы уже в ближайшие годы может расшириться благодаря разработке и внедрению в офтальмологическую практику новых клеточных и бесклеточных продуктов, разумеется, после проведения необходимых доклинических и клинических исследований.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.