Конъюнктива является самым обширным по площади компонентом глазной поверхности. Она состоит из васкуляризированной соединительной ткани и покрывающего ее многослойного неороговевающего эпителия с вкраплениями бокаловидных клеток (БК), обеспечивающих наличие муцинового слоя слезной жидкости [1]. Вместе с тем конъюнктива способствует иммунной защите, играя важную роль в поддержании физиологичного состояния слизистой оболочки глаза. При повреждении конъюнктивы происходит заживление ран с реэпителизацией и образованием фиброзной рубцовой ткани [2]. Несмотря на это, различные заболевания глазной поверхности могут серьезно нарушать целостность конъюнктивальной ткани и приводить к росту фиброзной ткани, рубцеванию сводов и их укорочению, а также другим осложнениям в виде трихиаза, эрозий и язв роговицы [3]. Присоединение вторичной инфекции и, как следствие, снижение остроты зрения и боль снижают качество жизни пациентов. В таких случаях хирургическая реконструкция конъюнктивы является одним из первых шагов для восстановления целостности глазной поверхности. Все хирургические подходы включают иссечение рубцовой ткани и ее замещение различными материалами, в том числе аутотрансплантатами слизистой оболочки полости рта, слизистой оболочки носовых раковин и пластику амниотической мембраной (АМ) [4]. Помимо этого в сфере современной тканеинженерной технологии существует множество графтов синтетического происхождения. Субстрат для замещения конъюнктивы должен обладать определенными характеристиками. По данным S. Schrader и соавторов, материал, используемый для восстановления и регенерации конъюнктивы, должен быть прочным (пригодным для хирургического применения), тонким (имитирующим архитектуру окружающих его естественных тканей), эластичным и хорошо переносимым с минимальной воспалительной реакцией [5]. Эти критерии были поддержаны несколькими другими исследователями [6, 7]. Различные модификации хирургических методов и развивающаяся область тканевой инженерии предлагают многообещающие современные подходы к замещению дефектов конъюнктивы.
Методы реконструкции конъюнктивы
Сформировавшиеся вследствие различных заболеваний глазной поверхности ригидность и контрактура век препятствуют физиологичному движению век при моргании и поддержанию полноценной слезной пленки, приводя к редукции слезного мениска, потере БК и ороговению эпителия [8]. Возникающий в результате воспалительный процесс вызывает истощение популяции лимбальных эпителиальных стволовых клеток, что приводит к неоваскуляризации роговицы, врастанию субэпителиальной фиброзной ткани, рубцеванию стромы и, как следствие, помутнению роговицы [9]. Исходя из этого, для полноценного восстановления прозрачности роговичной ткани у пациентов важно обеспечить глубокий мобильный свод век, поскольку исход лечения во многом зависит от нормально функционирующей конъюнктивы [10]. В настоящее время для этой цели используются различные аутологичные или аллогенные донорские ткани, а также материалы синтетического происхождения.
Аутотрансплантация конъюнктивального лоскута
Аутотрансплантат конъюнктивы часто используется для закрытия небольших дефектов конъюнктивы. Впервые подобный метод был представлен J. Barraquer на конгрессе в 1965 г [11]. С 1985 г. самым популярным хирургическим методом лечения птеригиума стала аутотрансплантация [12]. В настоящее время иссечение птеригиума с последующей трансплантацией аутоконъюнктивального лоскута — «золотой стандарт» хирургического лечения птеригиума в связи с более низкой (1,9—8%) частотой рецидивов по сравнению с обычным иссечением [13]. Донорский участок обычно не подвергается пластике или может быть закрыт соседним лоскутом конъюнктивы. Несмотря на эффективность данного метода, его применение ограниченно при двусторонних заболеваниях. Здоровая конъюнктива должна быть доступна для иссечения донорского участка по крайней мере на одном глазу [2]. Поэтому аутотрансплантация конъюнктивы невозможна при двусторонних заболеваниях. В качестве замены были разработаны методы реконструкции с помощью слизистых оболочек другой локализации.
Аутотрансплантация слизистой оболочки полости рта
Трансплантаты слизистой оболочки полости рта для реконструкции свода нашли применение с 1974 г. [14]. Слизистая оболочка полости рта имеет сходные с конъюнктивой биологические свойства, что делает ее возможной альтернативой для реконструкции. Донорский участок доступен для изъятия и может подвергаться повторному забору. Данный метод позволяет избежать риска аллогенного иммунного отторжения и необходимости в иммуносупрессии [15]. Однако дефицит муцинового компонента слизистой оболочки полости рта при системных аутоиммунных заболеваниях может ограничивать возможность использования этого метода. В случаях выраженного синдрома сухого глаза или сухости в анофтальмической полости производится одновременная трансплантация малых слюнных желез с аутотрансплантатом слизистой оболочки полости рта. В 1998 г. J. Murube первым трансплантировал слизистую оболочку губы в заднюю пластинку век у пациентов с дефицитом слезы с резистентностью к консервативному лечению [16]. Несмотря на доступность и наличие донорского участка, очевидная разница в объеме, цвете и текстуре ткани, отличающейся от ткани реципиента, может расцениваться пациентом как косметический дефект. Отечественные авторы провели серию операций с использованием аутотрансплантатов слизистой оболочки губы/щеки при тяжелых последствиях поражения конъюнктивы преимущественно травматической этиологии, где конъюнктивальная ткань была частично или полностью замещена рубцовой, что позволило восстановить подвижность глазного яблока и/или век [17].
Аутотрансплантация слизистой оболочки носовых раковин
Преимущество слизистой оболочки носа перед слизистой оболочкой полости рта в пластике конъюнктивы состоит в том, что помимо муцинпродуцирующих субэпителиальных желез ткань содержит и БК, а это дополнительно способствует увлажнению глазной поверхности. Кроме того, слизистая оболочка носовых раковин редко поражается при системных воспалительных заболеваниях слизистых оболочек. Первыми такую реконструкцию свода провели R. Kuckelkorn и соавторы у пациентов с химическими и термическими ожогами [18]. Дальнейшие исследования показывают, что использование слизистой оболочки носа приводит к повышению продукции муцина и сохранению БК в трансплантате. В исследовании H. Wenkel и соавторов у 94% пациентов наблюдалось уменьшение симптомов заболеваний, а средняя плотность БК, измеренная с помощью импрессионной цитологии, до трансплантации составляла 48/мм2, а после аутотрансплантации слизистой оболочки — 432/мм2 [19].
Основным недостатком использования слизистой оболочки носа в качестве замены конъюнктивы является сложность получения достаточного количества ткани для снабжения обширных участков. Несмотря на доступный объем слизистой оболочки, ее иссечение и забор затруднительны, поскольку требуются частичная резекция носовой раковины, удаление костной или кавернозной ткани и последующее истончение полученной слизистой оболочки, что увеличивает длительность операции, а впоследствии сопровождается долгим восстановительным периодом.
Трансплантация АМ
АМ представляет собой трехслойную структуру из эпителиального монослоя с базальной мембраной, состоящей из коллагенов II, IV и V типа и гликопротеинов, включая ламинины, нидогены и фибронектин. Расположенная ниже аваскулярная строма имеет упорядоченную коллагеновую структуру. Компактный слой выстилает внешнюю часть базальной мембраны с параллельным направлением расположения пучков коллагена. Нитевидные соединения пересекают и связывают пучки интерстициального коллагена с базальной мембраной, обеспечивая структурную целостность [4]. Первое применение АМ в качестве трансплантата зафиксировано в 1995 г. [20]. В настоящее время АМ широко используется для реконструкции конъюнктивы и ее сводов как в виде интактной мембраны, так и в качестве носителя для эпителиальных клеток (ЭК) [21]. В литературе описаны различные виды обработки АМ, включая криоконсервацию, лиофилизацию с последующей γ-стерилизацией и стерилизацию с последующим высушиванием на воздухе [22]. Во всех вышеперечисленных процессах клетки амниотической оболочки погибают, в результате чего трансплантируется только матрикс АМ, а не живые, потенциально регенеративные клетки. В зависимости от клинической ситуации используются различные хирургические методики наложения АМ. Возможно применение АМ в качестве трансплантата с ее фиксацией базальной мембраной кнаружи, что стимулирует миграцию ЭК из соседней области поверхности глаза. АМ, используемая в качестве покрытия стороной стромы кнаружи, способствует реэпителизации и уменьшению окружающего воспаления, особенно на острой стадии повреждения [23]. Она содержит факторы роста, включая эпителиальный фактор роста и фактор роста кератоцитов, которые были выделены в основном из амниотического эпителия и стромы АМ. Материал оказывает противовоспалительное действие, индуцируя апоптоз в воспалительных клетках, ингибирует образование рубцов, подавляя сигнальный путь трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) и высвобождая противовоспалительные цитокины из своего эпителия и стромы, а также способствует эпителизации, индуцируя фактор роста эпителия (EGF) [21—23]. Тонкая и эластичная АМ имеет косметическое преимущество перед объемными трансплантатами слизистой оболочки в отдаленном послеоперационном периоде. Кроме того, АМ подходит для покрытия дефектов конъюнктивы после резекции опухоли, поскольку ввиду ее прозрачности возможно клинически контролировать рецидив опухоли [24].
Несмотря на то что АМ — часто используемый нативный материал для пластики, у данного вида трансплантатов есть риск передачи гемотрансмиссивных заболеваний [25]. Также отмечается, что после проведения пластики с помощью АМ частота рецидивов птеригиума гораздо выше (6,4—42,3%) по сравнению с аутотрансплантацией конъюнктивы (3,3—16,7%) [26]. АМ склонна к сокращению при воспалительных процессах, что объясняет низкий функциональный результат после операции. S. Barabino и соавторы провели трансплантацию АМ на девяти глазах с поздней стадией глазного рубцового пемфигоида, однако рецидив симблефарона случился через 28 нед на четырех глазах. Несмотря на увеличение глубины свода, половина полученного результата была потеряна ввиду рецидива контрактуры [27].
Применение АМ в качестве носителя для клеток, их миграции и пролиферации на поверхности глаза было отмечено еще в 1997 г. в экспериментальной работе P. Prabhasawat и соавт. [28]. Авторы отметили 10-кратное превышение плотности БК, культивированных на АМ, по сравнению с контрольной группой. В работе D. Meller и соавторов зафиксировано, что прогениторные клетки конъюнктивы сохраняются на АМ и могут дифференцироваться в БК в пермиссивной стромальной среде in vitro [29].
В настоящее время для применения АМ в качестве графта для ЭК конъюнктивы у донора выполняется забор ткани конъюнктивы, которая помещается на АМ, тем самым формируя «культуру эксплантов» [30]. Другой методикой является формирование «суспензионной культуры», при которой клетки отделяются от ткани конъюнктивы посредством ферментативного расщепления, а затем наносятся на АМ [31]. Также методом трансплантации ЭК на основе АМ является техника COMET (от англ. Cultivated Oral Mucosal Epithelial Transplantation — культивированная трансплантация ЭК слизистой оболочки полости рта), при которой клетки биоптата слизистой оболочки полости рта используются для размножения in vitro [32]. Несмотря на то что COMET применяется для реконструкции роговицы, было отмечено, что он эффективен при симблефароне и восстановлении анатомии свода век [33].
Тканевая инженерия в реконструкции конъюнктивы
Поскольку каждый из методов трансплантации биологических материалов имеет определенные особенности, достижения в области технологии офтальмологической тканевой инженерии привели к разработке новых биосинтетических материалов, которые позволяют расширить хирургический арсенал в реконструкции и лечении глазной поверхности.
Внеклеточный матрикс в реконструкции конъюнктивы
Внеклеточный матрикс (ВКМ) каждого органа имеет специфические тканевые свойства, зависящие от состава и расположения белков ВКМ. В частности, ткань конъюнктивы должна быть тонкой и эластичной, но при этом прочной благодаря определенной комбинации коллагена, ламинина, нидогена, тромбоспондина и фибронектина [34]. Эти свойства делают децеллюляризованную ткань подходящим скаффолдом для реконструкции. Кроме того, такая ткань биосовместима и уже используется в клинической практике — в кардиохирургии и для реконструкции мочевыводящих путей [35, 36]. Исходя из составляющих ВКМ, исследователи пытались воссоздать графт для культуры ЭК конъюнктивы. Существует три типа субстратов ВКМ: децеллюляризованный ВКМ из культивируемых клеток и тканей; субстраты с белками или комбинацией белков ВКМ; субстраты с отдельными пептидами белков ВКМ [37]. Децеллюляризация направлена на удаление всех клеточных компонентов и антигенов без изменения состава оставшегося ВКМ [38]. В нескольких исследованиях сообщалось о росте многослойного конъюнктивального эпителия с БК на децеллюляризованном ВКМ конъюнктивы [39, 40].
Другим подходом в изготовлении скаффолдов является лиофилизация децеллюляризованного ВКМ и его измельчение в порошкообразную форму, которая впоследствии добавляется в состав [41]. L.A. Bosworth и соавторы отмечают, что порошковая форма ВКМ, добавленная к полимерам (PCL), формирует биоактивные скаффолды, которые поддерживают распределение человеческого конъюнктивального эпителия до пяти слоев [42]. Источниками ВКМ были мочевой пузырь свиньи и подслизистая оболочка тонкой кишки. В перспективе же интересна оценка влияния непосредственно децеллюляризованной конъюнктивы, включенной в структуру полимеров.
Недостатками ВКМ децеллюляризованных тканей в качестве скаффолда являются различия в структуре ВКМ между донорами, риск инфицирования и развития иммунологических реакций со стороны реципиента при аллогенной или ксеногенной трансплантации [37].
В качестве еще одной альтернативы аутологичным и аллогенным трансплантатам могут использоваться другие природные полимеры, такие как шелк и кератин, однако эти материалы должны быть модифицированы перед трансплантацией [43]. Шелковый фиброин — белковый полимер, который состоит из аминокислот глицина, серина и аланина, благодаря чему с помощью специфических биоактивных молекул облегчается процесс прикрепления клеток к поверхности [44]. Известно, что фиброин в чистом виде вызывает воспалительную реакцию и риск воспаления выше в присутствии серицина, клееподобного белка, скрепляющего фиброиновые мононити. На первом этапе обработки серицин удаляется. В результате получается волокнистый материал, который можно растворить, а затем преобразовать в различные формы с нужными физическими свойствами и прозрачностью. В работе M. He и соавторов отмечается, что фиброин шелка, покрытый RGD-пептидом или поли-D-лизином, поддерживает рост ЭК конъюнктивы человека и БК, экспрессирующих кератин-7 [45]. Дополнительно фиброин уместно использовать в носителях как армирующий элемент, что дает преимущество в повышении механических свойств графта [46].
Коллаген
Коллаген — наиболее распространенный компонент ВКМ стромы конъюнктивы, лежащей под эпителием, обладающий рядом положительных характеристик в роли субстрата для восстановления структуры конъюнктивы. Поэтому использование коллагена для создания скаффолда логично, так как клетки эпителия конъюнктивы человека, культивированные на коллагене, способны образовывать сливной и плотно сцепленный слой. В чистом виде трансплантация клеточной культуры невыполнима в силу невозможности быстрого их прикрепления на пересаживаемую поверхность, и добиться этого можно благодаря использованию коллагена в составе тканеинженерной конструкции. Еще в 1988 г. в исследовании R.J. Tsai и соавторов оценивали разницу между графтами на основе коллагена I типа и матригелем, пластиком, предметными стеклами, а также влияние вида субстрата на рост и дифференцировку клеток [47]. Первичные культуры клеток на пластике образовали монослой мелких эпителиоподобных клеток на 7-й день. При последующем пересеве скорость их роста снижалась, клетки становились увеличенными, плоскоклеточными и демонстрировали процесс регресса. Данные морфологические изменения были еще более яркими в культурах, выращенных на предметных стеклах. Напротив, клетки, выращенные на коллагеновом геле, образовывали организованный монослой, в то время как на матригеле они показали интенсивный характер роста, наличие плотных контактов между клетками и развитие базальной мембраны. Авторы пришли к выводу, что рост и дифференцировка ЭК определяются лежащим в их основе ВКМ.
Поскольку коллагеновые гидрогели непрозрачны и состоят из рыхло упакованных коллагеновых фибрилл, чем обоснована их низкая механическая стабильность, область их применения ограничена. Чтобы решить эту проблему, R. Brown и соавторы описали процесс получения механически стабильной коллагеновой конструкции посредством контролируемой дегидратации с использованием пластической компрессии [48]. В исследовании C. Drechsler и соавторов сжимаемый пластиком коллагеновый матрикс обладал свойством устойчивости и удерживался узловыми швами на глазной поверхности. После 7 дней культивирования ЭК сохраняли свою колониеобразующую способность и экспрессировали маркеры клеток-предшественников [30]. Более позднее исследование показало, что сжатые пластиком коллагеновые гели интегрировались в ятрогенный дефект конъюнктивы у кроликов и поддерживали эпителиальное расслоение, экспрессию БК и произвольное распределение коллагеновых волокон [49].
Помимо сжатия пластиком коллагеновых гелей, существует процесс витрификации геля для модификации его механических свойств [6]. T. Takezawa и соавторы разработали гидрогелевую мембрану из коллагена I типа, используя трехэтапный метод обработки: гелеобразование, витрификацию и регидратацию [50]. Витрификация — это этап, позволяющий воде в гидрогеле испаряться контролируемым образом, во время чего коллагеновые фибриллы реорганизуются и образуют поперечные связи между собой. Таким образом, обычный непрозрачный гидрогель коллагена превращается в тонкую, эластичную и прозрачную мембрану с повышенной плотностью его волокон. Такой материал получил название «витригель». В процессе витрификации есть три основных переменных: температура, относительная влажность и время. X. Calderón-Colón и соавторы изменяли показатели этих переменных и изучали свойства витригеля в разных условиях. Витрификация при температуре 40 °C и относительной влажности 40% способствует созданию оптимального материала, который прозрачен, механически прочен и эластичен [51]. После трансплантации витрифицированной коллагеновой мембраны с адгезированными на ней клетками в дефект конъюнктивы кролика наблюдалась более быстрая реэпителизация с включенными в нее БК, чем в группе с мембраной без клеток или в контроле, где рана конъюнктивы не подверглась пластике [6].
Синтетические полимеры
Поскольку аутологичная трансплантация имеет ряд ограничений, возникла необходимость в создании и разработке синтетических биоматериалов с более стабильными физическими свойствами. Применение синтетических полимеров возможно в качестве альтернативы биологической ткани ввиду таких свойств, как биосовместимость, биоразлагаемость, механическая прочность и сходство с волокнистой природой ВКМ [52]. Они могут производиться в неограниченном количестве, иметь длительный срок хранения, а состав матрикса можно адаптировать для персонализированного применения. Полимеры также обладают такими характеристиками, как предел прочности при растяжении, модуль упругости и скорость лизиса полимера. Скорость распада будет разной в зависимости от того, какие полимеры включены в состав скаффолда. Преимущество синтетических полимеров в том, что при их применении отсутствует риск передачи гемотрансмиссивных инфекций [53]. Наиболее часто используемые полимеры — полилактидкликолид (PLGA) и поликапролактон (PCL).
PLGA — это полимер, состоящий из сложных полиэфиров молочной и гликолевой кислот [54]. В работе S. Hong и соавторов проведено культивирование первичных ЭК конъюнктивы человека in vitro с фибробластами теноновой капсулы на PLGA, покрытый фибронектином для улучшения клеточной адгезии и пролиферации [55]. Авторы отмечают большее количество пролиферирующих ЭК в группе с культивированными фибробластами и активацию Ki67 с экспрессией эпителиального маркера CK19. Также отмечено наличие маркеров MUC1 и клеток конъюнктивы MUC5AC в эпителиальном слое. В последующем эксперименте in vivo в группе с тканеинженерной конструкцией «PLGA + клетки» зона деэпителизации на роговице сократилась вдвое.
PCL — это биосовместимый полиэфир, полученный в результате полимеризации ε-капролактона [56]. Для полного лизиса в тканях реципиента материалу требуется до 3 лет [57]. Ввиду длительного времени распада PCL используется для регенерации костей и сухожилий. Благодаря этому свойству одним из важных преимуществ PCL является то, что его можно комбинировать с другими, менее устойчивыми полимерами для нужной скорости лизиса скаффолда. В исследовании Y.J. Shin и соавторов in vivo наблюдалась 100% реэпителизация с дифференцированными БК спустя 2 нед засева на PLC-скаффолд. Полученный результат был сходен с группой контроля с АМ. Несмотря на то что покрытие PCL поливиниловым спиртом (PVA) помогало снизить интенсивность воспалительного процесса in vivo, данный полимер слишком быстро подвергался лизису (через 14 дней) по сравнению с простым PCL, который замещался окружающей тканью донора через 1 мес [58]. В исследовании Q. Yao и соавторов был синтезирован скаффолд из фиброина шелка и полимолочной кислоты с ε-капролактоном (PLCL) методом электроспиннинга [59]. С помощью сканирующего электронного микроскопа и оценки пролиферации клеток in vitro авторы показали, что ЭК конъюнктивы, культивируемые на этом субстрате, адгезируют и образуют эпителий толщиной в два-четыре слоя. При трансплантации конструкции in vivo мышам обнаруживались более дифференцированные слои клеток, выделяющие СК4, СК19 и MUC5AC. Ввиду гидрофобных свойств данный полимер требует оптимизации его поверхности для повышения адгезии с клеточной составляющей. L.P. Ang и соавторы получили ультратонкие мембраны из PCL, способствующие прикреплению и пролиферации ЭК конъюнктивы in vitro [56]. Наблюдалось большее количество пролиферирующих клеток на ультратонких носителях из PCL, предварительно орошенных гидроксидом натрия, по сравнению с однослойным эпителием на ничем не обработанном полимере.
Несмотря на присущие полимерам положительные характеристики, ни один из существующих материалов не отвечает всем критериям оптимального субстрата для реконструкции конъюнктивы. Хотя PLGA и PCL и были протестированы in vitro и in vivo в качестве возможных скаффолдов в реконструкции конъюнктивы, они не обладают такой эластичностью, как естественная конъюнктива, что является существенным недостатком для пластики конъюнктивальных дефектов [56, 58]. Полученный матрикс не был эластичным и прозрачным. Кроме того, исследования синтетических полимеров проводились на здоровых животных, поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения роста клеток при наличии патологического процесса in vivo.
Заключение
Восстановление конъюнктивы является одним из приоритетных направлений в реконструкции переднего отрезка глаза. Учитывая, что данная ткань многофункциональна, заменитель конъюнктивы должен соответствовать нескольким критериям. Материал должна быть гибким, стабильным и эластичным, не вызывать воспалительного процесса или реакции отторжения и содержать клеточный состав с потенциалом пролиферации на поверхности скаффолда, особенно при возможном дефиците стволовых клеток конъюнктивы. Более того, этот клеточный состав должен содержать как ЭК, так и БК, необходимые для поддержания стабильности слезной пленки и глазной поверхности.
В настоящее время для реконструкции конъюнктивы доступны разного рода материалы, но ни один из них не лишен каких-либо недостатков. Существует клиническая потребность в создании универсального скаффолда, особенно для лечения больших по площади дефектов конъюнктивы. Остается открытым вопрос о том, насколько скоро будет возможно создание и применение в клинической практике «идеальной» тканеинженерной конструкции с клеточным составом.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.