Возможности декомпозиции спектра оптической флуоресценции мейбума

Мейбум играет основную роль в поддержании гомеостаза глазной поверхности. Исследование липидных компонентов мейбума, их структура и функции представлены во многих работах [1—3]. К настоящему времени известно, что мейбум в основном состоит из нейтральных липидов, таких как сложные эфиры воска, сложные эфиры холестерина, свободный холестерин, триацилглицериды, и меньшего количества полярных соединений, таких как свободные жирные кислоты, фосфолипиды, сфингомиелины, церамиды и др. [4]. Относительно недавно появились данные, показывающие, что мейбум, как и слезная пленка, содержит не только липидные компоненты, но и различные компартменты белков, которые разделяют полярные и неполярные липиды. Физиологическая роль этих белков заключается в их способности удерживать вокруг себя липиды, что положительно влияет на гомеостаз глазной поверхности. Напротив, денатурированный белок, находящийся внутри липидных капель, оказывает на них конденсирующее воздействие, что приводит к повышению температуры плавления, затвердеванию мейбума и снижению его экспрессии на глазную поверхность [5].

Был проведен протеомный анализ мейбума человека, в результате которого идентифицировано более 90 белков. К основным белковым компонентам относятся кератины (K1, 5, 6, 7, 9, 10, 13, 16), лактоферрин, липофиллины, липокалины, предшественник лакритина, предшественник лизоцима С, белки-переносчики фосфолипидов, сурфактантные белки (SP-B, SP-C), протеогликаны, цитохром C, рецептор, активированный фарнезоидом X, рецептор соматостатина 4, регуляторный фактор 3 интерферона. У некоторых белков установлены локальные тканевые источники их экспрессии и определена их физиологическая роль [6—9].

Доказано участие в стабилизации слезной пленки ELOVL4 протеина (Elongation of very long chain fatty acids protein 4), экспрессируемого в тканях мейбомиевых желез, который опосредует тканеспецифический биосинтез насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот с очень длинной цепью [10].

Установлено, что источником кератинов 7, 13 являются ацинарные клетки мейбомиевых желез. Их избыточная концентрация не только нарушает нормальную структуру липидной пленки, но и сокращает время разрыва слезной пленки [11].

Липокалины относятся к группе липид-аффинных белков. Подтверждена их роль в поддержании границ раздела слезной пленки за счет взаимодействия с липидными мембранами [12]. Так, являясь белками-переносчиками гидрофобных молекул липидов, липокалины участвуют в транспорте и удалении продуктов перекисного окисления липидов, тем самым защищая глазную поверхность [13, 14].

Источником лактоферрина являются эпителиальные клетки слезных желез, роговицы и конъюнктивы, секреторная активность которых координируется слезной функциональной единицей. Лактоферрин демонстрирует противовоспалительные, иммуномодулирующие, антиоксидантные, противомикробные, противовирусные и противоопухолевые свойства [15]. Лактоферрин благодаря своим уникальным свойствам играет ключевую роль в образовании слезной пленки, предотвращая развитие заболеваний глазной поверхности. Способность лактоферрина поглощать свободные радикалы кислорода и гидроксила при нормальном объеме слезной жидкости ухудшается из-за его низкого уровня при развитии синдрома сухого глаза. Уровень лактоферрина является одним из важных предикторов стабильности и/или изменения объема слезопродукции. Существует положительная корреляция между объемом слезной жидкости и концентрацией лактоферрина: гиполакримия соответствует низкому содержанию белка [16—18].

Количественно оценить отдельные компоненты мейбума возможно с помощью протеомных технологий. К таким высокотехнологичным исследованиям относятся различные модификации масс-спектрометрии и высокопроизводительная жидкостная хроматография [19]. Однако высокая стоимость исследований затрудняет применение этих методов в рутинной практике.

Метод флуоресцентной спектроскопии в видимом оптическом диапазоне широко используют в медицине для аттестации различных биологически активных субстратов человека [20]. Метод основан на преобразовании поглощенной энергии относительно коротковолнового излучения в излучательный спектральный ответ испытуемого вещества. В отношении исследования состава мейбума до настоящего момента он не применялся.

Цель исследования — оценить возможности применения оптической флуоресценции для определения компонентов мейбума.

Исследование мейбума произведено у 16 добровольцев, средний возраст 32,5±2,5 года, после получения письменного информированного согласия. Критериями исключения были: наличие дисфункции мейбомиевых желез, установленное методом инфракрасной мейбографии, наличие роста патогенной микрофлоры при исследовании посева с конъюнктивы, обнаружение клеща рода Demodex по данным акарограммы, прием местных и системных лекарственных препаратов, а также применение декоративной косметики.

Мейбум получали с верхнего и нижнего века обоих глаз у каждого пациента при отсутствии изменений на ресничном крае век: устья мейбомиевых желез открыты, без признаков кератинизации и наличия в них мутного или густого секрета, а также дилатированных сосудов.

Забор мейбума осуществляли путем сжатия века между стеклянными аппликаторами, не касаясь его края. Секрет собирали платиновым шпателем и помещали в стерильный эппендорф или виалу (без пирогенов, РНКазы, ДНКазы и ДНК). Далее образцы подвергали быстрому замораживанию при температуре −80°C до момента транспортировки в лабораторию.

Использованные спектральные эталоны были отобраны исходя из данных литературы о составе мейбума. Отснято несколько спектров веществ-эталонов: природного очищенного кератина (кератина человеческого волоса), лактоферрина (ООО «Лактобио», Россия) и рибофлавина мононуклеида 10 мг/мл (ОАО «Фармстандарт», Россия). Спектры эталонов приведены на рис. 1.

Рис. 1. Спектры выбранных веществ-эталонов — рибофлавина-мононуклеотида (зеленый), лактоферрина (бордовый), нативного кератина (синий) — после кондиционирования (см. пояснения в тексте).

Исследование состава мейбума проводили с помощью установки для флуоресцентной спектроскопии и захвата спектров методом флуоресцентной спектроскопии в видимом оптическом диапазоне.

В темной зоне на одном уровне в горизонтальной плоскости были размещены спектрометр, дополнительная апертура, конденсорная линза, сменный петельчатый проволочный захват для удержания вязких биологических образцов, поглощающий экран и коллимированный источник постоянного когерентного лазерного излучения 450 нм (рис. 2).

Рис. 2. Схема установки для получения спектра мейбума и эталонных веществ.

1 — испытуемый образец; 2 — проволочный петельчатый держатель; 3 — лазер; 4 — поглощающий экран; 5 — конденсорная линза; 6 — дополнительная апертура; 7 — спектрометр.

Диодный источник когерентного лазерного излучения 450 нм (MingNuo OpticElectronic, China) был расположен под углом 90° по отношению к каналу приемника сигнала. Образец находился в петле проволочного держателя, который был ориентирован так, чтобы поверхность облучаемого лазером образца переизлучала в сторону конденсорной линзы и приемного окна монохроматора InSpectrum 300 (Acton, США) со встроенным CCD-детектором. Спектры флуоресценции образцов были зарегистрированы в диапазоне 480—720 нм со спектральным разрешением 0,25 нм.

Помимо спектров было записано темновое значение спектрального шума, который всегда присутствует в спектре лазера, в спектрах проб и эталонов. Его интенсивность пропорциональна относительному времени накопления сигнала.

Перед дальнейшими операциями вычитали темновое значение шума из спектрального сигнала лазера пропорционально времени накопления. Также вычитали темновое значение шума из спектрального сигнала каждого образца и эталона пропорционально времени накопления.

Отдельно был записан спектр возбуждающего лазера, рассеянного на матированной хромовой мишени. При дальнейших вычислениях учитывали то, что интенсивность сигнала лазера соотносится с интенсивностью полезного сигнала образца произвольно. Это связано с инструментальными девиациями геометрии эксперимента, но в большей степени с индивидуальной рассеивающей способностью пробы, частично перенаправляющей световой поток лазера в сторону спектрометра.

Для пропорционального вычитания мешающего сигнала лазера из спектра пробы была проведена оценка его относительной интенсивности на участке спектра вне спектрального максимума лазера. Такой подход был сочтен предпочтительным, так как в этом случае на результат меньше влияет непропорциональность детектора и лучше используется динамический диапазон. При несовершенстве спектра лазера (наличии артефактов в длинноволновой части относительно спектрального максимума) выбирали ту часть его спектра, которая близка по интенсивности к измеряемому полезному сигналу. Мы допустили, что в диапазоне 471—475 нм не происходит эффективного возбуждения пробы. Это предположение было проверено. Используя эффект выгорания биологических флуорофоров, мы убедились, что интенсивность в этой части спектра при выгорании не меняется при кратном снижении сигнала биологических флуорофоров, которое происходит в более длинноволновых частях спектра. Таким образом, независимо от экспозиции можно оценить интегральную интенсивность в этом диапазоне, привести спектр лазера к этим значениям и вычесть его из каждого частного анализа.

Из предварительно очищенного от темнового шума спектра, захваченного для каждой пробы, вычитали сигнал лазера пропорционально интегральной интенсивности в диапазоне 471—475 нм. Это было последним этапом предпроцессинга.

Аналогично были обработаны спектры веществ-эталонов: нативного кератина, лактоферрина и рибофлавина-мононуклеотида.

После кондиционирования проводили комбинированным методом декомпозицию на три спектральных компонента (соответствующие трем спектрам веществ-эталонов). Асимметрия спектра лактоферрина связана с поглощением железа в зоне 525—575 нм. Этот факт следует учитывать в случае предполагаемого присутствия лактоферрина в компонентном составе двух других эталонных флуорофоров. Для этого был сформирован синтетический спектр с отрицательными величинами флуоресцентного отклика в зоне 525—575 нм. При ненулевом значении лактоферрина данные автоматически пропорционально добавляли к спектру флуоресценции. Помимо лактоферрина поглощением в этом диапазоне обладает гем, присутствие которого не учитывали. Далее два компонента (кератин и рибофлавин) математически смешивали перебором, при этом третий компонент в результирующий спектр добавляли аналитически, способом, описанным в патенте РФ на изобретение №2362489 [21]. После каждой итерации оценивали математическое сродство спектра, полученного смешиванием, с реальным спектром пробы. Во время каждой итерации изменение долевого отношения кератина к С на 0,01 проводилось до тех пор, пока суммарный синтетический спектр (кератин + рибофлавин + флуоресценция лактоферрина − поглощение лактоферрина) не достигал максимального сродства (взвешенной ковариации) к спектру образца в диапазоне 471—590 нм. Максимальная достигнутая в результате перебора пирсоновская корреляция спектров в этом диапазоне соответствовала 0,942—0,999, что можно условно принять за оценку аппаратной надежности декомпозиции. Графический вариант разделения спектра на составляющие представлен на рис. 3.

Рис. 3. Пример декомпозиции спектра образца.

Спектры для декомпозиции: нативного кератина (А), синтетического спектра, сформированного суммой флуоресценции лактоферрина, поглощением лактоферрина и флуоресценции кератина и рибофлавина, взятой в соответствующих пропорциях (Б), а также рибофлавина-мононуклеотида (В) (см. пояснения в тексте). Суммарный спектр веществ-эталонов (Г). Спектр образца (Д). В рамке численно охарактеризовано сродство суммарного спектра веществ-эталонов и реального спектра образца.

Методом флуоресцентной спектроскопии в видимом оптическом диапазоне спектры образцов мейбума были записаны при возбуждении лазером 440 нм. Во всех случаях была выявлена флуоресценция вещества пробы мейбума. Установлено существенное различие по характеру флуоресценции между пробами, отобранными у разных доноров (рис. 4, а, б).

Рис. 4. Варианты спектров флуоресценции мейбума при возбуждении лазером 440 нм.

Наиболее типичные спектры (а), относительно длинноволновый и коротковолновый типы флуоресценции (б).

Условная спектральная составляющая одного из предложенных веществ-эталонов в доле каждого реального спектра приведена в таблице.

Компонентный состав спектров мейбума пациентов по данным флуоресцентной спектроскопии при возбуждении лазером 440 нм

Примечание. * — номера образцов с недостоверными результатами декомпозиции спектров.

Как следует из приведенной таблицы, метод имеет высокий коэффициент надежности и позволяет определить отдельные компартменты, которые составляют основную долю массы мейбума. Попытку декомпозиции аномальных спектров №3, 15 (рис. 4, б) нельзя признать успешной, так как были достигнуты предельные значения при низком коэффициенте надежности. Это можно объяснить присутствием неотождествленного флуорофора в представленных образцах.

Мейбум — это богатый липидами секрет, который вырабатывается полностью дифференцированными мейбоцитами. Липиды мейбума разнообразны и уникальны по своей природе и значительно отличаются от любого другого липидного пула, содержащегося в организме человека. Основные особенности, которые делают мейбум уникальным, — это соотношение идентифицированных классов липидов, экстремальная длина компонентов, интенсивное ω-гидроксилирование жирных кислот и спиртов, изо- и антеизоразветвление мейбомиевых липидов (например, воски) и наличие довольно уникальных сложных липидов с несколькими сложноэфирными связями [18]. Компартменты мейбума анализировали различными способами. Ранее исследование мейбума методом флуоресцентного анализа применяли для изучения возможности связывания липидами липокалина слезы. Липиды в слезе человека могут замедлять испарение, образуя поверхностный барьер на границе с воздухом. Липиды, образующие комплексы с основным липид-связывающим белком в слезе — липокалином слезы, находятся в водном слое и могут выполнять функции, не связанные с образованием поверхностного барьера. Установлено отсутствие связывания ди- и триглицеридов, сквалена, OAHFA, сложных эфиров воска и холестерина с липокалином, а также присутствие этих липидов вблизи границы раздела «воздух — воздух» [22].

По мнению I.A. Butovich и соавторов, изучение конформации липидов и явлений их агрегации (когда меченые липиды смешиваются с нормальными) возможно методом флуоресцентной спектрометрии липидов, но он является малоэффективным при определении структурных изменений [23, 24].

В данной работе методом флуоресцентной спектрометрии удалось провести эталонное сравнение полученных образцов мейбума в отношении лактоферрина, кератина и флавина.

Таким образом, результаты наших исследований подтверждают данные E.A. Sato и соавторов: экспрессия лактоферрина осуществляется не только эпителиальными клетками роговицы и конъюнктивы, но и клетками мейбомиевых желез [25]. Это служит объяснением снижения уровня лактоферрина в слезе пациентов с эвапоративной формой синдрома сухого глаза при дисфункции мейбомиевых желез [26].

Наряду с выявлением в составе мейбума кератина и лактоферрина, что совпадает с результатами ранее проведенных другими авторами исследований, было обнаружено наличие флавинов [6, 27, 28]. Флавин — общее название группы органических соединений, образующихся на основе трициклической гетероциклической молекулы изоаллоксазина. Биохимическим источником флавинов является витамин B₂, рибофлавин. В крови рибофлавин циркулирует в связи с альбумином и в небольшом количестве с другими белками (иммуноглобулинами). Внутрь клеток рибофлавин проникает по механизму облегченной диффузии. Нарушение всасывания рибофлавина наблюдается при различных заболеваниях пищеварительного тракта, а также при лечении антибиотиками, которые подавляют жизнедеятельность кишечной микрофлоры.

Анализ флавопротеома человека был проведен W. Lienhart и соавторами, в результате чего авторы указали на связь флавопротеома человека с различными заболеваниями [29, 30]. Большинство функциональных нарушений при изменениях флавопротеинов связаны с дисфункциями митохондрий, поскольку именно в митохондриях находится основное количество флавопротеинов. Установлена связь флавопротеинов с развитием эндоплазматической и пероксисомной дисфункций, что указывает на роль, которую флавины играют в функциях, выполняемых этими органеллами, способствуя метаболизму липидов [29, 31].

Проведено исследование, касающееся цитотоксического действия флавинов, действующих как фотосенсибилизаторы. Установлено, что фотоиндуцированное окисление белка ганглиозных клеток сетчатки снижает эффективность митохондрий [32]. Методом флуоресцентной спектроскопии в видимом оптическом диапазоне была определена повышенная флуоресценция окисленной формы митохондриальных флавопротеинов в сетчатке. Это стало новым инструментом диагностики окислительного стресса при заболеваниях сетчатки, особенно при диабетической ретинопатии и возрастной макулярной дегенерации.

Предварительные данные, полученные в настоящей работе, демонстрируют, что метод оптической флуоресцентной спектроскопии в видимом диапазоне возможно использовать для исследования мейбума и идентификации отдельных белковых компартментов: кератина, лактоферрина, флавина. Используя предложенный алгоритм, удалось разбить спектр флуоресценции всех полученных образцов мейбума на спектральные доли каждого из трех кандидатных флуорофоров.

В задачи исследования не входило отождествление относительной интенсивности флуоресценции веществ в пробе и определение их абсолютных или относительных содержаний. Не учитывали также содержание других оптически активных метаболитов и экзогенных веществ. Предложенная схема декомпозиции условна и будет существенно скорректирована после уточнения реальной доли вхождения флуоресцирующих веществ в состав мейбума.

Несмотря на предварительный характер полученных результатов, продемонстрированная вариабельность спектров флуоресценции мейбума убедительно доказывает перспективность создания клинических диагностических приборов на основе спектроскопии в видимом диапазоне, что обусловлено доступностью образцов для исследования и технической простотой выполнения тестов. Клиническое применение этого метода позволит выявить изменения состава белков и небелковых флуорофоров мейбума, которые можно рассматривать в качестве предикторов ранней стадии дисфункции мейбомиевых желез, последующего развития синдрома сухого глаза (эвапоративной формы) и других заболеваний. Для стандартизации показателей необходимо провести дальнейшие исследования характера флуоресценции мейбума на большей выборке пациентов. Это позволит выявить в экспрессируемом материале композиционные изменения, характерные для коморбидных состояний, приводящих к поражению глазной поверхности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Новиков И.А., Сафонова Т.Н., Солодовников В. И.

Сбор и обработка материала: Новиков И.А., Зайцева Г.В., Добрецова Е.А.

Статистическая обработка данных: Новиков И.А.

Написание текста: Новиков И.А., Зайцева Г.В., Сафонова Т.Н.

Подготовка иллюстраций: Новиков И.А.

Редактирование: Новиков И.А., Зайцева Г.В., Сафонова Т.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.