Способ получения трансплантата предесцеметового слоя стромы

В настоящее время с развитием технических возможностей, хирургических методик и с расширением знаний о микроанатомии и физиологии роговицы в лечении заболеваний роговицы предпочтение отдается селективному замещению патологически измененных ее слоев с сохранением интактных (здоровых).

В 2013 г. профессор H.S. Dua и соавторы описали находящийся между стромой и десцеметовой мембраной непроницаемый для воздуха предесцеметовый слой (ПДС) (слой Дуа), который отделяется от вышележащей стромы «большим пузырем» 1-го типа [1, 2]. Если целесообразность включения ПДС в качестве отдельной номенклатурной единицы в нормальную микроанатомию роговицы дискутируется, то его «существование» для специалистов, занимающихся пересадкой роговицы, и его значимость для хирургической микроанатомии роговицы очевидна и не оспаривается в среде трансплантологов. В зависимости от того, с какой стороны от ПДС расположен воздушный «большой пузырь», выделяют три его типа, на основе чего строится классификация глубокой передней кератопластики (DALK). В случае расположения воздушного «большого пузыря» между ПДС и стромой (1-й тип), методика классифицируется как субтотальная передняя послойная кератопластика (Subtotal Anterior Lamellar Keratoplasty — STALK). В случае расположения «большого пузыря» между ПДС и десцеметовой мембраной (2-й тип) операция классифицируется как тотальная передняя послойная кератопластика (Total Anterior Lamellar Keratoplasty — TALK; прежнее название — dDALK) [3]. В случае формирования двух пузырей, разделенных ПДС, «большой пузырь» классифицируется 3-м типом.

После открытия ПДС стромы появилась технология PDEK (pre-Descemet’s endothelial keratoplasty; предесцеметовая эндотелиальная кератопластика), которая позволяет использовать роговичную ткань от молодых доноров и облегчить этап расправления трансплантата в передней камере [4—8].

По результатам иммуногистологических и морфологических исследований, ПДС имеет постоянные характеристики: состоит из 3—5 ламеллей (5—8 после пневматизации), толщина ±10 мкм, представлен преимущественно коллагеном 1-го типа (есть также 4-й и 6-й типы), эластическими волокнами, не содержит кератоциты, средний диаметр до 8,5—9 мм. Слой отличается высокой прочностью, эластичностью и непроницаем для воздуха [2, 9]. С учетом роговичного происхождения, минимальной толщины, прозрачности и ацеллюлярности нами предполагается его использование в клинической практике методом бесшовного покрытия роговицы по аналогии с трансплантацией боуменова слоя [10] для разграничения клеточных популяций и исключения клеточного смешения [11—14]. Предполагается, что подобная технология будет эффективна в хирургическом лечении субэпителиальных фиброзов [15] и, возможно, персистирующих эрозий роговицы. Для реализации предложения клинического применения и оценки эффективности в первую очередь необходима методика получения изолированного трансплантата ПДС.

Цель исследования — представить способ получения трансплантата ПДС стромы роговицы для последующего клинического применения (трансплантации путем бесшовного покрытия роговицы).

Исследование проведено с использованием 15 корнеосклеральных дисков. Средний возраст доноров составил 49,7±4,2 года (от 42 до 66 лет).

Со всех корнеосклеральных дисков ранее была отделена десцеметова мембрана (с эндотелием) по ранее описанной методике и использована в ходе операций DMEK [16]. Пять из 15 корнеосклеральных дисков были ранее криоконсервированы в среде Борзенка—Мороз при температуре −72°C. Средний срок криоконсервации составил 3,9±2,5 дня (от 2 до 10 дней). Остальные 10 дисков хранились в среде Борзенка—Мороз при температуре 4°C в течение 1 дня (6 дисков) и 2 дней (4 диска) после удаления десцеметовой мембраны. Восемь из 15 дисков, из них 4 криоконсервированных, были без боуменова слоя. Последний был ранее отсепарован по описанной нами методике для последующей трансплантации [17].

Техника формирования трансплантата ПДС. Корнеосклеральный диск (без десцеметовой мембраны) размещают в аспирационном фиксаторе «эпителиальной» стороной вниз (рис. а). Инсулиновую иглу 30G сгибают иглодержателем посередине на 30—45° и присоединяют к инсулиновому шприцу, заполненному стерильным воздухом. В трабекулярной зоне иглу просветом «на себя» вводят в роговицу и продвигают к ее центру максимально близко к «эндотелиальной» поверхности роговицы (см. рис. а). Достаточно быстро надавливая на поршень, вводят воздух в строму роговицы (пневматизация) до сепарации ПДС от стромы, формирования воздушного «большого пузыря» 1-го типа (рис. б). Процедура пневматизации может быть выполнена неоднократно до сепарации ПДС от стромы и формирования «большого пузыря» намеченного диаметра. Повторная пневматизация осуществляется путем отсоединения шприца от иглы и повторного забора воздуха в шприц с сохранением иглы в исходной позиции в строме роговицы. После формирования воздушного пузыря оптимального диаметра иглу продвигают внутрь «большого пузыря» и заменяют шприцом, заполненным 0,05% трипановым синим. Надавливая на поршень, воздушный пузырь частично заполняют красителем (рис. в, г). Не выводя иглу из пузыря, аспирируют его содержимое (рис. д) и только после этого иглу выводят из роговицы (рис. е). Хирургическим циркулем определяют диаметр окрашенного ПДС. Корнеосклеральный диск переносят на вакуумный высекатель и трепаном на 0,25 мм, меньше величины, полученной циркулем-измерителем, иссекают роговицу по краям отслоенного ПДС (рис. ж). Струей раствора BSS, пинцетом или шпателем отслоенный и окрашенный ПДС отделяют от стромы (рис. з) и переносят (рис. и) в контейнер с консервантом.

Техника формирования трансплантата предесцеметового слоя.

а — корнеосклеральный диск без десцеметовой мембраны «эпителиальной» стороной вниз расположен в фиксаторе, и согнутая инъекционная игла располагается в строме просветом «на себя»; б — сформирован «большой пузырь» 1-го типа; в, г — введение красителя в «большой пузырь» и окрашивание предесцеметового слоя стромы; д — аспирация воздуха и красителя из «большого пузыря»; е — опорожненный пузырь с прокрашенным предесцеметовым слоем; инсулиновая игла выведена из стромы; ж — трепанация корнеосклерального диска по краям прокрашенного отслоенного предесцеметового слоя; з — отделение отслоенного и прокрашенного предесцеметового слоя от подлежащей стромы; и — отделенный от стромы и окрашенный предесцеметовый слой (трансплантат) фиксирован в пинцете.

Во всех 15 случаях после пневматизации стромы без десцеметовой мембраны достигнута сепарация ПДС от стромы роговицы. Диаметр сепарации варьировал от 6 до 8 мм. В двух первых случаях имел место разрыв «большого пузыря» и ПДС. Мы связываем это с первоначальным использованием шприца объемом 2 мл и инсулиновой иглы 26G. Подобные параметры инструментов традиционны для выполнения пневматизации в ходе DALK и для формирования трансплантата для PDEK [4, 18]. В норме десцеметова мембрана крепко фиксируется к переднему пограничному кольцу Швальбе и практически гарантированно предотвращает разрыв «большого пузыря» любого типа. Однако в случае отсутствия десцеметовой мембраны (как в данном случае) разрыв «большого пузыря» и, следовательно, ПДС неизбежен. По этой причине в остальных последующих 13 случаях пневматизации роговицы нами использовались более умеренные параметры пневматизации благодаря применению инсулиновой иглы меньшего диаметра (30G) и шприца меньшего объема (1 мл), чем в первых двух случаях и чем обычно. Успешная сепарация ПДС без его разрыва во всех последующих 13 случаях подтверждает обоснованность замены инструментов.

Мы не заметили разницы в характере сепарации ПДС в зависимости от температуры и давности консервации. По нашему впечатлению, умеренный отек стромы роговицы, в том числе по причине отсутствия десцеметовой мембраны и эндотелия, способствует сепарации ПДС при пневматизации стромы. Отсутствие десцеметовой мембраны гарантирует формирование единственно возможного «большого пузыря» 1-го типа.

Предложенная методика не требует дорогостоящего оборудования и выполняется обычным общедоступным инструментарием. Крайне важным является то обстоятельство, что для получения трансплантата ПДС не требуется дополнительного количества донорской ткани, так как возможно и желательно использовать остаточные диски роговицы без десцеметовой мембраны и слоя Боумена, в том числе криоконсервированные. Таким образом, имеет место полное соответствие принципу мультитрансплантации и рациональное использованию донорской ткани.

Предложенная техника сепарации предесцеметового слоя из корнеосклеральных дисков без десцеметовой мембраны (и боуменова слоя) в нашей ограниченной серии исследований убедительно показала максимальную воспроизводимость. Способ не требует использования дорогостоящего оборудования, дополнительной донорской ткани и технически прост.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Оганесян О.Г.

Сбор и обработка материала: Оганесян О.Г., Багаманова Э.К., Гусак Д.А.

Написание текста: Оганесян О.Г., Багаманова Э.К.

Редактирование: Оганесян О.Г., Торопыгин С.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.