Гнойно-воспалительная патология традиционно лидирует по частоте среди заболеваний уха, горла и носа. Поражения уха, горла и носа инфекционного генеза занимают второе место в структуре общей заболеваемости в крупных городах России. В г. Москве данная патология составляет примерно 19% от всех заболеваний уха, горла и носа [1], при этом на долю бактериальных инфекций уха приходится порядка 40% [2].
В последние годы, несмотря на повышение качества оказания медицинской помощи на уровне амбулаторного звена, отмечен рост числа госпитализаций, связанных с осложненным течением инфекционных заболеваний [3]. Одной из причин этого является неуклонный рост антибиотикорезистентности бактерий и, как следствие, трудности в подборе эффективных препаратов.
Такие факторы, как чрезмерное и неправильное назначение и использование антибиотиков, активное их применение в ветеринарии и в сельском хозяйстве, способствовали распространению устойчивости к противомикробным препаратам. Несмотря на успехи в разработке новых лекарственных препаратов, становится понятно, что стремительное развитие резистентности предотвратить невозможно. Продолжает нарастать угроза, создаваемая неуклонным ростом антибиотикорезистентности среди микроорганизмов из группы внутрибольничных патогенов ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.), а также появлением таких ферментов, как металло-β-лактамазы-1 и гена MCR-1 (mobilized colistin resistance), которые вызывают резистентность к широкому спектру бета-лактамных антибиотиков, включая препараты из групп резерва (карбапенемам и колистиметат натрия) [4]. Сложившаяся ситуация является основанием для выработки альтернативной стратегии применения противомикробных препаратов, и терапия на основе использования бактериофагов является таковой [5].
В настоящее время в России активно обсуждается возможность использования бактериофагов в терапии гнойно-воспалительной патологии носа и околоносовых пазух. Так, в 1995 г. опыт применения бактериофагов при патологии уха, горла и носа в педиатрической практике продемонстрировала О.В. Стратиева, предложившая способ лечения острых и рецидивирующих параназальных синуситов у детей посредством введения раствора пиобактериофага поливалентного очищенного в пазухи при катетеризации или методом перемещения в течение 6 дней. Следует отметить, что она получила положительный клинический эффект у 66,7% больных без нарушения проходимости естественных соустий [6]. Ряд исследований, проведенных за последние 20 лет в России, также доказал эффективность препаратов бактериофагов в лечении острой и хронической патологии носа и околоносовых пазух у взрослых и детей [7—10].
Применение бактериофагов в оториноларингологии не ограничивается лечением риносинуситов, их не менее активно применяют в лечении заболеваний глотки и гортани. Однако следует отметить, что использование этой группы препаратов в терапии заболеваний уха до настоящего времени освещено недостаточно.
В данном обзоре мы стремились представить современные работы, касающиеся терапии воспалительных заболеваний уха препаратами бактериофагов, результаты микробиологических исследований, проведенных в условиях in vitro, основной целью которых была борьба с мультирезистентными штаммами микроорганизмов, являющимися возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний наружного и среднего уха.
Одним из патогенов, часто выделяемых при патологии наружного и среднего уха, является S. aureus. Данный микроорганизм характеризуется высоким уровнем резистентности к антибактериальным препаратам и является проблемным с точки зрения подбора адекватной антибактериальной терапии. В этой связи возможность применения альтернативных антимикробных препаратов особенно актуальна. Проведенные в последнее время исследования доказали эффективность фагов и их ферментов — эндолизинов, специфичных против этого патогена, на различных моделях животных и в клинических испытаниях на людях.
Так, особый интерес представляет использование бактериофагов для лечения пациентов с инфекциями, вызванными MRSA. В 2018 г. T. Ferry и соавт. опубликовали результаты применения смеси бактериофагов к P. aeruginosa и S. aureus у пациентки с рецидивирующей инфекцией протезированного тазобедренного сустава, вызванной S. aureus. Посредством внутрисуставного введения препарата у пожилой пациентки обеспечены клиническое улучшение, элиминация возбудителя и отсутствие побочных эффектов [11].
В исследовании I. Takemura-Uchiyama и соавт. оценена эффективность препаратов бактериофагов против S. aureus в экспериментальных условиях у мышей. В исследовании использовали бактериофаг phi MR11. Путем внутрибрюшинных инъекций S. aureus (8×108 клеток), включая устойчивые к метициллину штаммы, вызывали экспериментальную бактериемию, которая приводила к смерти мышей. Летальность удавалось сократить благодаря внутрибрюшинному введению очищенного phi MR11. Авторы отмечают, что положительная динамика наступала в результате быстрого появления phi MR11 в кровотоке, который оставался на значительном уровне до тех пор, пока не происходила гибель бактериальных клеток под воздействием бактериофага. Однократное введение высокой дозы phi MR11 не вызывало побочных эффектов. Эти результаты подтверждают эффективность фаговой терапии против тяжелых инфекций, вызванных S. aureus, у людей и позволяют предположить, что phi MR11 может быть потенциальным прототипом генно-модифицированных усовершенствованных терапевтических фагов, активных в отношении мультирезистентных штаммов S. aureus [12].
Ряд работ, которые рассмотрены далее, направлены на борьбу с мультирезистентными штаммами возбудителей, нередко вызывающих гнойно-воспалительные заболевания наружного и среднего уха. Несмотря на то что они проведены либо в условиях in vitro, либо в процессе лечения инфекционной патологии неоториноларингологического профиля, для науки данные исследования представляют не меньшую важность.
В одном из крупнейших исследований, Phagoburn, первом в мире проспективном многоцентровом рандомизированном слепом контролируемом клиническом исследовании фаговой терапии, осуществлялась терапия ожоговых ран, инфицированных E. coli и P. aeruginosa. Для первой фазы набраны пациенты с подтвержденной ожоговой раневой инфекцией из 9 ожоговых центров больниц во Франции и Бельгии. Критериями включения стали: возраст старше 18 лет, наличие ожоговых ран, инфицированных P. aeruginosa. Участники случайным образом распределены с использованием интерактивной системы. Лечение осуществлялось путем обработки раны либо коктейлем из 12 естественных литических бактериофагов P. aeruginosa, либо крем-эмульсией сульфадиазина серебра (стандарт лечения). Оба препарата применялись в качестве ежедневного местного лечения в течение 7 дней с последующим наблюдением в течение 14 дней. Ежедневно производили микробиологический контроль. По результатам исследования авторы обнаружили, что бактериальная нагрузка в наиболее инфицированных ранах была успешно снижена у 50% участников в конце лечения фагом. Однако у этой группы (PP1131) среднее время для достижения конечной точки было значительно больше, чем у пациентов группы стандартного лечения. При этом отмечен интересный факт: наиболее тяжелые септические осложнения, включая септический шок и инфекционные осложнения, возникали в 2 раза чаще у пациентов группы стандартной помощи, чем группы, в которой использовали PP1131 [13].
Новейшая работа проведена группой исследователей из Австралии. Описаны два бактериофага, jFG02 и jCO01, активных в отношении клинических штаммов одного из группы внутрибольничных патогенов ESKAPE — A. baumannii. В ходе исследования установлено, что рецептором для этих фагов служит бактериальная капсула. Устойчивые к фагам мутантные штаммы бактерий несут в себе изменения в генах, ответственных за биосинтез капсулы, что приводит к ее утрате и нарушению адсорбции фага [14].
В большинстве научных работ в качестве исследуемых фаговых препаратов используются препараты, содержащие целостные структуры бактериофагов. В настоящем обзоре мы хотим обратить внимание на новые исследования с использованием препаратов, в составе которых ферментативные вещества — эндолизины бактериофагов и пептидогликангидролазы. Последние синтезируются как часть строго контролируемых поздних генов фага, которые обычно помогают зрелым фаговым частицам лизировать бактерии. В виде очищенных белков такие ферменты называются энзибиотиками, они представляют значительный интерес как новая группа противомикробных препаратов. В настоящее время рекомбинантный эндолизин (Staphefekt SA100) официально зарегистрирован в Европе и доступен для местного применения на поверхности кожных покровов. В литературе описаны случаи успешного применения этого препарата у пациентов с хроническими и рецидивирующими дерматозами, вызванными S. aureus [15].
Помимо этого, M. Rashel и соавт. сообщают об успешной очистке клонированного лизина, кодируемого новым бактериофагом S. aureus phi MR11. Лизин, обозначенный как MV-L, быстро и полностью разрушал клетки исследуемых штаммов S. aureus, включая устойчивые к метициллину и к ванкомицину, а также штаммов S. aureus, обладающих промежуточной устойчивостью к ванкомицину (VISA). Эти результаты показывают, что MV-L может быть эффективным терапевтическим средством против инфекций, вызванных полирезистентными штаммами S. aureus [16].
В исследовании A. Daniel и соавт. на моделях мышей с септицемией доказано эффективное синергетическое действие лизина ClyS при совместном применении с оксациллином или ванкомицином. Комбинированная терапия лизином с одним из антибактериальных препаратов защищала животных от заражения метициллинрезистентным штаммом S. aureus. В эксперименте мышам вводили внутрибрюшинно патоген, а через 3 ч — однократную дозу (1 мг) ClyS+антибиотик. Все мыши из контрольной группы погибли через 24 ч, в то время как 89% мышей, которым вводили препараты, выживали. Такая терапия оказалась эффективной даже в случае низкой дозы антибактериального препарата, что указывает на возможность совместного использования ClyS для потенцирования действия неэффективного препарата ввиду резистентности к нему возбудителя заболевания [17].
Помимо очищенного лизина ученым удалось получить химерный фермент, созданный слиянием двух лизоцимов пневмококковых фагов, принадлежащих к семейству гликозилгидролаз, — Cpl-711. P. Letrado и соавт. в своем исследовании определяли in vitro эффект одновременного применения Cpl-711 и одного из антибактериальных препаратов (амоксициллина, цефотаксима, левофлоксацина, ванкомицина) против четырех различных мультирезистентных штаммов Streptococcus pneumoniae с последующей проверкой результатов на модели лабораторных животных. Полученные результаты показали, что комбинированное применение Cpl-711 с амоксициллином или цефотаксимом оказывало синергетическое бактерицидное действие против мультирезистентного клинического изолята S. pneumoniae серотипа 23F. Синергизм между Cpl-711 и цефотаксимом подтвержден на моделях мышей и рыбках данио. Таким образом, комбинация Cpl-711 и цефотаксима может помочь в лечении заболеваний и их осложнений, вызванных полирезистентными штаммами пневмококка [18].
В указанных работах доказана эффективность фаговых ферментов в качестве антибактериальных средств. Следует обратить внимание на то, что использование фаговых ферментов вместо целых фагов выгодно из-за их более быстрого действия, что является несомненным преимуществом. Однако S. Chhibber и соавт. в своем исследовании показали альтернативный вариант увеличения скорости разрешения инфекционного процесса. При лечении раневой инфекции фагами jMR-5 и jMR-10 совместно с липосомами у мышей с сахарным диабетом 2-го типа авторами отмечено ускорение процесса заживления ран и сокращение продолжительности раневой инфекции [19].
Большинство исследований препаратов на основе ферментов пока находятся на этапе доклинических испытаний, в то время как препараты бактериофагов доказывают свою эффективность при различных заболеваниях, в том числе инфекционных заболеваниях наружного и среднего уха.
Известно, что диффузный наружный отит представляет собой, по сути, гнойное разлитое воспаление кожи наружного слухового прохода. Развитие инфекционного процесса при данном характере поражения начинается с мягких тканей наружного слухового прохода в результате микротравмы кожных покровов различными предметами, особенно часто при использовании гигиенических палочек, а также в результате различных врачебных манипуляций. При этом необходимо помнить о возможности распространения этиологически значимых микроорганизмов в прилегающие структуры, такие как основание черепа и височная кость. Наиболее частыми возбудителями наружного бактериального отита являются P. aeruginosa и S. aureus [20, 21]. Реже при воспалительных заболеваниях наружного уха высевают Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, S. pneumoniae, Enterococcae, различных представителей семейства Enterobacteriaceae и другие микроорганизмы [22—24].
По данным Л.Т. Баязитовой и соавт., на долю P. aeruginosa приходится до 38% в общей структуре возбудителей наружного отита [25, 26]. В 2019 г. этой группой исследователей опубликованы результаты работы, которая выполнена с 2010 по 2018 г. (n=304). На первом этапе авторы изучали антибиотикочувствительность этиологически значимых микроорганизмов. По результатам исследования отмечено снижение чувствительности P. aeruginosa к ципрофлоксацину до 78,9%, к левофлоксацину — до 61,5%, к офлоксацину — до 60,0%. Отмечено снижение антисинегнойной активности карбапенемов. Так, к меропенему были чувствительны 79,3% выделенных штаммов, к имипенему — 76,1%. Выявлено резкое снижение эффективности антибактериальных препаратов из группы цефалоспоринов: доля цефаперазон-чувствительных изолятов составила 51,8%, доля цефтазидим-чувствительных штаммов — 58,6%. Наиболее резкое снижение чувствительности отмечено у цефепима: менее половины (40,7%) исследованных штаммов микроорганизмов оказались чувствительными к цефепиму. На втором этапе исследования изучена чувствительность клинических изолятов P. aeruginosa, выделенных в 2017—2018 гг., к бактериофагам. В качестве альтернативных препаратов подобраны бактериофаги с заявленной антисинегнойной активностью: пиобактериофаг поливалентный секстафаг и интести-бактериофаг. Авторы сообщают, что 84,3% штаммов P. aeruginosa лизировались интести-бактериофагом, 79,4% — пиобактериофагом секстафаг. Количественная оценка литической активности бактериофагов показала высокую активность исследуемых бактериофагов, что позволило авторам рекомендовать их для использования с целью эрадикации P. aeruginosa у пациентов с наружным отитом [27].
B. Weber-Dabrowska и соавт. в 2006 г. описали случай эффективной комбинированной терапии специфическими фаговыми препаратами и препаратом лактоферрина (при пероральном приеме) наружного отита у 24-летней женщины, возникшего в результате осложнения перенесенного вируса гриппа. Первоначальная терапия включала нескольких курсов применения топического глюкокортикостероидного препарата, а также комбинированных препаратов, содержащих глюкокортикостероиды с антибиотиками — без значительного эффекта. По результатам микробиологического исследования выделены штаммы Staphylococcus hominis и S. epidermidis. После окончания курса указанной комбинированной терапии (фаговый препарат + лактоферрин) удалось добиться элиминации микроорганизмов и полного выздоровления пациентки [28].
Еще одним широко распространенным заболеванием уха, которое трудно поддается лечению, является хронический гнойный средний отит (ХГСО). Распространенность ХГСО в нашей стране составляет 8,4—39,2% на 1000 населения. Среди всех хронических заболеваний уха, горла и носа ХГСО является наиболее частой патологией (до 48,8%). Среди пациентов, которым оказывается помощь в стационарных отделениях оториноларингологии, 5,7—7% страдают ХГСО. ХГСО с частыми обострениями является причиной отогенных осложнений, которые в настоящее время возникают у 3,2% больных. Основным этиологически значимым микроорганизмом в генезе ХГСО среди бактерий аэробного профиля является P. aeruginosa, высеваемая изолированно в 31,1—98% случаев, вторым по частоте является S. aureus, высеваемый в 15—30% случаев. Среди прочих микроорганизмов высеваются облигатно-анаэробные бактерии из родов Peptococcus, Bacteroides, а также представители семейства энтеробактерий — Klebsiella и Proteus, их выделяют в 10—20% случаев [29].
Первый опыт применения фаготерапии в лечении ХГСО принадлежит советским врачам-исследователям. Так, Н.А. Преображенский, И.И. Гольдман и А.И. Липкин в 1982 г. в своей работе «Проблемы консервативного лечения больных хроническим гнойным средним отитом» в качестве одного из исследуемых препаратов использовали стафилоккоковый бактериофаг местно при тампонировании постоперационных полостей, нагноившихся в разные сроки после операции. Авторы сообщили о полном и стойком прекращении гноетечения у пациентов после курса лечения [30]. Л.Д. Кривохатская и А.С. Чемеркин в 1984 г. провели работу, в которой доказали возможность повышения бактериолитической активности синегнойного бактериофага при ХГСО посредством использования реакции нарастания титра фага [31]. В 1985 г. Л.И. Волосевич и соавт. исследовали эффективность применения препаратов бактериофагов у больных с хроническим гнойным мезотимпанитом. Под наблюдением находились 70 пациентов с заболеванием в стадии обострения. Всем пациентам проводили микробиологическое исследование полученного отделяемого из уха. Основными возбудителями явились S. aureus и P. aeruginosa. Сравнительную эффективность фаготерапии и системной антибиотикотерапии оценивали по данным клинического и микробиологического обследования. Результаты исследования показали сопоставимо высокую эффективность препаратов бактериофагов при обострении хронического гнойного мезотимпанита в сравнении с антибактериальными препаратами. Авторами отмечен более ранний регресс клинической симптоматики — на 3—5-й день от начала лечения у пациентов, получавших фаготерапию [32].
Из ранних работ также следует отметить разработку и регистрацию в 1992 г. в Российской Федерации препарата бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный. В процессе клинических испытаний продемонстрирована его высокая эффективность при лечении не только атрофических форм озены (n=58), риносклеромы (n=38) и синусита (n=5), но и воспаления среднего уха (n=4). Во всех перечисленных случаях продемонстрирован положительный клинический эффект при отсутствии побочных реакций на применение препарата. При сравнительном изучении антибактериальной активности препарата бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный и 12 антибиотиков (ампициллина, стрептомицина, тетрациклина, хлорамфеникола, канамицина, олеандомицина, неомицина, гентамицина, эритромицина, линкомицина, полимиксина и мономицина) установлена панрезистентность к указанным антибиотикам клинических штаммов Klebsiella ozaenae и Klebsiella rhinoscleromatis, в то время как поливалентный фаговый препарат лизировал 94% штаммов K. ozaenae и 90% K. rhinoscleromatis. Помимо положительного клинического эффекта авторы отмечали отсутствие побочных реакций на применение препарата [33].
Важную роль в патогенезе ХГСО играет формирование биопленок. Е.В. Гаров и Е.Е. Гарова, В.Т. Пальчун и А.И. Крюков, А.Ю. Ивойлов указывают на одну из причин рецидивирования холестеатомного процесса в среднем ухе — формирование биопленок, стойких как к хирургическому, так и к консервативному антибактериальному лечению. Бактерии внутри биопленок способствуют дальнейшему поддержанию воспалительного процесса, запускают дифференцировку и пролиферацию эпителиальных клеток, что, в свою очередь, ведет к агрессивному быстрому росту холестеатомного матрикса, костной резорбции и обострению течения заболевания [34—36].
Известно, что синегнойная палочка является примером микроорганизмов, способных к формированию биопленок. По этой причине инфекции, вызванные P. aeruginosa, трудно поддаются эрадикации. Именно поэтому использование препаратов бактериофагов с целью лечения синегнойных инфекций представляет особый интерес.
A. Wright и соавт. в 2009 г. в рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом двухфазном клиническом исследовании показали статистически значимую клиническую эффективность фаготерапии при лечении пациентов с ХГСО, вызванным антибиотикорезистентными штаммами P. aeruginosa. В исследование включены 24 взрослых пациента. Основным критерием включения стала длительная, упорная оторея, рефрактерная к антибактериальной терапии, возникшая вследствие различных состояний, включая перенесенные операции на сосцевидном отростке в анамнезе, хроническую перфорацию барабанной перепонки и затяжной наружный отит. У большинства пациентов заболевание протекало в форме длительно текущего одностороннего ХГСО. Каждому пациенту выполнено микробиологическое исследование патологического отделяемого из уха, выделены антибиотикорезистентные штаммы P. aeruginosa. Пациенты основной группы получали бактериофаг, пациенты контрольной группы — плацебо. Курс лечения составил 2 нед. В результате исследования у пациентов, получавших фаготерапию, отмечено значительное клиническое улучшение по сравнению с исходным уровнем. У пациентов группы плацебо улучшения не было. Количество случаев элиминации P. aeruginosa значительно выше в группе, в которой лечение проводили фаговыми препаратами. За время исследования не было побочных эффектов фаготерапии как местного, так и системного характера [37].
В педиатрической практике гнойный средний отит также является одним из наиболее частых инфекционных заболеваний с показанием к назначению системной антибиотикотерапии, которая, как известно, имеет ряд побочных эффектов. Препараты местного действия в таких случаях были бы предпочтительны, однако при неперфоративной форме гнойного среднего отита барабанная перепонка является механическим барьером для них. A. Kurabi и соавт. выдвинута гипотеза, что барабанная перепонка может иметь врожденные биологические механизмы, которые способствуют транстимпанальному транспорту [38]. Путем скрининга и отбора (метод биопэннинга) библиотеки бактериофагов, генетически созданных для экспрессии необходимых пептидов на своей поверхности, исследователи обнаружили уникальные пептиды, которые активно транспортируются частицами фага через интактную барабанную перепонку в полость среднего уха. Инкубация раствора пяти бактериофагов, несущих пептид, на барабанной перепонке в течение 4 ч и более приводила к транспорту пептида через барабанную перепонку. Доказать наличие транспорта вещества через неповрежденную барабанную перепонку удалось благодаря забору содержимого полости среднего уха после инкубации с последующим применением метода амплификации. Бактериофаг с пептидом, меченным ДНК-меткой, наносили на барабанную перепонку. Затем слуховой проход тщательно промывали фосфат-буферным раствором. После этого вскрывали полость среднего уха, собирали содержимое, которое подвергали количественной ПЦР с использованием праймеров, специфичных для ДНК-метки. Скорость миграции пептида увеличивалась по экспоненте с течением времени. При транстимпанальном введении 109 частиц четырех различных фагов непосредственно в полость среднего уха никаких морфологических изменений в барабанной перепонке или полости среднего уха не было в сравнении с группами, в которых вводили дикий тип бактериофагов или физиологический раствор. Титрование перилимфы после использования бактериофага при интактной барабанной перепонке показало наличие нескольких копий фагов во внутреннем ухе. На основании полученных результатов авторы утверждают, что транстимпанальные пептиды безопасны и могут использоваться в качестве потенциальных агентов для неинвазивной доставки лекарств в полости среднего и внутреннего уха [39].
С момента открытия бактериофагов прошло уже более 100 лет. Исследования этих вирусов, а также препаратов на их основе претерпевали разные этапы развития: от тотального игнорирования до вспышки интереса, которая произошла в последние годы. Из локальных исследований в отдельных странах (преимущественно в Российской Федерации и странах Восточной Европы) исследования трансформировались в многоцентровые крупные работы в институтах и клиниках всего мира. В настоящее время колоссальное количество работ направлено не только на поиск эффективных бактериофагов против антибиотикорезистентных бактерий, но и на выделение их ферментов (лизинов), экспрессию транспортных белков, генетические модификации, которые приводят к восстановлению чувствительности бактерий к антимикробным препаратам. Фаготерапия в оториноларингологии эффективно применяется в России с 90-х годов прошлого века, и интерес к этой группе препаратов со стороны оториноларингологов в других странах способствовал успехам в борьбе с гнойно-воспалительными заболеваниями уха, горла и носа. Однако, несмотря на большое количество исследований в условиях in vitro, доказательных клинических исследований фаготерапии в оториноларингологической практике до настоящего времени не так много.
Терапия на основе бактериофагов и их производных может стать одним из универсальных подходов к лечению бактериальных инфекций в ближайшем будущем при правильной организации и наращивании масштаба клинических исследований в этом направлении.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.