Введение
Экссудативный средний отит (ЭСО) — полиэтиологическое заболевание среднего уха, для которого характерно скопление экссудата в барабанной полости, ограничение подвижности барабанной перепонки, снижение слуха при отсутствии болевого синдрома и сохраненной барабанной перепонке [1, 2]. Распространенность ЭСО в популяции колеблется от 1% до 5% в разных возрастных группах [1]. Длительное время считали, что ЭСО чаще встречается у детей, однако в последние годы установлено, что у 15—17% взрослых пациентов воспалительные заболевания уха сопровождаются экссудативным средним отитом [3, 4], при этом отмечена стойкая тенденция к росту заболеваемости [3]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), число больных с ЭСО в мире в 2016 г. составило около 32 млн человек, а в 2019—2020 гг. увеличилось в 2 раза. По прогнозам ВОЗ, к 2030 г. число лиц с социально значимым дефектом слуха, в том числе в результате ЭСО, может вырасти более чем на 30%. Социальная значимость заболевания определяется снижением качества жизни, производительности труда, финансовыми затратами на лечение.
Рост заболеваемости ЭСО обусловлен многочисленными факторами: ухудшением экологической обстановки, неадекватной терапией воспалительных процессов, бесконтрольным применением антимикробных препаратов, нарушением местного иммунитета. Заболеваемость ЭСО характеризуется сезонностью: увеличение числа заболевших отмечается в холодное время года [3]. Причинами ЭСО являются хроническая патология полости носа (полипозный риносинусит, гипертрофический ринит и др.) и глоточного устья слуховой трубы, новообразования носоглотки и основания черепа, которые ведут к обструкции слуховой трубы. Экссудативный отит тесно связан с инфекцией верхних дыхательных путей [3, 5]. Именно врожденный иммунитет является первой линией защиты организма от патогенов.
Эпителиальные клетки слизистой оболочки верхних дыхательных путей экспрессируют паттерн-распознающие рецепторы (PRR), которые распознают консервативные образы, или паттерны, патогенности, характерные для групп патогенов, в том числе микробов, вирусов и грибов, известные как патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular pattern — PAMPs) или молекулы, образующиеся при повреждении собственных клеток (damage-associated molecular pattern — DAMPs) [6].
Наиболее изученная группа PRR — это Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors — TLRs), которые являются трансмембранными белками типа I. Связывание TLRs лигандом экзогенного или эндогенного происхождения инициирует врожденный иммунный ответ и развитие воспаления за счет экспрессии прововоспалительных и противовоспалительных цитокинов, интерферонов, а также противомикробных пептидов [7, 8]. Активация TLR4 DAMPs индуцирует экспрессию генов воспалительных медиаторов, а неполноценный иммунный ответ структур системы врожденного иммунитета слизистой оболочки на инфекционные и другие триггеры приводит к их неполной элиминации, поддерживает хроническое воспаление, способствует ремоделированию тканей и образованию фиброза.
Несомненно, развитие врожденного иммунного ответа влияет на патогенез и течение воспаления в среднем ухе, поэтому исследование уровня его маркеров в экссудате барабанной полости пациентов с рецидивирующим ЭСО может оказаться перспективным в диагностике и выборе адекватного лечения.
Цель исследования — оценить уровень маркеров врожденного иммунитета в экссудате барабанной полости у пациентов с ЭСО.
Материал и методы
Исследование выполнено на базе ГБУЗ «НИКИО им. Л.И. Свержевского» ДЗМ и на кафедре иммунологии ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Обследованы 16 пациентов с рецидивирующим ЭСО.
У 7 пациентов заболевание протекало на фоне хорошей проходимости слуховой трубы (1-я группа), а у 9 пациентов выявлена ее дисфункция (2-я группа).
Использованы следующие методы исследования:
— отоларингологическое исследование (риноскопия, отоскопия, ларингоскопия);
— тональная пороговая аудиометрия (ТПА) (аудиометр диагностический МА-31 (MAICO Diagnostic GmbH, Германия);
— эндоскопическое отоларингологическое обследование (эндоскоп жесткий Hopkins II (KARL STORZ SE & Co., Германия);
— цитологическое исследование экссудата (исследование проводилось в лаборатории МКНЦ им. А.С. Логинова);
— высокоразрешающая компьютерная томография (КТ) височных костей;
— бактериологическое исследование (проведено в лаборатории ГБУЗ «МНПЦДК ДЗМ»);
— иммунологическое исследование (проведено на базе кафедры иммунологии ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова»);
— аллергологическое обследование.
Тотальную РНК выделяли из клеток экссудата среднего уха с помощью набора для выделения РНК из клинического материала Рибо-СОРБ (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия) согласно прилагаемой инструкции. Далее с помощью набора реагентов ОТ-1 для обратной транскрипции (ООО «НПФ Синтол», Россия) выделенную РНК использовали для получения комплементарной ДНК (кДНК) согласно инструкции производителя. Полученную кДНК использовали для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) для оценки экспрессии генов врожденного иммунитета ILB1, TGFB, HBD1, HBD2 с набором для ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR GREEN I (ООО «НПФ Синтол», Россия). Дизайн праймеров для ПЦР проводили с помощью программного обеспечения Vector NTI Designer (таблица). Все праймеры произведены ООО «НПФ Синтол» (Россия). Экспрессию генов рассчитывали относительно экспрессии гена домашнего хозяйства — β-актина по методу DDCt.
Состав реактивной смеси
| № | Наименование | Объем, мкл |
| 1 | dNTP, 2,5 mM | 2,5 |
| 2 | 10×ПЦР буфер Б | 2,5 |
| 3 | MgCl2, 25 mM | 2,5 |
| 4 | Смесь праймеров, 10 пкмоль/мкл каждого | 1,0 |
| 5 | SynTaq ДНК-полимераза, 5Е/мкл | 0,5 |
| 6 | ddH2O | 11 |
| 7 | Образец ДНК | 4 |
Результаты и обсуждение
На первом этапе нами исследован уровень экспрессии гена распознающего рецептора TLR4. Основная функция данного рецептора состоит в распознавании липополисахарида грамотрицательных бактерий — эндогенных молекул, высвобождаемых поврежденными тканями и некротизированными клетками и обеспечивающих активацию провоспалительной реакции в ответ как на инфекционные, так и на неинфекционные стимулы. Нами показано отсутствие статистически значимых различий экспрессии гена TLR4 клетками экссудата барабанной полости у пациентов с проходимой и непроходимой слуховой трубой (рис. 1). Известно, что взаимодействие различных лигандов с TLR4 приводит к запуску MyD88-зависимого пути и миграции в ядро транскрипционного фактора NF-ϰB. Активация данного фактора обеспечивает выработку различных медиаторов. В связи с этим представляется целесообразной оценка уровня экспрессии генов воспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительного цитокина трансформирующего фактора роста β (TGF-β) (рис. 2).
Рис. 1. Уровень экспрессии TLR4 у пациентов исследуемых групп.
Рис. 2. Уровень экспрессии IL1B у пациентов исследуемых групп.
Интерлейкин-1β (IL-1β) — мощный провоспалительный цитокин, который играет важную роль в развитии ответа организма на инфекцию и повреждение. Он вырабатывается и секретируется различными типами клеток иммунной системы (моноцитами и макрофагами) и неиммунными клетками при их активации (эпителиоцитами). По механизму положительной обратной связи IL-1β способен индуцировать собственную экспрессию, тем самым усиливая воспалительный процесс [9—11].
Установлено, что у пациентов с непроходимостью слуховой трубы уровень экспрессии гена воспалительного цитокина IL-1β в 11,4 раза выше, чем у пациентов с отсутствием данной дисфункции (p=0,00159).
В случае непроходимости слуховой трубы в ней создается пониженное давление, происходит нарушение венозного оттока и образуется локальная гипоксия. По данным литературы, венозный стаз и нарушение газообмена способны усиливать секрецию IL-1β [9]. Секреция биологически активного IL-1β осуществляется в результате двух сигналов: первый сигнал индуцирует продукцию неактивного предшественника, про-IL-1β, за счет активации TLRs-зависимых клеточных путей; второй сигнал служит для запуска каспазы-1, что приводит к формированию зрелой биологической формы IL-1β. Каспаза-1 активируется за счет образования мультимерного цитозольного белкового комплекса — инфламмасомы в ответ на стимуляцию экзогенными или эндогенными сигналами опасности. Таким образом, высокий уровень экспрессии гена IL1B, который наблюдается у пациентов с дисфункцией слуховой трубы, может быть следствием тяжелого тканевого стресса и разрушения клеток.
Помимо экспрессии гена IL1B нами оценен уровень экспрессии гена TGFB (рис. 3). Ряд исследователей показали положительную роль TGF-β, плейотропного цитокина с мощной регуляторной активностью, в воспалительных реакциях [12, 13]. Так, избыточная продукция TGF-β приводит к активации моноцитов и макрофагов, которые в присутствии IL-4 могут сливаться и образовывать гигантские многоядерные клетки в очаге воспаления, а в присутствии IL-10 обеспечивать повышенную секрецию IgA, способствуя таким образом развитию хронических воспалительных процессов в среднем ухе, как клеточно-опосредованных, так и гуморальных.
Рис. 3. Уровень экспрессии TGFB у пациентов исследуемых групп.
TGF-β играет важную роль в подавлении воспаления, однако некоторые исследования показали неоднозначную роль TGF-β в воспалительных реакциях [12, 13]. Так, TGF-β регулирует развитие и функции клеток врожденного иммунитета. Показано, что TGF-β необходим для развития толерогенных дендритных клеток путем индукции индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), что приводит к синтезу кинуренина и формированию иммуносупрессивного микроокружения [14]. TGF-β также ингибирует выработку индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) [15] и MyD88-зависимые сигнальные пути TLR в макрофагах, что в конечном итоге обусловливает противовоспалительный эффект [9].
В данном исследовании показано усиление экспрессии гена TGFB в 14 раз, что согласуется с исследованием M. Cooter и соавт., в котором выявлено повышение уровня TGF-β методом ELISA на всех стадиях заболевания Однако следует отметить, что роль TGF-β в развитии среднего отита неоднозначна [16]. На животных моделях показано, что экспрессия TGF-β повышена при остром среднем отите, вызванном Streptococcus pneumoniae [17] и Haemophilus influenzae [18]. Активация Smad-зависимого сигналинга с помощью TGF-β снижает экспрессию муцинов, избыточное количество которых приводит к образованию густого слизистого выпота и нарушению функции среднего уха [19].
Заключительным этапом работы было определение уровня экспрессии генов HBD1 и HBD2 противомикробных пептидов.
Дефензины являются членами семейства антимикробных пептидов (AMP). Эти белки играют решающую роль в неферментативном ингибировании бактерий, грибков, простейших и вирусов, в том числе в слизистых оболочках, обеспечивая их защиту. Дефензины способны стимулировать провоспалительную активность за счет стимуляции продукции клетками врожденного иммунитета цитокинов и хемокинов [20—22].
Показано, что уровень экспрессии генов HBD1 и HBD2 выше в 11 раз и 17 раз соответственно у пациентов с непроходимостью слуховой трубы (p=0,00369 и p=0,0006 соответственно) (рис. 4, 5). При этом следует отметить, что происходит гиперэкспрессия гена HBD1, который в физиологических условиях вырабатывается конститутивно, однако в условиях воспаления и гипоксии его выработка повышается [23].
Рис. 4. Уровень экспрессии HBD1 у пациентов исследуемых групп.
Рис. 5. Уровень экспрессии HBD2 у пациентов исследуемых групп.
Усиление индуцибельной экспрессии гена HBD2 может быть связано с гиперэкспрессией IL1B (которая выявлена в данной работе) и, следовательно, с усилением воспалительной реакции. Схожие данные получены S.K. Moon и соавт. (2002). Авторы установили, что провоспалительный цитокин IL-1α повышает транскрипцию гена HBD2 посредством активации Src-зависимого сигнального пути Raf-MEK1/2-ERK в эпителиальной клеточной линии среднего уха человека [24]. Повышенная экспрессия HBD2 (как на уровне мРНК, так и на уровне белка) продемонстрирована в клетках слизистой оболочки среднего уха у пациентов со средним отитом по сравнению с его экспрессией у пациентов группы сравнения [24].
Полученные нами результаты могут быть использованы для уточнения патогенеза среднего отита с дисфункцией слуховой трубы, разработки новых методов диагностики, профилактики и лечения этого заболевания.
Выводы
1. У пациентов с экссудативным средним отитом и непроходимостью слуховой трубы уровень экспрессии гена IL1B выше в 11,4 раза по сравнению с пациентами, у которых сохранена проходимость слуховой трубы.
2. Уровень экспрессии гена TGFB выше в 14 раз у пациентов с отсутствием дисфункции слуховой трубы по сравнению с пациентами с непроходимостью слуховой трубы.
3. Экспрессия генов HBD1 и HBD2 выше в 11 раз и 17 раз соответственно у пациентов со средним отитом и непроходимостью слуховой трубы по сравнению с данным показателем у пациентов с проходимой слуховой трубой.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.