В последнее время иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) является одной из наиболее частых этиологических причин возникновения артрита у жителей севера Сибири [1]. Ранее нами было показано, что ИКБ у некоторых больных вызывает увеличение количества клеток с нарушением структуры и числа хромосом [2]. Установлено, что при артритах и артрозах в синовиоцитах и синовиальных фибробластах значимо повышено количество клеток с трисомией по хромосоме 7, с чем, возможно, связаны этиология и патогенез заболевания [3, 4]. Поскольку боррелии способны прямо или опосредовано индуцировать цитогенетические нарушения, то закономерно возникает предположение об их роли в риске развития и тяжести клинического течения артрита. Кроме того, установлена связь между риском развития хронического артрита и наличием у человека определенных аллелей гена GSTM1 фермента глутатион-S-трансферазы [5], играющего значимую роль в состоянии цитогенетической нестабильности [1].

Цель — исследовать частоту синовиальных клеток с цитогенетическими нарушениями, в особенности трисомией по хромосоме 7, до и после радонотерапии у жителей севера Сибири, имеющих в генотипе определенные аллели гена GSTM1 фермента глутатион-S-трансферазы и проходящих курс лечения по поводу хронического гоностеоартрита (ХГА), ассоциированного с ИКБ, по сравнению с соответствующими показателями у пациентов с посттравматическим гоностеоартритом (ПТГА).

Больных для исследования отбирали методом сплошной выборки среди лиц с ХГА, ассоциированным с ИКБ, и ПТГА, поступивших на бальнеологическое лечение в АО санаторий «Алтай» (Белокуриха, Алтайский край). В исследование вошли только те лица, которые соответствовали критериям включения и подписали добровольное информированное согласие.

Критериями включения пациентов в исследование были клинико-лабораторное и рентгенологическое подтверждение диагноза ХГА, ассоциированного с ИКБ или травмой, период ремиссии гоностеоартрита, отсутствие хронических вирусных гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции, тяжелых сопутствующих заболеваний и/или противопоказаний к радонотерапии (ишемическая болезнь сердца, нестабильная стенокардия, мерцательная аритмия, гипертиреоз, эпилепсия, острые воспалительные заболевания и обострение хронических патологий, сердечная недостаточность II степени, гнойные заболевания кожи, доброкачественные и злокачественные опухоли, лейкопения, туберкулез, индивидуальная непереносимость радоновой минеральной воды, беременность, лактация, профессиональная деятельность, связанная с ионизирующими излучениями).

Критериями исключения были отсутствие подписанного добровольного информированного согласия пациента на участие в исследовании, отказ больного от взятия материала из суставов для проведения цитогенетического исследования и/или образцов венозной крови для изучения полиморфизма гена GSTM1, а также отказ от курса радонотерапии.

Все лица, включенные в исследование, преимущественно были жителями севера Томской и Тюменской областей, поступившими на бальнеологическое лечение в АО санаторий «Алтай» (Белокуриха, Алтайский край). Клиническое обследование пациентов и взятие материала на исследование проводили на базе санатория. Цитогенетическое исследование, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), а также анализ результатов проводили на базе ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (Томск).

Отбор пациентов с ХГА, ассоциированным с ИКБ, и ПТГА для исследования проводили в период с 2011 по 2016 г. В течение периода пребывания в санатории каждому пациенту дважды проводили одномоментное клиническое обследование и взятие материала на исследование: до курса радонотерапии (первая контрольная точка) и сразу после его окончания (вторая контрольная точка) с интервалом 21 день. Каких-либо существенных смещений запланированных временных интервалов в ходе исследования зафиксировано не было.

Всем больным назначали общие ванны с использованием азотно-кремнистой термальной воды с содержанием радона в концентрации 0,19 кБк/л, температурой 36 °C, экспозицией 15 мин в течение 2 дней подряд и с перерывом на 3-й день. Всего на курс планировали 14 процедур. Эквивалентная доза α-излучения за курс составила 280 мкЗв. В качестве фоновой медикаментозной терапии все пациенты получали пероральные медленнодействующие симптоматические препараты хондроитина сульфата и глюкозамина. В качестве материала для цитогенетического исследования (хромосомный анализ) от каждого больного получали синовиальные клетки в результате пункции коленных суставов. Кроме того, до начала курса радонотерапии у каждого больного были взяты пробы венозной крови (10 мл) для определения носительства аллелей гена GSTM1 фермента глутатион-S-трансферазы методом ПЦР. Основными клиническими проявлениями у пациентов были боль и нарушение функции суставов. Клиническое обследование включало анкетирование с указанием жалоб пациента, длительности и интенсивности болевого синдрома, а также выраженности функциональных нарушений суставов.

В результате исследования оценивали частоту синовиальных клеток с различными типами хромосомных нарушений (с одиночными или двойными фрагментами хромосом, хроматидными и хромосомными обменами, моно- или трисомиями и полиплоидией) в зависимости от присутствия у пациента нормального (GSTM1 (+)) или мутантного нефункционирующего (GSTM1 (0/0)) аллелей гена GSTM1 фермента глутатион-S-трансферазы до и после курса радонотерапии.

Все лица, включенные в исследование, были разделены на две группы в зависимости от диагнозов ХГА, ассоциированного с ИКБ (основная группа), или ПТГА (группа сравнения). Диагнозы ХГА, ассоциированного с ИКБ, или ПТГА в периоде ремиссии были поставлены медицинскими учреждениями Томска, Томской и Тюменской областей по месту жительства. Диагноз ХГА, ассоциированного с ИКБ, был обоснован данными эпидемиологического анамнеза, клинической картины заболевания и подтвержден лабораторными исследованиями с помощью иммуноферментного анализа на присутствие специфических иммуноглобулинов классов M и G к боррелиям ИКБ. В анамнезе и в результате лабораторных обследований в группе пациентов с ПТГА не было зарегистрировано какой-либо связи с клещевыми и иными инфекциями, которые могли бы вызвать возникновение этого заболевания. Кроме того, каждая из этих групп была условно разделена на две подгруппы в зависимости от присутствия в генотипе пациента нормального (GSTM1(+)) или мутантного нефункционирующего (GSTM1(0/0)) аллелей гена фермента глутатион-S-трансферазы. В каждой из подгрупп больные были сопоставимы по возрасту и полу. Всех пациентов обследовали в динамике дважды: до и после курса радонотерапии.

Методы получения синовиальных клеток из коленных суставов для культивирования, приготовления и анализа препаратов хромосом для цитогенетического исследования не отличались от изложенных нами ранее [6]. Культивирование синовиальных клеток проводили по методу T. Zimmermann и соавт. [7] с некоторыми модификациями. Первоначально синовиальные клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium — DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки в течение 2 ч при температуре 37 °C в 5% CO₂. Затем суспензию клеток фильтровали и их собирали центрифугированием. Клетки выдерживали в первичной культуре в течение 7 дней (среда DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 25 мМ HEPES, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина). За 3 ч до приготовления препаратов во флаконы с культурами синовиальных клеток вводили колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Затем клетки подвергали гипотонической обработке 0,56% раствором хлорида калия и фиксировали в смеси ледяной уксусной кислоты и метанола (1:3). Дифференциальную окраску хромосом методом GTG-бэндинга выполняли в соответствии со стандартными протоколами [8]. Кариотипы были описаны в соответствии с Международной системой цитогенетической номенклатуры человека (International System for Human Cytogenetic Nomenclature — ISCN) пересмотра 1995 г. [9].

Для анализа аллелей гена GSTM1 использовали ПЦР с помощью амплификатора Терцик (Россия) [10]. Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для ПЦР проводили из проб венозной крови. Разделение продуктов амплификации и рестрикции ампликонов проводили в горизонтальном 3% агарозном геле с применением камеры для горизонтального электрофореза ЕС 12–13 («Биоком», Россия). Знак «+» означает присутствие ПЦР-продуктов и данный донор может быть либо гетерозиготен (GSTM1 (+/0)), либо гомозиготен (GSTM1 (+/+)) по нормальному активному аллелю. Мутантный генотип GSTM1 (0/0) означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента и данный индивидуум гомозиготен по делеции, что приводит к резкому снижению активности фермента.

Интенсивность болевого синдрома оценивали с помощью визуальной аналоговой шкалы (ВАШ), выраженность функциональных нарушений определяли по суммарному показателю индекса остеоартрита WOMAC (Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index) до и после курса радонотерапии [11].

Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 56 от 15.11.11) и проводилось в соответствии с распоряжением Высшей аттестационной комиссии «О порядке проведения биомедицинских исследований у человека» (2002 г.) и «Правилами клинической практики» (приказ Минздрава России № 266 от 19.06.03).

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: статистическую обработку осуществляли с использованием пакета программ Statistica v.10 («StatSoft Inc.», США). Частоту различных типов цитогенетических нарушений рассчитывали с помощью программы The EH Software Program («Rockefeller University», США). Для обработки количественных показателей применяли вариационный анализ (Analysis of Variance — ANOVA) и t-критерий Стьюдента для зависимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова–Смирнова не выявило отличий от нормального значения. Кроме того, использовали корреляционный анализ по методу Спирмена. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X — выборочное среднее арифметическое, m — ошибка среднего арифметического) считали достоверными при достигнутом уровне значимости менее 0,05.

В исследование были включены 69 больных (34 мужчины и 35 женщин, средний возраст — 49,4±5,8 года), у которых был диагностирован ХГА, ассоциированный с ИКБ, а также 52 человека (24 мужчины и 28 женщин, средний возраст — 52,2±7,3 года), составивших контрольную группу, у которых был диагностирован ПТГА. Результаты были получены на основании изучения носительства аллелей гена GSTM1 методом ПЦР, а также сравнения клинических данных и данных цитогенетического анализа до и после курса радонотерапии. Заболевание у всех пациентов с ХГА, ассоциированным с ИКБ, возникло в течение 1 года–4 лет после укуса клеща.

Полученные результаты свидетельствуют о существенных различиях в показателях частоты нескольких типов цитогенетических нарушений в клетках синовиальной жидкости у пациентов основной и контрольной групп (см. таблицу).

У всех обследованных пациентов было отмечено достоверное уменьшение болевого синдрома и улучшение локомоторной функции пораженных суставов. При этом несколько более выраженные изменения после лечения были отмечены у больных ХГА, ассоциированным с ИКБ, являющихся носителями аллеля GSTM1(0/0). Корреляционный анализ показал наличие значимой положительной связи между уменьшением в синовиальной жидкости клеток с трисомией по хромосоме 7 и тяжестью болевого синдрома по двум тестам: ВАШ (r=0,78; p<0,01 и r=0,56; p<0,05) и суммарному показателю индекса остеоартрита WOMAC (r=0,58; p<0,05). В остальных случаях корреляционный анализ цитогенетических изменений и показателей болевого синдрома не дал значимых результатов.

Нежелательных побочных явлений или осложнений после курса радонотерапии или взятия материала (синовиальные клетки) из коленных суставов установлено не было.

Результаты проведенного исследования, как и данные других ученых [3], показали наличие синовиальных клеток с трисомией по хромосоме 7 у больных ХГА, ассоциированным с ИКБ. Этот тип цитогенетических аберраций был зарегистрирован нами только при ХГА, ассоциированным с ИКБ, и не был обнаружен у больных ПТГА.

Существует мнение, что хронический период ИКБ сопровождается иммунокомплексным воспалением и инициацией аутоиммунных реакций с образованием аутоантител к ДНК, что может способствовать накоплению мутаций и нарушению правильного расхождения хромосом при делении синовиальных клеток [12]. Показано, что в начальный период боррелиозной инфекции иммуноциты начинают активно продуцировать реактивные формы кислорода (ROS) и азота (RNS) [13]. Установлено, что непропорционально высокая генерация этих высокореактивных соединений может повреждать клеточные макромолекулы, включая ДНК и ферменты [14]. Таким образом, цитогенетические эффекты ИКБ, по-видимому, связаны с окислительным стрессом, вызванным внедрением инфекционного агента в организм [13], в частности синовиальные клетки коленных суставов.

Исследования показывают, что некоторые гены на хромосоме 7 могут играть решающую роль в контроле роста и деления клеток. Без этих генов клетки могут делиться неконтролируемо слишком быстро [3, 4]. После курса радонотерапии количество клеток с трисомией по хромосоме 7 значимо сократилось. Снижение количества клеток с хромосомными аберрациями можно объяснить стимулирующим влиянием малых доз радиации при радонотерапии на процесс апоптоза, направленный на устранение цитогенетически аномальных клеток [1]. Известно, что белок, кодируемый геном GSTM1, является антиоксидантным ферментом, при этом нулевой (делетированный) аллель существенно снижает иммунную защиту организма при инфекциях [15, 16]. Зарегистрированное нами повышение количества двухударных хромосомных аберраций, по-видимому, связано с лучевым воздействием радона на хромосомные структуры синовиальных клеток. Такого рода хромосомные аномалии являются маркерами мутагенного действия радиации [1].

К факторам, которые могли бы отрицательным образом сказаться на проведении исследования и его результатах, можно отнести относительно небольшой объем выборки участников в подгруппах, а также зависимость частоты носительства мутантного варианта гена GSTM1 от этнической принадлежности (среди обследованных больных доминировали русские и украинцы). Все использованные в данном исследовании методики и инструменты соответствуют современному уровню развития науки и позволяют адекватно решать задачи, поставленные в данной работе.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии зависимости между генетическим полиморфизмом гена GSTM1 фермента глутатион-S-трансферазы и частотой цитогенетических нарушений в синовиальных клетках у больных ХГА, ассоциированным с ИКБ, что существенно отличается от соответствующих показателей у пациентов с ПТГА. Лечение вызывало значимое снижение количества синовиальных клеток с трисомиями по хромосоме 7, что коррелировало со снижением болевого синдрома у пациентов. Полученные нами результаты имеют большое значение для изучения патогенеза ХГА, ассоциированного с ИКБ, и помогут обосновать показания для радонотерапии при хроническом артрите различной этиологии.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке грантов РФФИ № 16−40−700149 и РГНФ № 06−15−10190.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования, статистическая обработка данных — Н.И.; анализ полученных данных, написание текста, редактирование — Е.И.; сбор и обработка материала — Е.У.

Сведения об авторах

Ильинских Николай Николаевич, д.б.н., профессор [Nikolay N. Ilyinskikh, PhD, Professor]; адрес: Россия, 634050, Томск, а/я 808 [address: 808 a/ya, 634050 Tomsk, Russia]; https://orcid.org/0000-0003-1014-1096; eLibrary SPIN: 1204-3138; e-mail: nauka-tomsk@yandex.ru

Ильинских Екатерина Николаевна, д.м.н., доцент [Ekaterina N. Ilyinskikh, MD, PhD, assistant]; https://orcid.org//0000-0001-7646-6905; eLibrary SPIN: 5245-5958; e-mail: infconf2009@mail.ru;

Ударцев Евгений Юрьевич, д.м.н. [Evgeniy Yu. Udartsev, MD, PhD]; https://orcid.org/0000-0001-9879-2971; eLibrary SPIN: 2519-9281; e-mail: udartsev.eyu1967@yandex.ru