Введение
Множественные нарушения обмена веществ, связанные с метаболическим синдромом, успешно компенсируются еще на этапе немедикаментозного лечебно-профилактического комплекса с применением диеты, двигательной активности и витаминно-минеральных средств [1]. Однако недостаточно изученными остаются изменения метаболизма костной ткани при метаболическом синдроме под влиянием природных факторов, что особенно актуально в разработке и обосновании рекомендаций по применению минеральных вод (МВ) различного состава для инициации коррекции остеопороза в условиях курорта «Кавказские Минеральные Воды». Снижение минеральной плотности костной ткани (МПКТ) и связанный с этим риск патологических переломов костей с одинаковой частотой проявляются у пожилых женщин и мужчин после 70 лет, являясь проявлением сенильной формы остеопороза. Вероятность развития этой патологии в более молодых возрастных группах возрастает на фоне нарушений метаболизма, при наличии инсулинорезистентности, особенно у лиц с сахарным диабетом 2-го типа, с преимущественным проявлением у мужчин, как было установлено на основании данных ретроспективного анализа диагностированного остеопороза у мужчин с переломом проксимального отдела бедра [2—4]. В диагностике остеопороза обязательным исследованием является определение показателей кальциево-фосфорного обмена [5], изучение МПКТ методом двухфазной денситометрии и определение биохимических маркеров резорбции кости, однако последнее до настоящего времени остается дорогостоящим и малодоступным исследованием. При этом денситометрическое определение МПКТ является золотым стандартом в диагностике остеопороза, которое при необходимости можно выполнять 1 раз в 6 мес [6]. В экспериментальных исследованиях остеопороза при моделировании нарушений метаболизма наряду с денситометрическим определением МПКТ наиболее значимую патофизиологическую характеристику микроцитоархитектоники костной ткани у животных получают при проведении компьютерной рентгенологической микротомографии (микро-КТ) [7].
Материал и методы
Цель исследования — изучить влияние внутреннего курсового приема модифицированных селеном минеральных вод различного состава на минеральную плотность костной ткани после длительного диет-индуцированного нарушения метаболизма в эксперименте.
Рандомизированное контролируемое исследование выполняли на беспородных белых крысах-самцах (n=111), содержащихся в стандартных условиях вивария Пятигорского научно-исследовательского института курортологии филиала Северо-Кавказского федерального научно-клинического центра ФМБА России в Пятигорске. Животные находились в эксперименте при соблюдении правил надлежащей лабораторной практики (приказ Минздрава России №199н от 01.04.16 «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики») и директив Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях от 22.09.10 [8]. Животных в возрасте 2,5 мес с массой 180-220 г методом блочной рандомизации распределили в клетках. С целью моделирования диет-индуцированных нарушений метаболизма животные на протяжении 180 дней получали гиперкалорийную диету с включением 10% раствора фруктозы и свиного сала из расчета 10 г на 200 г животного. После завершения диеты животным давали питьевые МВ: Ессентуки-4 (МВ1), Славяновскую (МВ2) в нативном виде и обогащенные селеном (МВ1Se и МВ2Se). МВ вводили через зонд по 1,2 мл на 100 г веса животного, для обогащения МВ селеном использовали диметилпирозолилселинид в дозировке 0,5 мкг на 100 г веса животного. Курс поения составлял 21 день, после последнего дня поения на 22-й день животных выводили из эксперимента. С применением принципов рандомизации было сформировано 3 контрольные группы (КГ) и 4 основные группы (ОГ). В КГ1 14 животных получали лабораторный корм и питьевую воду; в КГ2 14 животных, у которых моделировали диет-индуцированные нарушения метаболизма, выводили из эксперимента на следующий день после прекращения гиперкалорийной диеты (180 дней); в КГ3 14 животных с диет-индуцированными нарушениями метаболизма после отмены гиперкалорийной диеты через 180 дней получали стандартный рацион (лабораторный корм и питьевую воду) в течение 30 дней. В опытных группах (ОГ) у животных аналогично КГ3 моделировали диет-индуцированные нарушения метаболизма, после отмены диеты они получали стандартный рацион и поение МВ: в ОГ1 18 животных получали МВ1 (Ессентуки-4); в ОГ2 19 животных — курс МВ1Se (Ессентуки-4, обогащенная селеном); в ОГ3 из 14 животных — курс МВ2 (Славяновская); в ОГ4 18 животных — курс МВ2Se (Славяновская, обогащенная селеном). Контроль веса (масса тела) животных проводился ежемесячно.
Диагностические методики. После завершения курсового поения животных опытных групп, одновременно с контрольными группами, выводили из эксперимента под легким эфирным наркозом путем декапитации. Забор крови проводили для получения сыворотки с последующим определением содержания общего кальция (Ca), глюкозы, общего холестерина (ОХ), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), триглицеридов (ТГ), креатинина с применением наборов реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» и ООО «Компания Алкор Био» (Россия) на полуавтоматическом биохимическом анализаторе ChemWell (Software Version 6.3, США). Рассчитывали коэффициент атерогенности (КА) по формуле: КА=ОХ–ЛПВП/ЛПВП. В сыворотке крови крыс определяли содержание глюкагона методом иммуноферментного анализа на спектрофотометре StatFax (США) с использованием реактивов Cloud-Clon Corporation (Китай—США).
Денситометрия. У 6 особей из каждой группы после выведения из эксперимента определяли состав компонентов тела методом рентгеновской денситометрии на установке Hologic Discovery W (США) с автоматическим расчетом площади поверхности тела (Scm2, Scm2), оценкой общей массы (total mass, g, г), безжировой массы (leanBMC, g), показателя минеральной плотности костной ткани (BMD, g/cm2, МПКТ, г/см2), абсолютного и относительного содержания жира (Fat mass (гр.), Fat (%).
Компьютерная микротомография. После проведения денситометрии более детально исследовали трабекулярную архитектонику костной ткани и ее минеральную плотность у одного животного из каждой группы наблюдения. Животных вскрывали, выделяли бедренные кости и поясничный отдел позвоночника, очищали их от мягких тканей. Костные препараты помещали в 10% забуференный раствор формалина. Последовательное сканирование костей — дистальных метафизов бедренных костей и тел V—VI поясничных позвонков проводилось на микротомографе SkyScan1176 (Бельгия) в соответствии с рекомендациями Bruker-microCT (Бельгия). Оценивали минеральную плотность губчатой кости BMD, mg/cm3 (МПКТ, мг/см3) и относительное содержание трабекулярной части кости — BV/TV (%), где BV — объем кости и TV — общий объем ткани; Tb.Th — толщина трабекул µm (мкм); Tb.Sp — разделение трабекул mm (мкм); Tb.N — число трабекул на 1 mm (мм); Tb.Pf — коэффициент трабекулярности на 1 mm (мм); SMI — структурный модельный индекс, аналогично общепринятой методике изучения МПКТ у лабораторных животных [9].
Статистическая обработка данных проводилась с использованием непараметрических методов оценки для множественных групповых сравнений по критерию Неймана—Кейлса и многофакторного дисперсионного анализа. Статистически значимых связей между количественными показателями оценивали по критерию ранговой корреляции Спирмена. Показатели представлены средними (M±m) и медианами (Me) и квартилями (Q25; Q75). Различия считали достоверными при минимальном уровне значимости p<0,05.
Результаты
За время нахождения животных на гиперкалорийной диете масса их увеличилась на 235±25 г (КГ2, КГ3 и ОГ1-ОГ4), а в КГ1 (без гиперкалорийной диеты) — на 215±20 г. Наиболее интенсивный прирост массы отмечался с 30-го по 120-й дни гиперкалорийной диеты, затем темп набора массы тела у животных снизился, и достиг максимального значения к 180-му дню диеты. При завершении эксперимента только животные КГ1 отличались по массе тела от остальных групп (табл. 1, F=5,9; p=0,00003). В результате масса тела животных с диет-индуцированными нарушениями метаболизма (КГ2, КГ3, ОГ1-ОГ4) за 180 дней эксперимента увеличилась в 2—2,3 раза.
Для исследования компонентов тела методом денситометрии было выбрано по 6 животных из каждой группы, таким образом, чтобы группы с диет-индуцированными нарушениями метаболизма по массе тела были сопоставимы по Total mass, g, однако их отличие от КГ1 повлияло на результат (рис. 1, а, F=2,12; p=0,07). Определены массы жировой и безжировой компонентов тела с установлением наибольшего различия по данным показателям между группами КГ1 и КГ2 (рис. 1, в—г).
Наименьшие значения безжировой массы были в КГ2, а в КГ1 — оказалось промежуточным по отношению к КГ2 и КГ3. В опытных группах безжировая масса не отличалась от КГ1 и КГ3, и находилась в диапазоне значений 300±18 г. Содержание жировой компоненты преобладало в КГ2 как по сравнению с КГ1, КГ3, так по сравнению с ОГ1-ОГ4 (рис. 1, г, F=6,31; p=0,0001). Сравнение МПКТ не выявило межгрупповых различий (рис. 1, б, F=1,37; p=0,24), однако при использовании posthog — сравнительного анализа по медианному тесту установлено, что значение МПКТ в КГ1 и КГ2 меньше, чем в ОГ2 и ОГ3 (p=0,001).
Анализ биохимических показателей углеводного, жирового, белкового и кальциевого обменов выявил характерные для нарушений метаболизма изменения у животных КГ2 и КГ3 (табл. 1).
Таблица 1. Биохимические показатели сыворотки крови животных после курсов внутреннего приема нативных и модифицированных селеном минеральных вод
| Показатель | КГ1, Me [LQ; HQ] | КГ2, Me [LQ; HQ] | КГ3, Me [LQ; HQ] | ОГ1, Me [LQ; HQ] | ОГ2, Me [LQ; HQ] | ОГ3, Me [LQ; HQ] | ОГ4, Me [LQ; HQ] |
| Масса тела животных, г | 340 [320; 360] | 400* [365; 440] | 415** [380; 430] | 390* [355; 425] | 380* [360; 390] | 400** [380; 430] | 370 [330; 395] |
| Глюкоза, ммоль/л | 5,5 [5,4; 5,8] | 6,5** [6,0; 6,6] | 6 [5,2; 6,6] | 4,7@^ [3,9; 5,4] | 4,7@^ [3,7; 5,4] | 5,0@^ [4,8; 5,5] | 5,05@ [4,2; 5,7] |
| ТГ, ммоль/л | 0,86 [0,78; 0,91] | 1,08* [1,06; 1,1] | 1,17* [1,1; 1,3] | 0,9@ [0,83; 0,94] | 0,83@ [0,75; 0,94] | 0,83@ [0,8; 0,86] | 0,88@ [0,79; 1,0] |
| ОХ, ммоль/л | 1,62 [1,4; 1,8] | 3,7** [3,8; 4,2] | 3,9** [3,7; 4,3] | 2,8*@^ [2,5; 3,1] | 3,0*@^ [2,7; 3,2] | 2,0*@^ [1,6; 3,0] | 2,7*@^ [2,3; 3,1] |
| ЛПВП, ммоль/л | 1,1 [0,98; 1,19] | 1,3* [1,21; 1,35] | 2,0**# [1,8; 2,04] | 1,75* [1,33; 1,9] | 1,53@ [0,99; 1,79] | 1,14@ [0,93; 1,18] | 1,17@ [1,13; 1,3] |
| ЛПНП, ммоль/л | 1,02 [0,89; 1,19] | 2,55** [2,3; 2,8] | 2,6** [2,18; 3,21] | 2,28* [1,9; 2,5] | 2,29* [2,0; 2,53] | 1,26@ [1,23; 2,03] | 2,02 [1,4; 2,3] |
| КА, усл. ед. | 0,5 [0,27; 0,7] | 2,05** [1,6; 2,3] | 1,05* [0,8; 1,2] | 0,56@ [0,4; 0,86] | 1,1* [0,73; 1,56] | 0,79@ [0,7; 1,17] | 0,9@ [0,6; 1,4] |
| Креатинин, мкмоль/л | 77,9 [77; 79,2] | 93,5* [90,7; 94,2] | 90,4* [88,5; 92,2] | 70,6@^ [64,5; 77,9] | 68,7@^ [64,5; 78,1] | 70,4@^ [65,5; 80,0] | 69,9@^ [68,2; 77,3] |
| Ca, ммоль/л | 3,1 [3,0; 3,2] | 3,2 [3,0; 3,4] | 2,5 [2,2; 3,3] | 2,1@^ [2,0; 2,2] | 2,2@^ [2,0; 2,3] | 2,4@^ [2,33; 2,5] | 2,4@^ [2,3; 2,6] |
Примечание. ТГ — триглицериды; ОХ — общий холестерин; ЛПВП — липопротеиды высокой плотности; ЛПНП — липопротеиды низкой плотности; КА — коэффициент атерогенности; Ca — кальций; * — достоверность различий p<0,05; ** — p<0,01.
Уровень глюкозы натощак у крыс КГ1 соответствовал верхней границе референсных значений, что может быть связано с возрастом животных, соответствующего позднему онтогенезу. Гиперкалорийная диета привела к повышению уровня глюкозы на 10—15% в КГ2 по сравнению с КГ1 (p=0,01). Под влиянием лечебных курсов МВ в ОГ1-ОГ4, уровень глюкозы крови соответствовал средним значениям видовой нормы. Показатели липидного обмена в КГ2 и КГ3 превышали значения животных КГ1: содержание ОХ и ЛПНП — на 37—49%, ТГ — на 20—30% и ЛПВП — на 10—15%, при этом расчетный индекс КА был выше в 4 раза в КГ2 и в 1,5—2 раза в КГ3 по сравнению с данными в КГ1. В опытных группах уровень ОХ в сыворотке был ниже, чем в КГ2 и КГ3, и не превышал значения в КГ1. Кроме того, отношение липидов высокой плотности к ОХ было таковым, что расчетный индекс КА в ОГ1, ОГ3, ОГ4 соответствовал верхней границе значений в КГ1. Уровень креатинина в сыворотке крови животных в КГ2 и КГ3 превышал значения КГ1. Общее содержание Ca в крови достоверно различалось между группами (F=17,7; p=0,00000). Так, у животных КГ1 и КГ2 наблюдалась умеренная гиперкальциемия, а в группе КГ3 только у 50% животных уровень кальция превышал значения нормы (выше 2,5 ммоль/л). У животных ОГ1 и ОГ2 уровень Ca соответствовал нижнему, а в ОГ3 и ОГ4 — среднему или верхнему диапазону референсных значений, при этом уровень кальция в этих группах не отличался от значений КГ1.
Как известно, повышение глюкозы натощак при нарушениях метаболизма связано не только с инсулинорезистентностью, но и с повышением глюкагона, который также остается высоким даже при наличии гипергликемии и является одним из критериев нарушения толерантности тканей к глюкозе и развития сахарного диабета 2-го типа [2, 9, 10]. Выявлены межгрупповые различия по уровню глюкагона в сыворотке крови животных (рис. 1, F=3,14; p=0,008).
Рис. 1. Масса и компоненты тела крыс по данным денситометрии.
Корреляционный анализ биохимических взаимодействий выявил прямую связь между уровнем глюкагона и глюкозой в сыворотке крови (r=+0,87; p=0,001) у животных КГ2, в остальных группах подобной связи не наблюдалось. У животных КГ3 выявлено наличие прямой статистически значимой связи между содержанием глюкозы и Ca (r=+0,75; p=0,01). Следовательно, выявленные корреляционные связи у животных КГ2 и КГ3 подтверждают наличие взаимодействия в регуляции углеводного и кальциевого гомеостаза.
Рис. 2. Уровень глюкагона в крови животных.
Полученные результаты характеризуют нарушение профиля метаболизма по данным биохимических показателей крови и денситометрии у животных КГ2 и КГ3, который корригируется курсами приема МВ у животных ОГ1-ОГ4.
Для углубленного исследования цитоархитектоники костной ткани с помощью микро-КТ из групп выбирали животных, учитывая их схожесть по относительному содержанию жировой компоненты по данным денситометрии, которая не превышала 25% от общей массы животного, а МПКТ не выходила за диапазон значений 25-й до 75-й квартили для каждой группы. Полученная методом микро-КТ оценка МПКТ (мг/см3) в области метафиза бедренной кости и 5—6-го тел поясничных позвонков показала, что у животного из КГ3 данные показатели были выше на 20%, а из КГ2 — на 12% ниже, чем из КГ1 (табл. 2). При этом средняя занимаемая площадь трабекулярной ткани по двум бедренным костям (F(BV/TV, %) у крысы из КГ3 на 30% выше, а по занимаемой площади трабекулярной ткани тел поясничных позвонков (L5—6 (BV/TV, %) ниже на 25%, чем у животного из КГ1. У животного из КГ2 показатели (F(BV/TV, %) на 20% и (L5—6 (BV/TV, %) на 12% ниже, чем у особи из КГ1. Остальные количественные характеристики губчатой кости тел позвонков L5—6 показали более структурированное состояние губчатой кости у животного из КГ1 по сравнению с животными из КГ2 и КГ3. Также показатели средней толщины трабекул позвонков и бедер (Tb.Th,µm) крысы из КГ1 были выше, чем из КГ2 и КГ3. Трабекулярные характеристики бедренных костей по коэффициенту трабекулярности (F(Tb.Pf(1/mm) и индексу структурности (F(SMI) распределили животных по структуре трабекул с лучшими показателями из КГ3 и худшими из КГ2. Среди животных опытных групп с характерными признаками остеопороза были особи из ОГ1, так как МПКТ и структурные параметры губчатой костной ткани метафиза бедер у них практически совпадали с таковыми параметрами животного из КГ2, а МПКТ тел позвонков поясничных позвонков была даже ниже. С наилучшими характеристиками губчатой костной ткани метафиза бедер и тел позвонков была особь из группы ОГ2. Животные из ОГ3 и ОГ4 практически не отличались друг от друга и были сопоставимы по характеристике костной ткани с животными из КГ1 и КГ3.
Таблица 2. Минеральная плотность с количественными параметрами трабекулярной части метафиза бедра и тел поясничных позвонков
| Параметр | Представители из групп, животные | ||||||
| КГ1 (1) | КГ2 (1) | КГ3 (1) | ОГ1 (1) | ОГ2 (1) | ОГ3 (1) | ОГ4(1) | |
| Метафиз бедренной кости: | |||||||
| BMD, mg/cm3 | 301,5 | 266 | 362,5 | 274 | 469 | 356,5 | 369,5 |
| BV/TV, % | 22 | 18 | 29 | 17,9 | 41,9 | 28,7 | 30 |
| Tb.Th (µm) | 138 | 114,5 | 125,5 | 108,5 | 152 | 124 | 133 |
| Tb.Sp (mm) | 0,73 | 0,42 | 0,7 | 0,94 | 0,44 | 0,57 | 0,65 |
| Tb.N (1/mm) | 1,77 | 1,58 | 2,31 | 1,65 | 2,76 | 2,32 | 2,27 |
| Tb.Pf (1/mm) | 6,0 | 7,86 | 4,26 | 8,26 | –0,37 | 4,57 | 3,69 |
| SMI | 1,21 | 1,45 | 0,9 | 1,4 | –0,12 | 0,94 | 0,8 |
| Тело 5—6 поясничных позвонков: | |||||||
| BMD, mg/cm3 | 513 | 460 | 527 | 399 | 593 | 460 | 453,2 |
| BV/TV, % | 45,7 | 39,1 | 38,7 | 32,2 | 54,9 | 40,2 | 39,6 |
| Tb.Th (µm) | 119,3 | 109,9 | 104,3 | 101,9 | 140,2 | 112,5 | 116,2 |
| Tb.Sp (mm) | 0,2 | 0,19 | 0,19 | 0,25 | 0,19 | 0,21 | 0,21 |
| Tb.N (1/mm) | 3,83 | 3,56 | 3,71 | 3,16 | 3,92 | 3,58 | 3,41 |
| Tb.Pf (1/mm) | –0,35 | 3,6 | 2,25 | 3,94 | –3,05 | 2,19 | 2,3 |
| SMI | –0,08 | 0,7 | 0,43 | 0,73 | –0,87 | 0,45 | 0,48 |
Примечание. BMD, mg/cm3 — минеральная плотность губчатой кости (МПКТ, мг/см3); BV/TV (%), — относительное содержание трабекулярной части кости; Tb.Th — средняя толщина трабекул (мкм); Tb.Sp — среднее распределение трабекул (мм); Tb.N — пространственная плотность трабекул, определяется число трабекул на 1 мм; Tb.Pf — коэффициент трабекулярности на 1 мм; SMI — структурный модельный индекс.
Обсуждение
Основанием для исследования влияния курсового действия питьевых МВ на минерализацию костной ткани при экспериментальном диет-индуцированном нарушении метаболизма послужил известный феномен лечебно-профилактического действия природных МВ [11], в том числе используемых для восстановления толерантности тканей к глюкозе и нормализации базальной секреции инсулина при метаболическом синдроме и сахарном диабете 2-го типа [11—13]. Помимо нативных природных МВ в исследование были включены обогащенные селеном МВ. Применение селена в качестве добавки для МВ связано с его мультитаргентным действием, в том числе участием в регуляции белоксинтезирующей функции клеток, что особенно важно для восстановления метаболизма, сохранения органического матрикса костей [14—17].
Анализ результатов показал следующее. Микро-КТ характеристики губчатой костной ткани метафиза бедер крыс контрольных групп выявили в разной степени нарушения, но, несмотря на это, сохранной была структура костной ткани обследованных тел позвонков у животного без гиперкалорийной диеты (КГ1). В экспериментальных исследованиях на моделях сахарного диабета и метаболического синдрома, прежде всего, происходит нарушение костеобразования вследствие трансформации остеобластов в жировые клетки. При жировой трансформации печени снижается синтез фибриллообразующего коллагена. В последующем усиливается резорбция костной ткани, происходит истончение трабекул, увеличивается между ними расстояние. Подобные изменения происходят с костной тканью в нашем исследовании, в большей степени в длинных трубчатых костях. Однако в группах, в которых применялись модифицированные селеном МВ (ОГ2, ОГ3 и ОГ4), характеристика губчатой ткани метафиза бедер и тел позвонков животных свидетельствовала о четкой тенденции к восстановлению структуры костной ткани.
В целом, в нашем исследовании продемонстрирована достоверно значимая эффективность селенсодержащих МВ в регуляции метаболических процессов (p<0,05—p<0,01), МПКТ (p<0,05), снижении резорбции костной ткани (p<0,05).
Вывод
Результаты настоящего исследования позволяют прогнозировать повышение эффективности медицинской реабилитации пациентов с соматическими заболеваниями при включении в программы селенсодержащих МВ.
Источник финансирования: Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Source of funding: This study was not supported by any external sources of funding.
Все авторы подтверждают соответствие своего авторства согласно международным критериям ICMJE.
Участие авторов: концепция и дизайн исследования, анализ и интерпретация результатов обзора, научное редактирование текста рукописи — А.С. Кайсинова, А.В. Абрамцова, М.Б. Узденов; обзор публикаций по теме статьи, проведение экспериментальных исследований, обработка результатов микро-КТ животных — И.В. Ржепаковский; обзор публикаций по теме статьи, написание и редактирование текста рукописи, анализ и интерпретация данных рентгеновской денситометрии животных — Г.В. Саградян; обзор публикаций по теме статьи, написание и редактирование текста рукописи, анализ и интерпретация данных — А.А. Джанибекова, Д.К. Бадахова; формирование концепции и разработка дизайна исследования, написание и редактирование текста рукописи, анализ и интерпретация данных— А.А. Федоров ; обзор публикаций по теме статьи, научное редактирование текста рукописи — В.Е. Илларионов, Т.Г. Маркосян.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.