Нейропротективное действие карнозина в условиях экспериментальной фокальной ишемии-реперфузии головного мозга

Ведущую роль в повреждении и гибели нейронов в условиях ишемии головного мозга играет окислительный стресс (ОС) [1, 2]. Нарушения функционирования дыхательной цепи митохондрий в головном мозге во время ишемии и реперфузии стимулируют избыточную продукцию активных форм кислорода (АФК): супероксид- и гидроксил-радикалов и перекиси водорода [3, 4]. Развитие О.С. приводит к повреждению структурных элементов клеток (липидов, ДНК и белков, мембранных структур) и запуску апоптоза через сигнальные каскады, индуцируемые ОС [5]. Патогенетическая значимость ОС обусловливает целесообразность применения нейропротективных препаратов антиоксидантного действия в условиях развития острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК). Между тем, несмотря на многочисленные экспериментальные данные, демонстрирующие эффективное действие антиоксидантов на моделях ишемии головного мозга, в неврологической практике нет ни одного антиоксидантного препарата с клинически доказанным нейропротективным эффектом [6]. В связи с этим разработка новых антиоксидантных лекарственных препаратов нейропротективного действия остается актуальной задачей.

Среди перспективных антиоксидантов интерес исследователей вызывает карнозин — природный эндогенный дипептид, состоящий из β-аланина и L-гистидина, который присутствует в концентрации от 0,1 мМ в коре больших полушарий головного мозга до 1—2 мМ в обонятельных луковицах [3, 7]. В экспериментах in vitro и in vivo [3, 8—10] карнозин эффективно подавлял образование АФК, продуктов перекисного окисления липидов и гликирования белков. Кроме антиоксидантной активности карнозин показал свойства цитозольного буфера, хелатора тяжелых металлов, антиэксайтотоксическую активность. Он уменьшал неврологические нарушения, снижал летальность и улучшал функциональный исход после глобальной ишемии мозга у песчанок, крыс и мышей [11—15] и транзиторной ишемии у крыс [11, 15, 16]. Следует отметить, что в большинстве исследований [11, 14, 15, 17] были использованы высокие дозы карнозина и лучшие результаты получали при его введении за 15—30 мин до окклюзии магистральных артерий мозга.

Цель настоящего исследования — оценка нейропротективных свойств карнозина при профилактическом введении в течение 7 дней в суточной дозе 150 мг/кг массы тела (в виде добавки к корму) в условиях моделировании у крыс фокальной ишемии головного мозга в бассейне средней мозговой артерии.

Материал и методы

Содержание животных и введение карнозина. Работу проводили на половозрелых самцах крыс линии Вистар (возраст 4—5 мес, масса тела 300—400 г). Животных содержали в помещении с режимом освещения 12 ч день/12 ч ночь при температуре 25±2 °С на стандартном полусинтетическом рационе (состав аналогичен коммерческому рациону AIN-93M) из расчета 20 г сухого корма на 1 животное в сутки при свободном доступе к воде. Карнозин крысы получали в составе корма в течение 7 дней до операции в суточной дозе 150 мг/кг массы тела. В работе использовали карнозин (β-аланил-L-гистидин), синтезированный фирмой «Yonezawa Hamari Chemicals, Ltd» (Япония), с чистотой 99%.

Моделирование ишемии мозга. Преходящую фокальную ишемию головного мозга моделировали с помощью 60-минутной интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) силиконовым филаментом с его последующим удалением для обеспечения 24-часовой реперфузии мозга [2]. Для наркоза использовали хлоралгидрат, который растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно из расчета 400 мг на 1 кг массы тела животного. Были проведены две серии экспериментов.

В 1-й серии оценивали влияние карнозина на размер формирующегося ишемического очага. Крысы были разделены на две группы: 1-ю группу составили 12 животных, получавших в течение 7 дней перед ОСМА стандартный корм (ишемия; 2-ю — 11 крыс, получавших перед ОСМА в течение 7 дней ежедневно корм с добавкой карнозина (ишемия+карнозин).

После 24 ч реперфузии животных декапитировали, головной мозг извлекали и немедленно замораживали при ‒20^ºС для последующей оценки размера ишемического очага.

Во 2-й серии оценивали влияние карнозина на неврологический статус животных и общую антиоксидантную активность ткани мозга. Были сформированы три группы: в 1-ю группу включили 9 животных, получавших в течение 7 дней стандартный корм, с которыми затем проводили все хирургические манипуляции, кроме ОСМА (слепая операция, контроль); во 2-ю — 9 крыс, получавших перед операцией в течение 7 дней стандартный корм, а затем перенесших ОСМА с последующей реперфузией (ишемия); в 3-ю — 9 животных, получавших перед операцией в течение 7 дней ежедневно корм с добавкой карнозина, а затем перенесших ОСМА с последующей реперфузией (ишемия+карнозин).

После 24-часовой реперфузии проводили оценку неврологического статуса, через 1 ч после тестирования животных декапитировали, собирая оттекающую кровь в гепаринизированные пробирки. Эритроциты осаждали, плазму переносили в пробирки Eppendorf и замораживали в жидком азоте. Головной мозг извлекали, отделяли большие полушария и немедленно замораживали в жидком азоте. Замороженные образцы плазмы и ткани мозга хранили при ‒80 °С для последующего определения антиоксидантного статуса плазмы крови и ткани мозга экспериментальных животных методом железо-индуцированной хемилюминесценции.

Оценка площади ишемического очага. Замороженный мозг разрезали во фронтальной плоскости на срезы толщиной 1—2 мм и окрашивали в 2% растворе 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) в натрий-фосфатном буфере (0,1 M, pH 7,4) при температуре 37 °C в течение 10 мин. При этом не затронутая ишемией ткань мозга окрашивалась в красный цвет за счет восстановления ТТХ в формазан под действием тканевых дегидрогеназ, тогда как очаг некроза оставался неокрашенным. Останавливали реакцию и стабилизировали окраску срезов путем перемещения их в 10% раствор формалина на 1 мин (рис. 1).

Рис. 1. Образец среза головного мозга, окрашенного ТТХ. Ишемический очаг представлен в виде белой области, обведенной черной сплошной линией.

Затем срезы сканировали с двух сторон с разрешением 600 dpi. Полученные изображения обрабатывали с помощью программы ImageJ. Площадь некротического поражения для учета индивидуальной вариабельности его размера и отека мозга рассчитывали в процентах от контралатерального полушария.

Оценка неврологического статуса. Через 24 ч после операции оценивали неврологический статус крыс по шкале Modified neurological stroke score (mNSS), которая состоит из сочетания 4 моторных (спонтанная активность в клетке в течение 5 мин, симметричность движения четырьмя конечностями, симметричность движений передними конечностями при подвешивании за хвост, подъем по вертикальной сетке) и 2 сенсорных тестов (реакция на прикосновение к туловищу, реакция на прикосновение к вибриссам). Каждому показателю присваивали от 0 до 3 баллов, в итоге баллы по всем 6 тестам суммировали [18, 19]. Максимальный суммарный балл 17—18 соответствует нормальному поведению здорового животного. Чем меньше суммарный балл, тем сильнее выражен неврологический дефицит.

Хемилюминесцентный анализ. Оценку антиоксидантного статуса плазмы крови и ткани мозга экспериментальных животных проводили на модели Fe²⁺-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) [20]. Измеряли латентный период (τ, c) в развитии ХЛ между быстрой вспышкой и максимальной интенсивностью ХЛ, свидетельствующий о резистентности субстрата к дальнейшему окислению; длительность τ зависит от соотношения про- и антиоксидантов в изучаемой системе и характеризует ее антиоксидантный статус. Регистрацию Х.Л. проводили на приборе Luminometr-1251 (LKB, Швеция).

Статистический анализ полученных данных. Все данные приведены в виде средних значений с ошибкой среднего (М±m). Сравнение площади очага инфаркта, показателей неврологического и антиоксидантного статуса между контрольными животными и животными, получавшими карнозин, проводили с помощью U-критерия Манна—Уитни. Статистически значимыми различия считали при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Влияние профилактического применения карнозина на площадь очага поражения мозга при моделировании фокальной ишемии с реперфузией в бассейне средней мозговой артерии у крыс. Как следует из результатов 1-й серии экспериментов, 60-минутная ОСМА с последующей 24-часовой реперфузией (1-я группа, ишемия) вызывала образование очага гибели нейронов в коре пораженного полушария, площадь которого составляла от 21,5 до 38,1% (в среднем 32,2±1,5%) по отношению к площади коры контралатерального полушария (рис. 2).

Рис. 2. Уменьшение площади очага ишемического поражения при профилактическом введении карнозина. Данные приведены в процентах по отношению к площади коры контралатерального полушария.

Этот показатель находился в пределах значений, полученных другими авторами [21] на аналогичной модели. Профилактическое введение карнозина в течение 7 дней с рационом в суточной дозе 150 мг/кг массы тела перед ОСМА (2-я группа, ишемия+карнозин) обусловливало снижение площади очага ишемического поражения до 25,9±2,5% по отношению к площади коры контралатерального полушария (см. рис. 2), т. е. на 20% по сравнению с размерами очага у крыс 1-й группы.

Проводившиеся ранее исследования влияния карнозина на формирование ишемического очага при моделировании фокальной ишемии головного мозга у крыс методом интралюминальной ОСМА были суммированы в работе C. Davis и соавт. [21]. По данным авторов, карнозин при разных протоколах применения и разных дозах снижал площадь очага на 24,0—34,9%, при этом эффективные дозы составляли от 500 до 2000 мг/кг массы тела. Дозы менее 750 мг/кг были эффективны только при введении карнозина непосредственно за 30 мин до ОСМА.

Полученные в настоящем исследовании результаты влияния карнозина на площадь ишемического очага согласуются с представленными данными литературы, но указывают на способность карнозина обеспечивать нейропротекцию при значительно меньших дозах в условиях его курсового профилактического применения.

Влияние профилактического применения карнозина на неврологический статус крыс при моделировании фокальной ишемии с реперфузией в бассейне средней мозговой артерии. На рис. 3 представлены

Рис. 3. Сохранность неврологических функций крыс в условиях развития ишемического поражения мозга при профилактическом введении карнозина. Данные приведены в баллах по шкале mNSS. ** — p<0,01 по отношению к группе «контроль»; ^# — p<0,05 по отношению к группе «ишемия».

данные о влиянии профилактического введения карнозина в течение 7 дней перед ОСМА на неврологический статус крыс, развившийся к 24-му часу реперфузии ишемизированного полушария, полученные во 2-й серии экспериментов. Суммарный балл по mNSS у крыс, не получавших перед операцией карнозин, был ниже, чем у контрольных животных, подвергнутых ложной операции, в среднем на 47%: 14,7±1,2 балла в 1-й группе (контроль) против 7,8±1,2 балла во 2-й группе (ишемия) (p<0,01). У животных, получавших карнозин (3-я группа, ишемия+карнозин), суммарный балл по mNSS после перенесенной фокальной ишемии сохранялся на уровне 11,7±0,9 балла. Таким образом, результаты, полученные при оценке влияния профилактического введения карнозина с рационом в суточной дозе 150 мг/кг массы тела в течение 7 дней перед операцией, указывают на его нейропротективное действие, выражающееся в снижении площади зоны инфаркта в пораженном полушарии и в поддержании неврологического статуса животных, перенесших фокальную ишемию мозга с 24-часовой реперфузией.

Влияние профилактического применения карнозина на антиоксидантный статус плазмы крови и ткани головного мозга крыс при моделировании фокальной ишемии с реперфузией в бассейне СМА. ОСМА с последующей 24-часовой реперфузией приводит к подавлению антиоксидантного статуса как на уровне целого организма (латентный период индукции ХЛ для плазмы крови снижается с 61,7±2,6 с в контрольной группе до 40,0±1,5 с в группе ишемии), так и ткани мозга ишемизированного полушария, где этот показатель снижается с 80,5±2,9 до 50,8±4,6 с соответственно. У животных, получавших карнозин (группа ишемия+карнозин), антиоксидантный статус не только не снижался после перенесенной ишемии-реперфузии, но и увеличивался (латентный период индукции ХЛ в ткани мозга составил 96,3±7,6 с, а в плазме крови — 87,3±5,2 с) (рис. 4).

Рис. 4. Высокая антиоксидантная активность плазмы крови и ткани мозга крыс в условиях развития ишемического поражения мозга при профилактическом введении карнозина по продолжительности латентного периода ©. ** — p<0,01, * — p<0,05 по отношению к группе «контроль»; ^## — p<0,01 по отношению к группе «ишемия».

Полученные результаты указывают на эффективность профилактического введения карнозина с рационом для обеспечения высокого антиоксидантного статуса организма в целом и ткани головного мозга в частности в условиях развития ишемического поражения мозга. Можно полагать, что сохранность антиоксидантного статуса способствовала снижению неврологического дефицита у животных, перенесших ишемию головного мозга.

Проведенный C. Davies и соавт. [21] метаанализ публикаций, посвященных влиянию карнозина на ишемические процессы, выявил 202 работы, среди которых только в 8 были исследованы эффекты карнозина на формирование очага ишемического поражения при моделировании фокальной ишемии: 3 — на мышах и 5 — на крысах. Из 5 работ, выполненных на крысах, только в 2 оценивали неврологический статус. При этом эффект карнозина зависел от дозы и применяемого протокола эксперимента. Так, снижение площади зоны инфаркта мозга при применении карнозина в дозе 1000 мг/кг массы тела и выше составило 38,1%, тогда как дозы в пределах 500—750 мг/кг и менее 500 мг/кг снижали площадь зоны инфаркта на 23,3 и 13,0% соответственно; дозы менее 750 мг/кг были эффективны только при введении карнозина непосредственно за 30 мин до окклюзии.

В настоящей работе впервые показано нейропротективное действие низкой дозы карнозина (150 мг/кг массы тела) при его курсовом профилактическом применении в условиях моделирования фокальной ишемии мозга с реперфузией. В этих условиях карнозин ограничивал размер формирующегося очага некроза, способствуя снижению неврологического дефицита и повышению антиоксидантной активности организма и ткани головного мозга. Полученные результаты указывают на перспективность разработки на основе карнозина препаратов для профилактики и лечения острых сосудистых заболеваний головного мозга.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: sasha.92.jan@mail.ru