Геморрагический инсульт является актуальной медико-социальной проблемой, поскольку характеризуется широким распространением (20% от общего числа инсультов при заболеваемости инсультом 2,5—3,0 случая на 1 тыс. населения в год) и высокой летальностью (до 51%) [1].

Наиболее частым ранним осложнением инсульта является пневмония, которая поражает, по данным разных исследователей [2—4], от 12 до 33% пациентов. Многочисленные исследователи [5—10] описывают иммунологические нарушения, развивающиеся в условиях инсульта. При этом цитоархитектоника лимфоидных образований органов дыхания, состояние которой определяет местную иммунную резистентность, в этих условиях ранее не изучалась.

Цель настоящего исследования — выявление закономерностей изменения клеточного состава лимфоидных узелков в условиях моделирования геморрагического инсульта у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу.

Исследовали трахеи 98 крыс-самцов линии Вистар массой 250—300 г в возрасте 4—6 мес. Для оценки устойчивости к эмоциональному стрессу животных предварительно оценивали по тесту «открытое поле («Open field») [11, 12]. С помощью теста регистрировали латентные периоды первого перемещения и выхода в центр поля, горизонтальные амбуляции (количество пересеченных периферических и центральных квадратов), вертикальную активность (количество периферических и центральных стоек), исследовательскую активность (заглядывание в норы), время грумминга, количество дефекаций [13]. Тестирование проводилось в течение 3 мин. Устойчивость крыс к эмоциональному стрессу оценивали по величине индекса активности, для вычисления которого сумму числа пересеченных периферических и центральных секторов, периферических и центральных стоек, а также исследованных объектов делили на сумму латентных периодов 1-го движения и выхода в центр открытого поля.

Для эксперимента отбирали устойчивых (индекс активности — ИА от 2,25 до 5,8) и неустойчивых к стрессу крыс (ИА от 0,25 до 0,79) [13]. Из 150 животных для эксперимента были отобраны 49 устойчивых и 49 неустойчивых к стрессу особей, амбивалентных животных из эксперимента исключали. Как устойчивых, так и неустойчивых к стрессу крыс разделили на группы: интактная (по 7 особей), контрольная (по 21 особи) и экспериментальная (по 21 особи). В контрольных и экспериментальных группах выделили 3 подгруппы в соответствии со сроками выведения из эксперимента (1, 3, 7-е сутки после экспериментального геморрагического инсульта).

Через 3 сут после тестирования у крыс экспериментальной группы был смоделирован геморрагический инсульт, крысам контрольной группы проведена ложная операция. Наркотизированным животным (вводили внутрибрюшинно хлоралгидрат 400 мг/кг) проводилась трепанация черепа с последующим введением через иглу в головной мозг аутокрови в объеме 60 мкл. В качестве контроля использовали крыс, которым были проведены только трепанация и введение иглы в головной мозг. Экспериментальных и контрольных крыс сакрифицировали методом декапитации на 1, 3 и 7-е сутки после моделирования инсульта или после ложной операции. При работе с животными учитывались положения приказа Минвуза СССР № 742 от 13.11.1984 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Этическая комиссия НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, протокол № 1 от 03.09.2005).

Животных вскрывали, трахею препарировали целиком, затем выделяли зону вблизи бифуркации органа. Выбор для исследования отдела трахеи об-условлен тем, что именно вблизи бифуркации стенка органа содержит наибольшее количество лимфоидной ткани [14] и, в частности, наибольшее количество лимфоидных узелков — наиболее зрелых в морфофункциональном отношении структур этой ткани [15—17].

Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали азур-2-эозином, гематоксилином и эозином, по Маллори. Подсчет клеток лимфоидного ряда проводили на стандартной площади гистологического среза (880 мкм²) в 10 полях зрения. Результаты подсчета обрабатывали статистически (SPSS17), достоверность различий оценивали по U-критерию Манна—Уитни, различия считали достоверными при p≤0,05.

Анализ экспериментальных данных показал, что клеточный состав лимфоидных узелков в условиях геморрагического инсульта изменяется, причем не одинаково, у устойчивых и предрасположенных к стрессу особей. Следует отметить, что на 1, 3 и 7-е сутки эксперимента показатели клеточного состава лимфоидных узелков трахеи у экспериментальных крыс заметно отличались от показателей контрольных групп животных.

Учитывая, что лимфоидные образования стенки трахеи у крыс существуют в тесной морфофункциональной связи с другими ее элементами [18], было необходимо изучить и морфологию стенки органа [19]. Исследования показали, что в условиях экспериментального геморрагического инсульта уже на 1-е сутки в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой основе стенки трахеи происходит нарушение микроциркуляции крови (полнокровие венул, образование «монетных столбиков» из эритроцитов, диапедезные кровоизлияния), разрыхление и отечность ткани, деструкция эпителиального пласта трахеи (декомплексация эпителия, деструкция эпителиоцитов, локальная отслойка эпителиального пласта). Увеличивается число малых лимфоцитов между эпителиоцитами трахеи, особенно у предрасположенных к стрессу крыс (в 2,2 раза — от 0,5±0,16 клетки/880 мкм² в контроле до 1,1±0,31 клетки на 1-е сутки эксперимента; p=0,047). Отмечался выход лимфоцитов и эритроцитов в просвет органа [19]. Активная миграция клеток лимфоидного ряда признается исследователями основным механизмом обеднения лимфоидных структур в условиях стресса [20, 21], а участие в патогенезе инсульта стресс-реализующих механизмов представляется несомненным [22]. Так, по данным С.П. Сергеевой [23], уменьшение массы тимуса у крыс отмечается как в условиях внутримозгового кровоизлияния, так и при эмоциональном стрессе.

К 7-м суткам после моделирования инсульта, по данным исследования, проведенного нами ранее [19], эпителиальная выстилка трахеи не восстановилась, венулы стенки органа были по-прежнему полнокровны, число малых лимфоцитов среди эпителиоцитов превышало норму, особенно у неустойчивых к стрессу крыс (в 6,5 раз — 0,2±0,1 клетки/880 мкм² в норме и 1,3±0,21 клетки/880 мкм² на 7-е сутки эксперимента; p=0,003). В то же время отека в стенке трахеи не наблюдалось.

Анализируя клеточный состав лимфоидных узелков в стенке трахеи крыс в условиях моделирования инсульта, следует отметить, что у устойчивых к стрессу особей на 1-е сутки эксперимента плотность распределения клеток на стандартной площади гистологического среза достоверно увеличивалась по сравнению с показателями в контрольной группе (в центральной части в 1,32 раза, до 45,6±1,22 клетки/880 мкм²; p=0,009) в основном за счет малых и средних лимфоцитов (рис. 1).

В области верхушки узелков появлялись бласты, в центральной части абсолютное количество больших лимфоцитов увеличивалось в 1,4 раза (до 2,6±0,46 клетки/880 мкм²; p=0,045). Следует упомянуть, что только зрелые Т- и В-лимфоциты могут мигрировать через посткапиллярные венулы [24]. Вероятно, малодифференцированные клетки появлялись в результате бласттрансформации зрелых форм лимфоцитов. При этом в узелках увеличивалось число деструктивно измененных клеток (в центральной части в 1,86 раза — до 5,6±0,54 клетки/880 мкм²; p=0,024), количество плазмоцитов уменьшалось (в верхушке узелков в 2,66 раза — до 0,6±0,36 клетки/880 мкм²; p=0,01).

В отличие от стрессоустойчивых животных, у крыс, предрасположенных к стрессу, на 1-е сутки эксперимента в основании узелков плотность распределения клеток незначительно уменьшалась (в 1,21 раза — до 27,3±0,74 клетки/880 мкм²; p=0,046), в центральной части — увеличивалась (в 1,28 раза — до 37,3±1,35 клетки/880 мкм²; p=0,014), а в верхушке — достоверно не изменялась по сравнению с контрольной группой (рис. 2).

Такая перестройка связана как с ослаблением миграции клеток лимфоидного ряда из венул с высоким эндотелием в основание узелка, так и с перераспределением клеток в пределах узелка в связи с их активной миграцией в просвет органа (число малых лимфоцитов между эпителиоцитами трахеи увеличивалось в 2,2 раза — до 1,1±0,31 клетки/880 мкм²). Ослабление миграции лимфоцитов из сосудистого русла в основание узелков может быть связано с накоплением избытка жидкости в интерстиции. Число малых лимфоцитов в верхушке и основании лимфоидных узелков на 1-е сутки эксперимента у неустойчивых к стрессу крыс уменьшалось по сравнению с контролем в 1,28 раза (до 14,0±1,26 клетки/880 мкм²) в верхушке и в 1,44 раза (до 12,7±0,96 клетки) в основании (p=0,045 и p=0,043 соответственно).

В то же время в узелках увеличивалось число малодифференцированных лимфоцитов (особенно в основании узелков появлялись бласты, число больших лимфоцитов увеличивалось в 3,8 раза — до 1,9±0,45 клетки/880 мкм²; p=0,018). При этом число плазматических клеток в узелках резко уменьшалось, особенно в их центре (в 9 раз — до 0,1±0,09 клетки/880 мкм²; p=0,049). Содержание деструктивно измененных клеток и макрофагов в верхушке и центре узелков у неустойчивых к стрессу крыс увеличивалось, особенно в центре (в 2,79 раза — до 9,5±1,19 клетки клетки/880 мкм² и в 5,33 раза — до 1,6±0,16 клетки; p=0,001 и p=0,001 соответственно). У устойчивых к стрессу крыс увеличение содержания деструктивно измененных клеток в узелках на 1-е сутки после инсульта было выражено в меньшей степени (лишь в 1,86 раза).

На 3-и сутки после моделирования инсульта у устойчивых к стрессу крыс плотность распределения клеток в лимфоидных узелках стенки трахеи уменьшалась, особенно в центральной части (в 1,46 раза — до 31,1±2,31 клетки/880 мкм²; p=0,003), в основном за счет средних и малых лимфоцитов (см. рис. 1). Следует отметить, что у предрасположенных к стрессу животных подобные изменения клеточного состава лимфоидных узелков наблюдались уже на 1-е сутки эксперимента. Вместе с этим на 3-и сутки эксперимента в верхушке узелков появлялись картины митозов, а в центральной части в 2,5 раза (до 1,0±0,39 клетки/880 мкм²; p=0,048) увеличивалось абсолютное содержание бластов, что свидетельствовало о компенсаторных возможностях лимфоидных узелков.

У неустойчивых к стрессу крыс на 3-и сутки после моделирования инсульта плотность распределения клеток в центральной части узелков продолжала уменьшаться (от 37,3±1,35 клетки/880 мкм² на 1-е сутки до 32,4±1,34 клетки на 3-и сутки эксперимента; p=0,039), а в основании — увеличивалась по сравнению с показателями на 1-е сутки эксперимента (от 27,3±0,74 клетки/880 мкм² на 1-е сутки до 32,3±1,08 клетки на 3-и сутки; p=0,003), в основном за счет малых лимфоцитов (см. рис. 2). В то же время в узелках появлялись плазмобласты и увеличивалось число плазмоцитов (в верхушке узелков в 3,15 раза — до 1,89±0,42 клетки/880 мкм² и в центре в 9 раз — до 0,9±0,23 клетки; p=0,013 и p=0,007 соответственно).

Число деструктивно измененных клеток в 1,55 раза уменьшалось в верхушке (до 4,0±0,57 клетки/880 мкм²; p=0,026) и в 1,7 раза увеличивалось в основании узелков (до 5,3±0,42 клетки; p=0,007). В целом на 3-и сутки эксперимента отмечались наиболее глубокие изменения клеточного состава лимфоидных узелков в стенке трахеи крыс, при этом наблюдались и признаки компенсаторной реакции: у неустойчивых к стрессу особей увеличивалось число плазматических клеток, а у стрессоустойчивых — увеличивалось содержание малодифференцированных форм лимфоцитов, появлялись клетки с картинами митозов.

На 7-е сутки после геморрагического инсульта у стрессоустойчивых крыс плотность распределения клеток в верхушке узелков увеличивалась (от 27,0±0,97 клетки/880 мкм² на 3-и сутки до 33,6±2,05 клетки на 7-е сутки эксперимента; p=0,016), а в основании — уменьшалась в 1,46 раза по сравнению с 3-ми сутками до 22,2±1,01 клетки/880 мкм²; p=0,003 (см. рис. 1). Увеличивалось число малых лимфоцитов (в верхушке узелков в 1,46 раза — до 14,8±1,06 клетки; в центре в 1,38 раза — до 17,2±2,51 клетки/880 мкм²; p=0,010). Также увеличивалось содержание плазматических клеток (в центре узелков в 8 раз — до 0,8±0,58 клетки; в основании в 2 раза — до 0,6±0,59 клетки/880 мкм²; p=0,016 и p=0,008 соответственно). Это может свидетельствовать об усилении иммунной защиты у стрессоустойчивых особей на 7-е сутки эксперимента. Кроме того, уменьшалось число деструктивно измененных клеток (в основании в 3,77 раза — до 2,2±0,73 клетки; в центре в 2,42 раза — до 2,8±0,73 клетки/880 мкм²; p=0,009 и p=0,010 соответственно).

В целом у стрессоустойчивых крыс на 7-е сутки эксперимента число малых и средних лимфоцитов в лимфоидных узелках было достоверно меньше, чем в норме, особенно в основании узелков (малых лимфоцитов в 2,38 раза; средних лимфоцитов в 2,66 раза; p=0,002 и p=0,009 соответственно). Число малодифференцированных клеток лимфоидного ряда в центре и в основании узелка было меньше (в 4 и в 24 раза; p=0,001 и p=0,004 соответственно), а в области верхушки в 3 раза больше по сравнению с нормой (p=0,025). Содержание плазматических клеток в верхушке лимфоидных узелков у стрессоустойчивых крыс на 7-е сутки после инсульта было в 2 раза больше, чем в норме (норма — 0,4±0,19 клетки/880 мкм²). Число деструктивно измененных клеток в узелках достоверно меньше нормы (в центре в 2,35 раза; в основании в 1,9 раза; p=0,048 и p=0,045 соответственно). Плотность распределения клеток на стандартной площади гистологического среза также была достоверно меньше, чем в норме, особенно в основании узелков (в 2,47 раза; 22,2±1,01 клетки/880 мкм²; p=0,002) (см. рис. 1).

У неустойчивых к стрессу крыс на 7-е сутки после инсульта плотность распределения клеток на стандартной площади гистологического среза достоверно увеличивалась в верхушке лимфоидных узелков в 1,27 раза по сравнению с показателем на 3-и сутки эксперимента (до 36,7±1,22 клетки/880 мкм²; p=0,002) (см. рис. 2). В верхушке и центре узелков увеличивалось число малых лимфоцитов (в 1,28 и 1,17 раза — до 16,9±0,8 и 14,5±1,16 клетки/880 мкм²; p=0,036 и p=0,039 соответственно) и средних лимфоцитов (в 1,58 и в 1,63 раза — до 4,4±0,47 и 3,6±0,26 клетки/880 мкм²; p=0,014 и p=0,009 соответственно).

Уменьшалось число плазматических клеток в узелках, особенно в их основании (в 13 раз — до 0,1±0,09 клетки/880 мкм²; p=0,030). Во всех отделах узелков на 7-е сутки эксперимента появлялись единичные нейтрофилы. Число деструктивно измененных клеток уменьшалось лишь в центре узелка (в 1,44 раза по сравнению с 3-ми сутками — до 6,5±0,65 клетки/880 мкм²; p=0,027). В целом у неустойчивых к стрессу крыс на 7-е сутки после инсульта восстановление числа малых лимфоцитов имело характер чрезмерной компенсации (в верхушке и центральной части узелка их содержание достоверно больше, чем в норме; норма — 13,7±1,73 клетки/880 мкм² в верхушке и 11,1±1,6 клетки в центре узелков; p=0,046).

Число малодифференцированных клеток, средних лимфоцитов и макрофагов в узелках достигало нормальных значений. Число плазматических клеток в верхушке и основании узелков в 2,23 и в 5 раз соответственно меньше, чем в норме (в верхушке 1,3±0,27 клетки/880 мкм² на 7-е сутки эксперимента, 2,9±0,42 клеток в норме; в основании 0,1±0,09 клетки/880 мкм² на 7-е сутки, 0,5±0,26 клетки в норме; p=0,012 и p=0,001 соответственно). В лимфоидных узелках присутствовали нейтрофилы (в норме не обнаруживаются). Содержание деструктивно измененных клеток в узелках на 7-е сутки эксперимента было заметно больше, чем в норме (особенно в основании узелков — 6,5±0,58 клетки/880 мкм², что в 2,7 раза выше нормы; p=0,001).

Плотность распределения клеток на стандартной площади гистологического среза в узелках у неустойчивых к стрессу крыс на 7-е сутки после инсульта достоверно больше, чем в норме (см. рис. 2).

Анализируя полученные данные, можно отметить, что у неустойчивых к стрессу крыс на 7-е сутки эксперимента положительной динамики в восстановлении клеточного состава лимфоидных узелков не наблюдалось: число средних лимфоцитов и нейтрофилов чрезмерно возрастало, превышая нормальные значения, содержание плазматических клеток наоборот уменьшалось, удаляясь от нормы, по-прежнему было велико содержание деструктивно измененных клеток.

Таким образом, экспериментально доказано, что у неустойчивых к стрессу крыс уменьшение числа малых лимфоцитов в лимфоидных узелках происходит в более ранние сроки эксперимента (1- е сутки) по сравнению со стрессоустойчивыми крысами. Наиболее глубокие изменения клеточного состава лимфоидной ткани наблюдаются на 3-и сутки эксперимента. В то же время именно на 3-и сутки выявляется компенсаторная реакция: у стрессоустойчивых крыс она выражается появлением клеток с картинами митозов и усилением бласттрансформации лимфоцитов, а у неустойчивых к стрессу крыс — увеличением числа плазматических клеток в лимфоидных узелках. На 7-е сутки у предрасположенных к стрессу крыс происходит срыв компенсаторных процессов — содержание плазматических клеток снова уменьшается. Число малых лимфоцитов становится бо́льшим, чем в норме, в узелках появляются нейтрофилы. У устойчивых к стрессу особей к 7-м суткам эксперимента количество малых лимфоцитов не достигает нормы, но содержание деструктивно измененных клеток в узелках приближается к нормальным значениям. Следует подчеркнуть, что, по мнению В.К. Сырцова [18], именно морфофункциональное состояние лимфоидных узелков играет основную роль в формировании специфической резистентности трахеобронхиальной системы. Полученные данные об особенностях реакции лимфоидных узелков трахеи на моделирование инсульта у крыс перекликаются с результатами Н.О. Иванниковой и Е.В. Коплик [25], полученными в тех же экспериментальных условиях. Авторы описывают морфологические изменения сосудов и нейронов сенсомоторной коры головного мозга на контралатеральной геморрагическому очагу стороне. Выраженность дегенеративных изменений нейронов и сосудов коры на 1, 3 и 7-е сутки экспериментального инсульта больше у неустойчивых к стрессу особей. На 3-и сутки после инсульта у неустойчивых к стрессу крыс наблюдается срыв компенсаторных процессов, а именно прекращение формирования конусов роста капилляров.

Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что иммунная защита стенки трахеи в условиях инсульта угнетена, что может способствовать развитию воспалительных бронхолегочных осложнений заболевания. Выявлены также и особенности реакции лимфоидной ткани трахеи у крыс с различной исходной устойчивостью к стрессу. Наиболее глубокие нарушения клеточного состава лимфоидных узелков в стенке трахеи как у устойчивых, так и у неустойчивых к стрессу крыс определяются на 3-и сутки эксперимента. При этом у неустойчивых к стрессу особей эти нарушения наблюдаются уже на 1-е сутки эксперимента. В то же время только у устойчивых к стрессу крыс на 7-е сутки эксперимента в процессе восстановления цитоархитектоники лимфоидных узелков выявляется отчетливая положительная динамика. Таким образом, по данным настоящего морфологического исследования, в условиях моделирования геморрагического инсульта у устойчивых к эмоциональному стрессу крыс, по сравнению с предрасположенными к стрессу особями иммунная резистентность стенки трахеи более высока.

Полученные данные и использованная экспериментальная модель могут лечь в основу разработки новых алгоритмов терапии и профилактики воспалительных бронхолегочных осложнений у пациентов с внутримозговым кровоизлиянием. Выявленная связь между исходной стрессоустойчивостью и степенью нарушения цитоархитектоники лимфоидных структур трахеи в условиях мозгового кровоизлияния также может быть принята во внимание исследователями-клиницистами, занимающимися проблемой профилактики угрожающих жизни осложнений у пациентов с факторами риска инсульта.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.