Для разработки научных основ профилактики нарушений мозгового кровообращения важнейшее значение имеют такие направления ангионеврологии, как концепция факторов риска развития заболевания и концепция патогенетической гетерогенности инсульта [9].

Впервые о факторах риска стали говорить в связи с выявляемыми корреляциями между отдельными характеристиками населения и развитием в дальнейшем коронарной болезни сердца и инсульта [27]. Многочисленные зарубежные и отечественные эпидемиологические исследования [43] свидетельствуют о все возрастающем многообразии факторов риска развития ишемического инсульта.

В последние годы возрос интерес к исследованию роли факторов воспаления в патогенезе инсульта, а также прогнозированию риска первичных и вторичных цереброваскулярных катастроф по уровню воспалительных маркеров в различных популяциях [25, 29, 32, 46]. Механизм патогенного действия «традиционных» факторов риска инсульта в определенной степени связан с индукцией воспалительных и протромботических процессов в артериальном сосудистом русле, особенно у пациентов с атеросклерозом. Многочисленные экспериментальные исследования продемонстрировали, что даже незначительное повышение концентрации провоспалительных факторов способствует прогрессированию атерогенеза и развитию хронической ишемизации головного мозга с формированием энцефалопатии [25, 29, 32, 46].

В результате выраженного снижения уровня кровотока (до 70-80%) запускаются патофизиологические изменения, характерные для ишемии любого генеза, - ишемический каскад, сущность которого сводится к развитию энергетического дефицита и лактат-ацидоза по причине снижения доставки О₂ и глюкозы, а также уменьшения напряжения СО₂, что ведет к немедленному расщеплению аденозинтрифосфата (АТФ) для покрытия потребностей клеток в энергии. Впоследствии это приводит к снижению синтеза АТФ и формированию энергетической недостаточности.

Эти события способствуют повреждению функции натрий-калий-АТФ-зависимой ионной помпы, в результате чего ионы натрия и хлора входят в клетку, а калия - выходят из нее, что вторично повышает вхождение в клетку воды и способствует отеку [23, 28]. Последующие события характеризуются развитием мембранной деполяризации, которая открывает кальциевые каналы для дополнительного входа кальция в клетку и повышает рост внеклеточной концентрации глутамата и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) [7, 12]. Активация NMDA- и AMPA-рецепторов, а также рецепторов каината ведет к формированию ишемического цикла за счет вхождения в клетку ионов кальция, натрия, хлора и воды, что приводит к внеклеточному высвобождению провоспалительных цитокинов, медиаторов воспаления, высокоактивных свободных радикалов и острофазных астроцитарных белков (C-реактивный белок, сывороточный амилоидный А-белок, альфа1-антитрипсин, альфа2-макроглобулин, фибриноген, церулоплазмин, компонент комплемента C9 и фактор B, лактоферрин, белок SAA). Это оказывает негативное воздействие на межклеточные структуры, окружающие клеточные мембраны и, что особенно важно, на сосудистую стенку. Происходит повреждение базальной сосудистой мембраны, межэндотелиальных контактов и самой эндотелиальной выстилки церебральных сосудов, что запускает процессы эндотелиальной дисфункции (рис. 1) [17].

На разных стадиях микроциркуляторно-клеточного каскада эндотелий претерпевает ряд существенных изменений: структурные повреждения (разрыв, сморщивание и коагуляционный некроз) и функциональную перестройку, в ходе которой происходит экспрессия молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 в результате секреции интерлейкинов IL-1α и IL-1β тромбоцитами, фактора некроза опухолей α (ФНО-α), фактора активации тромбоцитов с экспрессией на их поверхности цитокина CD 40L, секреция фактора адгезии нейтрофилов IL-8 [16], тромбоксана, вазоконстрикторов, дисбаланс в системе вазорегуляции, приобретение гемостатических прокоагуляционных свойств, увеличение проницаемости базальной мембраны и реализация выхода фактора CXCL1 трасэндотелиальной миграции для нейтрофилов и жидкости на фоне угнетения абсорбции (рис. 2) [3, 7, 16, 17].

В результате этих событий происходит формирование цитотоксического отека глии и нейронов (в течение 6-72 ч после развития ишемии), проникновение токсических веществ из сосудистого русла в мозговую ткань на фоне продолжающихся оксидативных и прокоагулянтных реакций. В итоге происходит активация клеток микроглии, которые подобно нейтрофилам секретируют пероксидазы, в том числе и миелопероксидазу (МПО), что приводит к гибели жизненно важных нейронов с формированием инфарктного очага [19, 47]. Возрастание концентрации С-реактивного белка в крови больных уже в первые часы острой церебральной ишемии запускает активацию системы комплемента по классическому пути, что также способствует развитию воспаления в ишемизированной зоне и увеличению размера ишемического очага [38]. При ишемии мозга реперфузия ишемизированной мозговой ткани (вследствие установления коллатерального кровообращения или реканализации) приводит к усиленному образованию активных форм кислорода (АФК) клетками мозга и иммунными клетками. АФК стимулируют секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов, в результате чего повышается приток воспалительных клеток в зону повреждения [22]. Последние также начинают высвобождать АФК, матриксные металлопротеиназы, оксид азота и другие соединения, опосредующие повреждение клеток, гематоэнцефалического барьера и внеклеточного матрикса [34].

Все эти процессы лежат в основе вторичного ишемического повреждения мозга, проявляющегося отеком мозга, постишемическим микрососудистым стазом, вазомоторным и гемодинамическим дефицитом [48]. Можно предположить, что «традиционные» факторы риска оказывают влияние на взаимодействие воспалительных клеток с резидентными цереброваскулярными клетками, повышая чувствительность последних к воспалительной стимуляции и способствуя формированию атероматозных бляшек в крупных мозговых артериях и утолщению интимы с локальными тромбозами в артериолах [1].

Инфильтрация ишемизированных зон лейкоцитами сопровождается интенсификацией перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4-7, 10, 11]. Окисленные липиды обладают антигенными свойствами, запуская аутоиммунные процессы повреждения тканей. При изучении молекулярно-клеточных механизмов активации процессов липопероксидации высказана мысль о цитокинопосредованной интенсификации ПОЛ при ишемии. Характер этого влияния зависит от числа нейтрофилов и их фоновой активности.

Нейтрофилы (полиморфно-ядерные лейкоциты) обладают целым арсеналом гидролитических ферментов и бактерицидных белков, хранящихся в гранулах, которые под действием хемотаксических градиентов мигрируют в очаг воспаления. В результате активации клеток содержимое гранул постепенно переходит в фагосомы (компоненты клетки, участвующие в фагоцитозе) или во внеклеточное пространство. Рост концентрации внутриклеточного кальция, опосредованное при ишемии встраиванием в клеточные мембраны гидроперекисей липидов, способствует дегрануляции нейтрофилов [2, 8]. Ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что активация нейтрофилов может происходить и по Са²⁺-независимому механизму. Так, показано, что форболмиристатацетат (ФМА) активирует нейтрофилы независимо от Са²⁺ в цитозоле [35]. Тем не менее при увеличении концентрации Са²⁺ до 0,25 мкМ, происходит выброс содержимого секреторных пузырьков и третичных гранул, в состав которых входят альбумин, желатиназа, коллагеназа и другие белки, необходимые нейтрофилу для движения через плотные ткани к очагу воспаления. При увеличении концентрации внутриклеточного кальция до 0,7 мкМ происходит выброс содержимого из вторичных азурофильных гранул, содержащих огромное количество гемсодержащего фермента - МПО.

МПО образует гипохлорит-анион, который, будучи сильным окислителем, вызывает разрушение жировых атеросклеротических отложений в стенке сосуда и последующий тромбоз. Установлено, что повышенный системный уровень МПО (содержание в нейтрофилах и крови) ассоциирован с наличием заболеваний коронарных артерий [49]. Кроме того, повышенный уровень МПО в крови может повышать риск развития неблагоприятных кардиологических событий (инфаркт миокарда, внезапная смерть и др.) у больных с грудной болью и острым коронарным синдромом [13, 20]. За последние несколько лет проведенные клинические исследования показали, что высокие концентрации МПО связаны с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, независимо от «классических» факторов риска коронарных синдромов. В частности, в работе A. Stefanescu и соавт. [42] показано, что уровень МПО в крови у пациентов с заболеваниями сердца оказался выше контрольного. Более того, повышенный уровень МПО у пациентов с болью в груди значимо коррелировал с развитием крупных неблагоприятных коронарных событий в течение последующих 6 мес. Следует отметить, что содержание МПО в плазме крови оказалось более информативным показателем, чем содержание С-реактивного белка.

Известно, что нестабильность и разрыв атеросклеротической бляшки являются основными неблагоприятными процессами в развитии острых сердечно-сосудистых событий. МПО может играть определенную роль в дестабилизации атеросклеротической бляшки путем активации металлопротеиназ, тем самым ослабляя ее фиброзную капсулу [39]. В экспериментах in vitro было показано, что МПО может переводить липопротеины низкой плотности в так называемую атерогенную, легко захватываемую макрофагами форму за счет окисления лизиновых остатков и нитрирования аполипопротеина В-100 и инициации ПОЛ [36]. Кроме того, МПО может переводить липопротеины высокой плотности в дисфункциональную форму за счет нитрирования и хлорирования тирозиновых остатков в аполипотеине A-1, нарушая тем самым клеточный транспорт холестерина. Предполагают, что таким образом МПО может способствовать возникновению и росту атеросклеротической бляшки [31].

МПО может участвовать в развитии нестабильности бляшки. В опытах in vitro было показано, что низкие концентрации генерированного МПО гипохлорита вызывают активацию эндотелиоцитов, сопровождающуюся увеличением экспрессии Р-селектина и тканевого фактора, что приводит к повышению тромбогенности эндотелиальной поверхности [26]. Патоморфологическое исследование поврежденных бляшек у внезапно умерших больных показало солокализацию МПО и гипохлорит-модифицированных белков, ассоциированных с внутрикоронарными тромбами [44]. Предполагают также, что за счет потребления эндогенного NO в качестве субстрата МПО может участвовать в развитии дисфункции эндотелия, являющейся одним из ранних изменений атерогенеза и характеризующейся развитием анормальной сосудистой реактивности и экспрессией различных провоспалительных и протромботических факторов [14].

В экспериментальных работах R. Weston и соавт. [45] и M. Breckwoldt и соавт. [19] получены данные, что МПО в достаточно большом количестве присутствует в ишемической ткани мозга, и ее концентрация коррелирует с размером пораженной зоны. С этой точки зрения МПО может рассматриваться как один из наиболее точных диагностических параметров прогрессирования ишемии.

Альфа-липоевая кислота (α-ЛК; тиоктовая кислота) является природной простатической группой в -кетокислотном дегидрогеназном комплексе митохондрий и играет важнейшую роль в метаболизме. Показано, что α-ЛК влияет на клеточные метаболические процессы in vitro, может влиять на редокс-статус клеток и взаимодействовать с тиолами и другими антиоксидантами [15, 24]. Дитиоловая природа α-ЛК делает ее высоко активной против ряда свободных радикалов и одновременно способствует регенерации окисленных антиоксидантов [15, 30, 33, 37].

К образованию свободных радикалов приводят самые различные виды реакций. Выше отмечалось, что в качестве ответной реакции на воспалительную стимуляцию высокореактивными кислородными ионами происходит резкое респираторное увеличение количества нейтрофилов. Образуется супероксид, который в присутствии супероксиддисмутазы образует Н₂О₂. Далее он конвертируется в НОСl под действием МПО. Выяснено, что α-ЛК обладает способностью к очищению как от Н₂О₂, так и НОСl [18, 21, 33, 40]. Следовательно, α-ЛК обладает важным терапевтическим потенциалом в состояниях, сопровождающихся окислительным стрессом.

По данным экспериментальных исследований и клинических испытаний, проведенных в последние 5 лет с использованием больших доз α-ЛК, были получены новые данные об эффективности этого препарата в лечении не только инсулинорезистентности и диабетической полинейропатии, но и инсульта [330, 41].

Использование «традиционных» факторов риска позволяет оценить вероятность сердечно-сосудистых катастроф лишь в половине случаев, а исследование факторов воспаления и эндотелиальной дисфункции при ишемии мозга может быть использовано в качестве дополнительных маркеров оценки как угрозы развития инсульта и прогрессирования хронической цереброваскулярной патологии, так и эффективности лечебных стратегий.

С учетом вышесказанного нами была поставлена цель настоящего исследования: изучить уровень МПО в острейшей стадии инсульта и проследить его изменение после проведенного курса антиоксидантной терапии.

В качестве антиоксидантного препарата была выбрана α-липоевая кислота.

В исследование были включены 55 человек: 45 больных с ишемическим инсультом давностью не более 48 ч в возрасте от 49 до 78 лет (средний - 61,2±8,8 лет) и 10 условно здоровых лиц, составивших контрольную группу.

Больные с инфарктом мозга были разделены на 2 группы. Пациенты 1-й группы получали базовую терапию инсульта гипотензивными, антиагрегантными, кардиальными и вазоактивными средствами. Пациенты 2-й группы получали дополнительно к базовой терапии препарат α-ЛК берлитион - по 300 мг в разведении на 200 мл физиологического раствора внутривенно капельно ежедневно в течение 10 суток. Исследование лабораторных маркеров окислительного стресса проводили до начала лечения (при поступлении в стационар - 1-е сутки) и после его окончания (10-е сутки).

Количественное определение содержания МПО в крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) проводили в соответствии с протоколом по стандартной методике, используя набор BenderMedSystems (Австрия). Кровь забирали утром натощак, центрифугировали (1200 g, 15 мин), полученную плазму разливали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и замораживали при –20 °С. В качестве антикоагулянта использовали гепарин.

Для исследования фагоцитарной активности исходных нейтрофилов использовался метод хемилюминесценции (ХЛ), вспышку ХЛ регистрировали при комнатной температуре на хемилюминометре SMARTLUM 5773 (Россия). Стандартный образец содержал: среду Хенкса (0,42 мМ Na₂HPO₄, 20 мМ KH₂PO₄, 137мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 5 мМ D-глюкозы), буфер активации (1 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺; рН 7,4), нейтрофилы (150 000 клеток), и 10 мкМ люминола. Результат представляли в виде светосуммы за первые 25 мин, начиная с момента добавления буфера активации в присутствии или в отсутствии активатора нейтрофилов (5 мкг/мл ФМА).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 8. В качестве критерия достоверности использовали тест Манна-Уитни для двух несвязанных групп и тест Краскелла-Уоллиса ANOVA для трех и более несвязанных групп. Достоверными принимались значения при р<0,05.

На рис. 3, а представлены результаты определения уровня МПО в плазме крови методом иммуноферментного анализа до лечения.

Известно, что в развитии общего системного воспаления нейтрофилы играют одну из ведущих ролей, являясь, помимо МПО, источником целого ряда гидролитических ферментов. Исходя из этого, представлялось целесообразным проследить развитие воспалительной реакции у больных с ОНМК на изолированных нейтрофилах. Для этого было проведено сравнение фагоцитарной активности исходных (неактивированных) и активированных ФМА нейтрофилов. На рис. 3, б видно, что уровень фагоцитарной активности неактивированных нейтрофилов не различается у группы больных и группы контроля, тогда как при активации нейтрофилов ФМА можно наблюдать достоверные различия (см. рис. 3, в). Этот факт можно объяснить тем, что находясь в системе in vivo, нейтрофилы больных и здоровых прибывают в состоянии отличного друг от друга биологического равновесия. В процессе развития острого ишемического процесса в кровотоке появляется множество факторов активации клеток (АТФ, белки мозгового повреждения и повреждения сосудистой стенки и др.), которые, оказывая влияние на рецепторы и активируя ионные каналы на мембране клеток, делают их кометированными к активации, что мы и наблюдаем при добавлении ФМА. В свою очередь, отсутствие различий в оценке неактивированных клеток можно объяснить одинаковыми и «стерильными» (отсутствие природных активаторов, использование в обоих случаях одних и тех же буферных растворов) условиями проведения эксперимента, а также естественными неблагоприятными воздействиями, которым подвергаются клетки в процессе выделения.

Проведенные ранее клинические исследования показали достоверную взаимосвязь между развитием системной воспалительной реакции и повышением уровня триглицеридов (ТГ) в крови. Причины этого остаются до конца не выясненными, хотя некоторые исследователи [42] связывают этот факт с липолизом жировой ткани, повышением заново синтезированных в печени жирных кислот, а также подавлением их окисления. Полученные нами результаты (см. рис. 3, г) согласуются с данными литературы. Насколько важным окажется изучение этого аспекта в прогнозе дальнейшего развития ишемических повреждений головного мозга и связанного с ним острого и хронического воспаления, может показать последующее динамическое наблюдение данной группы пациентов.

Анализ результатов проведенного лечения (рис. 4) выявил достоверное (р<0,05) снижение уровня МПО в обеих группах пациентов.

Полученные в исследовании результаты свидетельствуют об увеличении концентрации и активности МПО у больных в острейшей стадии ишемического инсульта, а также о высокой чувствительности данного показателя при оценке активности системного воспаления и связанного с ним окислительного стресса. Полученные результаты, а также литературные данные о прогностической роли МПО в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы и дисфункции эндотелия могут служить основанием для оценки МПО-зависимых реакций в увеличении риска развития ОНМК у пациентов с цереброваскулярной патологией.

Регистрируемая при ОНМК активизация системного воспаления и связанного с ним окислительного стресса требует медикаментозной коррекции. Нейропротективное действие α-ЛК, опосредованное через предотвращение повреждающего воздействия свободных радикалов на клеточные мембраны и уменьшение выраженности окислительного стресса, является патогенетическим обоснованием использования препаратов α-ЛК (берлитион) как антиоксидантных средств при ишемическом поражении головного мозга. Критерием эффективности лечения может служить изменение содержания МПО в плазме крови больных.

Полученные в настоящем исследовании результаты и приведенные данные литературы свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения роли воспаления при цереброваскулярной патологии, продолжения поиска маркеров окислительного стресса, а также углубленного изучения эффективности антиоксидантов при данной патологии, в частности нейропротективных свойств α-ЛК.