К настоящему времени описано большое количество мутаций в генах, кодирующих ДНК/РНК-связывающие белки - FUS и TDP-43, которые ассоциированы с развитием бокового амиотрофического склероза (БАС) и лобно-височной деменции (ЛВД) [1-6]. В двигательных нейронах пациентов, несущих мутации в гене FUS, происходит перераспределение в норме имеющего ядерную локализацию белка, и значительная его часть обнаруживается в цитоплазме в виде характерных включений [7-11]. Более того, FUS-реактивные включения были выявлены и у пациентов со спорадическими формами БАС [12], ЛВД [13], заболеваниями с атипичными включениями промежуточных филаментов [14], болезнью Лафоры [15] и болезнью Унферрихта-Лундборга [16], что указывает на их важную роль в развитии нейродегенераций (нейродегенеративного процесса) [17-19].

При этом остается неизвестным, что является первичной и основной причиной патологий, связанных с аномальным функционированием белка FUS: агрегация аберрантной формы белка или же нарушения метаболизма РНК в клетке [20]. Ранее были показаны [21] молекулярные механизмы участия белков FUS и TDP-43 в метаболизме РНК, но агрегация белка FUS с образованием депозитов в поврежденных нейронах никогда не рассматривалась как инициатор прогрессии патологических изменений. Кроме того, в модельных трансгенных организмах со сверхэкспрессией полноразмерного или укороченного FUS с удаленным одним лишь сигналом ядерной локализации не удавалось достичь необходимого уровня агрегации белка и развития выраженной протеинопатии [22-25]. Мы предположили, что для инициации и эффективной агрегации FUS необходимо нарушение связывания этого белка с РНК, приводящее к его накоплению в цитоплазме и образованию патогенных комплексов с другими белками вместо естественного субстрата РНК, а также формированию включений. В результате нами была создана генетическая конструкция, кодирующая аберрантную форму белка FUS с удаленным сигналом ядерной локализации и неспособная к взаимодействию с РНК [2]. Данная конструкция была введена в геном мыши, где благодаря использованию нейронального промотора Thy1 была получена ее экспрессия преимущественно в нервной системе модельных животных. Даже относительно низкий уровень экспрессии аберрантной формы FUS у трансгенных мышей инициировал развитие FUS-протеинопатии с последующим специфическим повреждением двигательных нейронов и появлением клинической картины БАС. Таким образом, нами были получены прямые доказательства ключевой роли дисфункции белка FUS в патогенезе БАС и создана новая трансгенная модель этого заболевания, которая может быть использована как для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, сопровождающих патологию двигательных нейронов, так и с целью разработки эффективной терапии.

Цель работы - создание новой трансгенной модели БАС, в основе молекулярного патогенеза которой лежит патогенная агрегация белка FUS.

Последовательность гена FUS человека, кодирующая укороченную форму белка (аминокислоты с 1-й по 359-ю) была амплифицирована из плазмиды 323-pTSC21k [3] с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой были использованы праймеры, содержащие сайты рестрикции для XhoI: 5'-TCTCGAGCTATGGCCTCAAACGATTATAC-3' и 5'-ACTCGAGTTAGAATTCTTTACCATCAAACC-3'.

XhoI-фрагмент после вырезания из агарозного геля был встроен в вектор 323-pTSC21k по XhoI-сайту, расположеннoму в линкерной последовательности. Ориентацию фрагмента и корректность кодирующей FUS последовательности определяли секвенированием.

Для микроинъекций в пронуклеус использовали раствор плазмидной ДНК (5 нг/мкл), линеаризованной рестрикционной эндонуклеазой NotI и очищенной из агарозного геля. В работе использовались мыши линии C57BL/6xCBA. Мыши в возрасте от 4 до 6 нед (средняя масса 12 г) использовались в качестве доноров яйцеклеток, остальные работы проводились на взрослых мышах. Рекомбинантную ДНК микроинъецировали в пронуклеус зигот мыши на стадии двух пронуклеусов. Инъекцию проводили преимущественно в мужской пронуклеус. Зиготы помещали в камеру, состоящую из двух покровных стекол, закрепленных одно над другим таким образом, чтобы верхний и нижний края капли среды были плоские и параллельные. Визуализировали пронуклеусы с помощью DIC-оптики на микроскопе Axiovert 200 («Zeiss», Германия). Иглы для микроинъекции готовили из стеклянных капилляров G100 («Narishige», Япония) на пуллере P97 (Shutter instruments, США), капилляро-держатель готовили из капилляров GD1 («Narishige», Япония) на пуллере pос-10 («Narishige», Япония) и микрокузнице Mf-900 («Narishige», Япония). После микроинъекции зиготы культивировали в течение 2-3 ч в СО2-инкубаторе IGO 150 («Thermo Electron Corporation», Франция). После культивирования клетки визуально оценивались, и те из них, которые находились в удовлетворительном состоянии, пересаживались самкам-реципиентам. Культивирование яйцеклеток осуществлялось в CO2-инкубаторе при содержании углекислого газа в воздухе 5 и 100% влажности. Культивирование проходило в чашках Петри диаметром 35 мм в каплях размером 50-60 мкл. Сверху капли покрывались легким минеральным маслом категории «embryo tested». Все подготовительные процедуры осуществлялись в ламинарном боксе. Яйцеклетки мышам-реципиентам пересаживали спустя 2-3 ч после микроинъекции. Для этого отбирались жизнеспособные яйцеклетки, пережившие микроинъекцию. Пересадка проводилась хирургически под наркозом Avertin.

Генотипирование трансгенных животных проводили методом ПЦР с использованием праймеров 5'-TCTTTGTGCAAGGCCTGGGT-3' и 5'-AGAAGCAAGACCTCTGCAGAG-3', характерный для трансгенной кассеты фрагмент размером 255 bp выявляли в агарозном геле. Трансген поддерживается в геноме трансгенных мышей в гемизиготном состоянии.

Экспериментальные животные были получены и поддерживались на генетической основе гибридной линии C57Bl/6×CBA. Работы с животными проводили в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (2003).

Выделение тканей, фиксация и приготовление срезов. Подопытных животных подвергали медикаментозной эвтаназии путем внутрибрюшинного введения летальной дозы пентобарбитала натрия (euthatal). Образцы тканей замораживали в жидком азоте или фиксировали для последующего гистохимического анализа в холодном растворе 4% параформальдегидa, проводили дегидратацию образцов в батарее спиртов и хлороформа, после чего заключали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 8 мкм получали с помощью ротационного микротома RM2265 («Leica», Германия) и монтировали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином («Thermo Scientific», Великобритания). Срезы депарафинизировали в ксилоле с последующей регидратацией в серии спиртов понижающейся концентрации.

Иммуногистохимический анализ. Депарафинизированные срезы для иммуногистохимической окраски инкубировали в 3% перекиси водорода в метаноле в течение 30 мин при 4°C, отмывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали в блокирующем растворе ФСБ, содержащем 10% сыворотки лошади и 0,4% Твин 20 (ФСБ-Т) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего инкубировали с первичными поликлональными антителами против FUS (rabbit polyclonal, Abcam; mouse polyclonal, BD Biosciences) в том же блокирующем буфере при комнатной температуре в течение 1 ч.

Препараты отмывали в ФСБ и инкубировали сo вторичными биотинилированными антителами (Vectastain ABC kit, «Vector Laboratories», Великобритания) в ФСБ-Т в течение 1,5 ч, снова промывали в ФСБ и добавляли 3,3-диаминобензидин («Sigma», США), далее инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре и отмывали в воде в течение 5 мин. Дегидратацию срезов проводили в серии спиртов (50, 95 и 100% этанол по 5 мин), осветляли срезы в ксилоле в течение 10 мин, заключали в синтетическую среду DPX (BDH, Великобритания) и подсушивали. Микрофотографии получали при помощи фотокамеры Leica DFS 490 и программного обеспечения Leica Application Suit v. 2.8.1 («Leica Microsystems», Швейцария).

OT-рвПЦР в реальном времени. Tотальную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus (Qiagen), синтезировали комплементарную цепь ДНК в реакции обратной транскрипции с использованием фермента SuperScript III (Invitrogen) и гексамерного рандом-праймера (Promega). ПЦР в реальном времени проводили с полученной кДНК в качестве матрицы в амплификаторе StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems) с использованием набора DyNAmo HS SYBR Green supermix (Finnzymes). Для детекции транскриптов FUS человека использовали праймеры TCTTTGTGCAAGGCCTGGGT и TAATCATGGGCTGTCCCGTT. В качестве внутреннего контроля определяли уровень экспрессии гена GAPDH мыши с использованием праймеров: CACTGAGCATCTCCCTCAC и GTGGGTGCAGCGAACTTTAT.

Иммуноблоттинг. Для анализа белков проводили экстракцию тотального белка из тканей отделов нервной системы. Белки разделяли с помощью электрофореза в ПААГ геле в денатурирующих условиях, переносили на PVDF (поливинилдендифторидную) мембрану (Hybon-P, «Amersham»), используя полусухой метод. После блокировки мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами против FUS человека (rabbit polyclonal, Abcam; BD Biosciences), отмывали и инкубировали с вторичными антителами против иммуноглобулина (Ig) кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham). Визуализацию осуществляли в стандартной ECL-реакции как описано ранее [26]. Мембрану использовали повторно для инкубации с антителами против GAPDH в качестве внутреннего контроля.

Трансгенная кассета: генетическая конструкция, кодирующая аберрантную форму белка FUS человека с удаленным сигналом ядерной локализации и нарушенным РНК-взаимодействием вследствие делеции основной области распознавания и связывания РНК (два С-концевых РНК - связывающих мотива - RGG - боксы (Arg-Gly-Gly) и мотив типа «цинковые пальцы»), была отобрана в качестве основы для создания трансгенной кассеты. Удаление С-концевых доменов, ответственных за конформационную стабильность белковой молекулы FUS, с одновременной делецией сигнала ядерной локализации и нарушением РНК-связывающего участка обеспечивало создание патогенной формы белка F15-FUS с измененной компартментализацией, нестабильной вторичной структурой и высокими агрегационными свойствами (рис. 1, а).

Анализ физико-химических свойств мутантной формы F15-FUS и экспериментальное воспроизведение каскадной агрегации F15-FUS в клеточных культурах подтвердили данные Т.А. Шелковниковой и соавт. [2] и собственные полученные ранее (неопубликованные) данные, свидетельствующие, что данная форма белка способна образовывать с высокой эффективностью FUS-реак­тивные внутриклеточные включения неамилоидного типа, подобные тем, которые обнаруживаются при патогистологическом анализе у больных с FUS-ассоци­ированными формами БАС. Более того, в ряде работ было показано, что другой ДНК/РНК-связывающий белок, имеющий сходную с FUS доменную структуру - TDP-43, который также обнаруживается при некоторых формах БАС в составе патогистологических включений неамилоидного типа, присутствует в составе этих TDP-43-реактивных включений, в основном в модифицированном состоянии [28]: патогенная форма TDP-43 (25 кДа) укорочена и не содержит сигнала ядерной локализации, части РНК-связывающего участка и доменов, ответственных за конформационную стабильность [29]. Эти данные послужили основой для предположения, что именно такие изменения доменной структуры молекулы белка FUS обеспечивают ее патогенность, являясь причиной развития FUS-опатии и последующего прогрессирующего нейродегенеративного процесса.

При получении трансгенной кассеты для модификации генома мыши последовательность кДНК-гена человека, кодирующая укороченную патогенную форму белка F15-FUS, была встроена в вектор 323-pTSC21k с помощью рестрикционных сайтов XhoI (см. рис. 1, а). Использование в составе вектора Thy1 промотора обеспечивает высокий уровень синтеза экзогенного белка во всех отделах нервной системы модельных животных. Плазмидная конструкция была линеаризована с помощью рестриктазы NotI и микроинъецирована в пронуклеус ранних эмбрионов мыши (на стадии двух пронуклеусов), полученных после гормонально индуцированной суперовуляции самок мышей на генетическом фоне F1 [C57Bl/6×CBA], как описано ранее (подробнее см. [30]). После инъекций эмбрионы были подсажены хирургическим путем самкам-реципиентам линии F1 [C57Bl/6×CBA], от которых было получено 29 родившихся после манипуляций и выживших животных, что составляет менее 3% от общего числа подсаженных (968) постманипуляционных эмбрионов и существенно ниже ожидаемого результата (6,9%), рассчитанного исходя из средних значений, определенных по результатам создания других линий трансгенных мышей в Лаборатории трансгенеза (см. таблицу).

Оба выживших первичных трансгенных животных были фертильны и обладали способностью передавать трансгенную кассету по наследству, что было подтверждено генeтическим анализом ДНК при биопсии животных, проведенным методом ПЦР (см. рис. 1, б). Характерный фрагмент размером 255 bp выявлялся в геномной ДНК как первичных трансгенных животных - основателей колоний 6 и 19, так и в ДНК половины их потомков (пример F1 потомка см. на рис. 1, в).

От 2 первичных трансгенов были получены независимые линии трансгенных мышей: mutFUS-6 и mutFUS-19. В каждой из этих линий методом RT-PCR в реальном времени был исследован уровень экспрессии трансгена в тканях отделов нервной системы. Уровень экспрессии трансгена в mutFUS-6 оказался намного ниже, чем в линии mutFUS-19, при этом в линии 19 максимальный уровень экспрессии наблюдался в спинном мозге (рис. 2), что делало данную трансгенную линию пригодной для моделирования нарушений функций двигательных нейронов.

Данные иммуноблоттинга по анализу содержания экзогенного FUS белка человека в тканях трансгенных мышей подтвердили наличие патогенных форм белка в спинном мозге животных, что в свою очередь соответствовало уровням транскрипции трансгена [31].

Таким образом, нами были получены 2 линии трансгенных мышей, у которых с различной эффективностью в тканях нервной системы накапливалась патогенная форма белка FUS человека.

Как и ожидалось, склонная к агрегации F15-FUS форма, к тому же с измененной компартментализацией, инициировала образование нерастворимых фибриллярных структур и формирование патогистологических включений, аналогичных тем, что выявлялись у больных БАС. У взрослых молодых трансгенных животных при иммуногистохимическом анализе препаратов спинного мозга были обнаружены FUS-реактивные цитоплазматические включения (рис. 3, а), которые также были убиквитинированы (рис. 3, б).

У мышей полученной нами линии mutFUS-19 прогрессия FUS-патии приводила к развитию нейродегенеративного процесса с избирательным поражением двигательных нейронов. Начальные стадии FUSопатии протекали бессимптомно, хотя за несколько дней (1-2 дня при средней продолжительности жизни после первых симптомов 5 дней) до появления первых симптомов заболевания трансгенные мыши падали при прохождении теста «перевернутая сетка», отмечались общая вялость и снижение активности животных. У подавляющего большинства сравнительно молодых субъективно внешне здоровых половозрелых животных в возрасте в среднем 108 дней развивались двигательные нарушения, быстро и неуклонно прогрессирующие - последовательный парез нижних, затем верхних конечностей на фоне тремора и общей гипотрофии (рис. 4).

Характерной особенностью модельного заболевания, вызванного FUS-патией, является его стремительная прогрессия после перехода из пресимптоматической в симптоматическую стадию. Так, после появления первых клинических признаков животные погибали в среднем в течение 1 нед, что составляет менее 0,5% от средней продолжительности жизни мышей, хотя в единичных случаях мыши с выраженными симптомами заболевания продолжали жить до 45 дней. При этом следует учитывать, что в большинстве случаев больные животные были подвергнуты гуманной эвтаназии, поскольку не могли самостоятельно питаться и получать воду - таким образом, при использовании методов искусственного поддержания жизни ее продолжительность могла оказаться выше. Похожее течение заболевания характерно и для БАС у человека: отсутствие явно выраженной преклинической стадии (несмотря на протекающий в пораженных мотонейронах нейродегенеративный процесс); быстрое нарастание двигательных нарушений (вплоть до тетраплегии) и мышечных атрофий до стадии, на которой поддержание жизни возможно лишь искусственными методами (гастростомия, дыхательная поддержка). Для БАС у человека, как и для описанных модельных животных, характерна определенная вариабельность возраста больного в периоде дебюта и скорости прогрессирования болезни.

Созданная нами линия мышей mutFUS-19 является первой трансгенной моделью, в которой удалось воспроизвести FUS-патию, характеризующуюся формированием и накоплением зрелых полноценных включений. Предыдущие попытки моделирования FUS-патии оказались менее успешными, поскольку для оверэкспрессии были использованы либо полноразмерный белок FUS человека [32], либо формы белка с единичными мутациями, обнаруженные у больных при наследственных формах БАС [33]. И хотя ряду исследователей удалось воспроизвести гибель нейронов в результате цитотоксичности оверэкспрессируемого белка FUS, при этом у животных не происходило формирования характерных включений и не развивался БАС-подобный фенотип [25].

Прямым доказательством причинной роли FUS-па­тии в развитии нейродегенеративного процесса со специфическим поражением двигательных нейронов является создание трансгенной модели, в которой имеет место лишь единственная молекулярная патология: накопление в нейронах мышей укороченной (1-359) формы белка - F15 человека. Подобное накопление белка FUS в составе патогистологических включений неамилоидного типа характерно для больных БАС. Таким образом, результатом данной работы явилось выявление непосредственного механизма нарушения нормального метаболизма белка FUS, которое приводит к последующему каскадному развитию целого комплекса патологических процессов, заканчивающихся специфической гибелью двигательных нейронов.

Созданная нами трансгенная модель болезни двигательного нейрона может быть применена для разработки и тестирования новых методов патогенетической терапии БАС.

Работа выполнена на базе Трансгенбанка Института биологии гена РАН при финансовой поддержке грантов «Фундаментальные науки медицине», КОМФИ №3-04-40379-Н13, РФФИ: 14-04-00796_а, 12-04-31371_мол_а, 12-04-01610-а, РНФ 2014-2016 (14-14-01138).