В последние годы широкое распространение приобрела концепция мягкого когнитивного снижения (МКС; англ.: mild cognitive impairment — MCI). Этот синдром представляет собой состояние, переходное между физиологическим, обусловленным старением, снижением познавательных функций и начальной (доклинической) стадией болезни Альцгеймера (БА) [1]. Синдром МКС характеризуется пограничным расстройством когнитивных функций, в том числе памяти, однако степень их проявления не позволяет диагностировать деменцию или БА. К настоящему времени остается неясным, является синдром МКС начальной (доклинической) стадией БА или самостоятельным расстройством. У 40% больных после установления диагноза МКС в течение 3 лет может быть диагностирована БА, а в течение 10 лет БА развивается более чем у 80% больных, при этом средняя частота перехода МКС в БА составляет 12% больных в год (частота развития БА в общей пожилой популяции составляет 1—2% в год). Распространенность синдрома МКС характеризуется достаточно высокими показателями. Среди пожилого населения Москвы старше 60 лет он составляет около 18% [2].

Установлено [3, 4], что ранняя диагностика синдрома МКС и назначение соответствующих лекарственных средств могут отсрочить наступление деменции или даже способствовать обратному развитию когнитивных расстройств, характерных для начальных этапов БА.

В связи с изучением патогенеза различных заболеваний мозга, включая БА, привлекает внимание роль липидов мозговой ткани [5]. Полученные в последнее десятилетие данные дают представление о тесной связи патогенеза заболевания с нарушением синтеза в мозгу фосфолипидов, холестерина и сфинголипидов [6, 7].

Известно, что центральная нервная система (ЦНС) содержит наибольшее количество липидов по сравнению с другими тканями. Липиды выполняют в ней как структурную, так и функциональную роль в передаче нервного импульса. Особый интерес представляет исследование изменений содержания липидов, и в частности фосфолипидов, при лечении пациентов препаратами, влияющими на липидный метаболизм мозга. В связи с этим фосфолипиды и ферменты их метаболизма могут быть использованы в качестве маркеров эффективности терапии. К таким препаратам относится церетон (альфосцерат холина) который является лекарственным средством с доказанным положительным влиянием у пожилых пациентов с когнитивными нарушениями [8].

Церетон является ноотропным препаратом, холиномиметиком центрального действия с преимущественным влиянием на ЦНС. Высвобождение холина из активного вещества происходит в головном мозге; холин участвует в биосинтезе ацетилхолина — одного из основных медиаторов нервного возбуждения. Альфосцерат биотрансформируется до глицерофосфата, который является предшественником фосфолипидов. Холиновая группа включена в состав фосфатидилхолина, сфингомиелина и лизофосфатидилхолина, метаболические пути которых пересекаются в процессе синтеза. На рис. 1 представлены основные пути метаболизма холина в процессе синтеза холинсодержащих фосфолипидов.

Несколько клинических исследований [2—12] показали эффективность и безопасность применения церетона в лечении когнитивных нарушений, снижения памяти и поведенческих реакций у пациентов с острым ишемическим инсультом и хроническим нарушением мозгового кровообращения.

Церетон увеличивает церебральный кровоток, усиливает метаболические процессы и активирует структуры ретикулярной формации головного мозга, а также восстанавливает сознание при травматическом поражении головного мозга [9, 13]. Он оказывает также профилактическое и корректирующее воздействие на факторы инволюционного психоорганического синдрома, такие как изменение фосфолипидного состава мембран нейронов и снижение холинергической активности.

Основываясь на данных о фармакологических эффектах церетона и доказательствах его эффективности при лечении когнитивных расстройств различного генеза, в том числе при БА, предположили, что этот препарат может быть использован в рамках новых превентивных стратегий при БА при условии уточнения его клинических и биологических эффектов у пожилых с синдромом МКС амнестического типа (aМКС), т. е. у больных с предположительной додементной стадией деменции альцгеймеровского типа.

Цель исследования — определение эффективности и безопасности лечения церетоном нарушений когнитивного функционирования у пациентов с синдромом aМКС и определение его влияния в процессе лечения (3 мес) и после его окончания на изменение содержания фосфатидилхолина, сфингомиелина, церамида — метаболита сфинголипидов и активность контролирующих метаболизм сфингомиелина и церамида ферментов (сфингомиелиназы и церамидазы) генов.

Обследовали 20 пожилых пациентов (14 женщин и 6 мужчин) в возрасте от 51 года до 82 лет (средний 70,3±9,1 года).

Состояние пациентов соответствовало критериям диагностики синдрома аМКС: а) жалобы больного на легкое снижение памяти, подтверждаемые информантом (обычно членом семьи), и объективно выявляемые признаки легких когнитивных дисфункций (в тестах на исследование памяти и тех когнитивных сфер, которые явно нарушаются при БА); б) признаки когнитивного дефицита соответствуют 3-й стадии по шкале Global Deterioration Scale (GDS) и оценке 0,5 по шкале Clinical Dementia Rating (CDR). Оценка по шкале MMSE 26 баллов и более, по шкале Хачински — до 4 баллов.

Критериями исключения являлись: 1) диагноз деменции альцгеймеровского типа (по критериям DSM-IV, МКБ-10); 2) неврологические заболевания (врожденные и/или приобретенные метаболические энцефалопатии, токсические и лекарственные энцефалопатии, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, инсульт, эпилепсия, инфекционные заболевания, демиелинизирующие и наследственно-дегенеративные заболевания ЦНС); 3) неопластические и/или травматические повреждения головного мозга; 4) системные заболевания; 5) психические заболевания; 6) тяжелая органная патология, злокачественные экстрацеребральные опухоли, ВИЧ-инфекция, сахарный диабет в стадии декомпенсации или другие эндокринные заболевания; 7) алкоголизм и/или лекарственная зависимость; 8) медикаментозная или иная интоксикация; 9) более 18 баллов по шкале Гамильтона для депрессии; 10) уровень систолического артериального давления более 180 мм рт.ст., диастолического — более 95 мм рт.ст.; 11) дефицит фолиевой кислоты и/или витамина В₁₂.

От всех больных было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Пациентам церетон (фирмы «Сотекс») назначали в дозе 400 мг 3 раза в день (1200 мг в сут). Продолжительность курса терапии составляла 90 дней. Через 3 мес после окончания лечения было проведено контрольное обследования пациентов.

Взятие крови проводилось у каждого больного до лечения, после лечения и через 3 мес после окончания курса терапии.

Во время основной терапии не разрешалось применение препаратов, оказывающих модулирующее действие на состояние когнитивных функций, в том числе ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов NMDA-рецепторов, пептидных препаратов, антиоксидантов, ноотропов, нейролептиков и антидепрессантов.

Сопутствующая терапия по поводу острых или хронических заболеваний могла быть продолжена во время исследования в соответствии с показаниями. Информация о сопутствующих лекарственных препаратах и процедурах (торговое название, дозировка или изменения дозировки, показания, дата начала, дата прекращения) заносилась в карту больного.

Оценка состояния пациентов проводилась за неделю до начала исследования — скрининговый визит; непосредственно до начала исследования — 1-й визит (исходный); в период лечения — 2-й визит (промежуточный, 45-й день); в конце исследования — 3-й визит (заключительный, 90-й день); после исследования — 4-й визит (контрольный, 180-й день).

Клиническая оценка эффективности приема препарата была проведена по динамике изменения когнитивных и функциональных показателей. Подробные результаты клинических исследований были представлены ранее [14].

Определение влияния приема церетона при аМКС на изменение содержания фосфатидилхолина, сфингомиелина, церамида (метаболит сфинголипидов) и активность генов, контролирующих синтез ферментов, которые участвуют в метаболизме сфингомиелина и церамида (сфингомиелиназы и церамидазы), было проведено с применением следющих методов.

Количественный анализ суммарных фосфатидилхолинов, сфингомиелинов и церамидов в плазме крови пациентов с диагнозом aМКС до и после лечения осуществляли с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Экстракция липидов из плазмы крови проводилась по методу T. Bligh, W. Dyer [15].

Разделение фосфолипидов для определения содержания фосфатидилхолинов и сфингомиелинов выполняли методом одномерной тонкослойной хроматографии на стеклянных пластинках для ВЭТСХ размером 10×10 см с закрепленным слоем силикагеля («Merck», Германия). Хроматографию фосфолипидов проводили в системе растворителей хлороформ—метанол—муравьиная кислота (65:25:4, v/v/v). В качестве стандартов использовали фосфолипиды (СФМ и фосфатидилхолин, «Sigma», США).

Для разделения церамидов применяли две системы растворителей: сначала хроматографию проводили в этиловом эфире до высоты, условно принятой за единицу, затем — в системе хлороформ—метанол—вода (40:10:1, v/v/v) на 2/3 от первоначальной высоты.

Образцы наносили в виде точек или полосок микрошприцем из расчета 10—20 мкг соответствующего липида в пробе. После хроматографии пластинки сушили в вытяжном шкафу до исчезновения запаха растворителей.

Липидные пятна идентифицировали по расположению липидных пятен стандартов. Для их идентификации высушенные пластинки окрашивали опрыскиванием хроматограммы 10% раствором CuSO₄ в 8% фосфорной кислоте с последующим нагреванием при t=160 °С в течение 10 мин. Анализ хроматограмм проводили сканированием и денситометрированием с помощью программы Sorbfil TLC. Расчет количества сфинголипидов в пробе производили в микрограммах фосфолипида общего фосфора в липидной пробе (P).

Экспрессию генов, кодирующих метаболизм сфинголипидов, исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Для исследования использовали венозную кровь, которую собирали в пробирки с антикоагулянтом (на 1 мл крови 0,1 мл раствора 2,7% соли ЭДТА рН 7,2—7,4). Процедуры осуществляли в стерильных условиях при комнатной температуре. Цельную кровь разводили раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в соотношении 1:3, наслаивали на раствор фиколла-верографина (1,077) и центрифугировали 40 мин при ускорении 400 g. Мононуклеарные клетки дважды отмывали путем центрифугирования (10 мин, 1000 об/мин) в избытке ФСБ и ресуспензировали в полной среде RPMI 1640, содержащей: 10% эмбриональной коровьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 мМ HEPES pH7,2. Количество мононуклеарных клеток подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность клеток определяли по окраске трипановым синим.

Выделение тотальной РНК из клеток осуществляли реагентом TRIzol («Invitrogen», США) по протоколу фирмы-производителя.

Для синтеза кДНК проводили реакцию с обратной транскрипцией с использованием фермента Mint («Евроген», Россия) по стандартному протоколу фирмы-производителя с использованием поли (Т)-праймера.

ПЦР проводили в термоциклере CX96 («BioRad», США). Реакционная смесь объемом 12,5 мкл содержала: 1 мкг кДНК, 2,5 мкл готовой 5-кратной реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия), в состав которой входили Taq ДНК-полимеразы со специфическими моноклональными антителами, краситель SYBR Green I, смесь нуклеотидтрифосфатов, MgCl₂, ПЦР-буфер, и по 10 пМ каждого из двух специфичных олигонуклеотидов.

Протокол амплификации включал: один цикл продолжительностью 4 мин денатурации при 94 °C, 40 циклов — по 20 с при 94 °C для денатурации цепей ДНК, по 20 с при 50—72 °С для отжига праймеров с матрицей, по 40 с при 72 °С для синтеза комплиментарных цепей ДНК и один цикл завершающего синтеза в течение 3 мин при 72 °C.

Расчет относительного уровня мРНК целевых генов выполняли с использованием deltaCT-метода. Относительная концентрация субстрата была нормализована данным амплификации эндогенного гена сравнения Actin: deltaCT=CT (targetgene) — CT (referencegene), где СТ — количество циклов, требуемых для достижения порогового значения флуоресценции. Относительный уровень мРНК вычисляли как х·delta CT, где х — эффективность праймеров. Все реакции проводили в двух повторностях, включали негативный контроль без ДНК-полимеразы.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для описания выборочного распределения количественных признаков, распределенных по отличному от нормального закону распределения, использовалась медиана (Ме), верхний (Q₁) и нижний квартили (Q₃) (интерквартильный размах). Для сопоставления двух групп по количественным признакам применяли непараметрические методы статистического анализа — критерий Вилкоксона для связанных групп.

Проведение данной работы соответствовало Хельсинкской декларации (1975) и ее пересмотренному варианту (2000) и этическим стандартам комитетов по исследованиям на человеке, входящих в состав учреждений, в которых выполнена работа.

При анализе результатов оценки эффективности лечения выявлено статистически значимое улучшение показателей когнитивного функционирования по шкале MMSE, Бостонскому тесту называния и тесту рисования часов, тесту прямого и отсроченного воспроизведения 10 слов, вербальным и категориальным ассоциациям (р<0,05, критерий Вилкоксона). Эти данные были представлены в ранее опубликованной работе [14].

Анализ пролонгированного действия церетона (через 3 мес после окончания курса терапии) показал, что у 13 (65%) пациентов состояние оставалось стабильным, у 6 (30%) отмечалось легкое когнитивное снижение, у 1 (5%) развилось состояние деменции.

На рис. 2 представлены изменения в содержании суммарных фосфатидилхолинов в плазме крови здоровых и пациентов с аМКС до и после лечения церетоном.

Анализ фофсфолипида проводился у пациентов после 3-месячного курса лечения церетоном сразу после окончания терапии и через 3 мес после ее завершения.

В результате при аМКС наблюдали резкое снижение уровня фосфатидилхолина по сравнению с его содержанием в плазме крови здоровых. 3-месячный прием препарата приводит к резкому повышению содержания фосфатидилхолина в плазме крови пациентов до уровня здоровых и держится на таком же высоком уровне спустя 3 мес после окончания курса терапии (6 мес от начала лечения). Эти данные свидетельствуют об эффективности церетона, который способствует нормализации уровня фосфатидилхолина в плазме крови пациентов. Через 3 мес после прекращения приема препарата положительный эффект сохраняется, т. е. действие препарата носит пролонгированный характер.

На рис. 3 представлен характер изменения содержания общих сфингомиелинов в плазме крови пациентов с аМКС до лечения, после 3-месячной терапии церетоном и через 3 мес после окончания приема препарата. У отдельных пациентов уровень сфингомиелина понижался в ходе лечения, у других, напротив, повышался, т. е. определенного направления изменений этого фосфолипида не наблюдали. Средние значения указывают, что эти изменения недостоверны и практически совпадают с контрольными значениями. Полученные результаты могут означать, что при развитии аМКС у пациентов имеются механизмы, обеспечивающие стабильность содержания сфингомиелинов, которые резко уменьшаются при БА [7].

Церамид является продуктом гидролиза сфингомиелина ферментом сфингомиелиназой, которая содержится во всех клетках [16—18]. Церамид обладает множеством сигнальных функций и участвует в синтезе других сигнальных молекул сфингомиелинового цикла как с апоптотическими, так и антиапоптотическими свойствами [19]. При развитии БА его содержание в плазме крови увеличивается. Однако при других заболеваниях возможно превращение церамида в фосфорилированный аналог сфингозина (сфингозин-1-фосфат), который обладает антиапоптотическими свойствами [20].

При анализе содержания церамидов в плазме крови пациентов, прошедших лечение церетоном, было обнаружено повышение их содержания в плазме крови как до терапии церетоном, так и после нее (рис. 4). Повышение содержания церамида в ходе лечения может сопровождаться изменением баланса проапоптотических и апоптотических свойств метаболитов сфингомиелина. Однако до сих пор не известно, что происходит с церамидом в клетках мозга. Возможно, при лечении церетоном его содержание уменьшается.

Как указывалось выше, определение влияния церетона на уровень экспрессии генов кислой сфингомиелиназы и кислой церамидазы определяли методом OT-ПЦР в предварительно выделенных мононуклеарных клетках крови пациентов с диагнозом aМКС. На рис. 5 представлен характер изменения экспрессии гена, контролирующего синтез кислой сфингомиелиназы. Этот фермент расщепляет сфингомиелин до фосфохолина и церамида [17]. Изображен характер изменения экспрессии гена кислой сфингомиелиназы у здоровых, пациентов с аМКС до лечения, после 3-месячного курса приема церетона и через 3 мес после окончания курса терапии. Патология аМКС сопровождается повышением среднего уровня экспрессии исследуемого гена, через 3 месяца приема препарата наблюдается снижение экспрессии гена этого фермента, однако через 3 мес после прекращения курса терапии процесс возвращается к исходному уровню, который был зафиксирован у пациентов до лечения.

Церамид, подвергаясь гидролизу церамидазы, превращается в сфингозин, который в свою очередь может подвергнуться фосфорилированию с образованием сфингозин-1-фосфата [21]. Сфингозин так же, как и церамид, является сигнальной молекулой, участвующей в индукции апоптоза [19]. Сфингозин-1-фосфат, в отличие от церамида и сфингозина, блокирует программу апоптоза, тем самым продлевая жизнь клетки [20]. На рис. 6 представлены данные по определению уровня экспрессии гена церамидазы у здоровых и пациентов с МКС до лечения, после 3-месячного курса приема церетона и через 3 мес окончания терапии. Рис. 6 наглядно демонстрирует, что при МКС происходит активация экспрессии гена церамидазы, 3-месячный курс приема препарата вызывает снижение активности, а в последующие 3 мес после окончания курса терапии уровень экспрессии гена возвращается к значениям, определяемым до лечения патологии. Таким образом, активация экспрессии гена церамидазы довольно резко реагирует на лечение пациентов церетоном. Она снижается при непосредственном влиянии церетона, однако через 3 мес после окончания приема препарата вновь возвращается к уровню, зафиксированному у нелеченых пациентов.

Полученные результаты подтверждают ранее полученные данные об эффективности и безопасности применения альфосцерата холина при лечении когнитивных нарушений у лиц с aМКС.

При лечении церетоном пациентов с диагнозом aМКС выявлены значительные изменения в содержании липидов плазмы крови. Обнаружено резкое повышение содержания фосфатидилхолина и умеренный рост содержания церамида — продукта гидролиза сфингомиелина. Количество сфингомиелина практически не меняется.

Резкое увеличение содержания фосфатидилхолина определяется свойствами церетона — источника холиновой группы этого фосфолипида. Наиболее ценным представляется результат, свидетельствующий, что эффект церетона по отношению к содержанию фосфатидилхолина сохраняется спустя 3 мес после окончания курса терапии, т. е. действие является пролонгированным. Анализ фосфатидилхолина в липидах плазмы пациентов в ходе лечения заболеваний ЦНС может служить надежным маркером эффективности терапии.

Высвобождение холина из активного вещества происходит в головном мозге; холин участвует в биосинтезе ацетилхолина и фосфолипидов. Холиновая группа включена в состав фосфатидилхолина, сфингомиелина и лизофосфатидилхолина, метаболические пути которых пересекаются в процессе синтеза (см. рис. 1). Cфингомиелин является источником сигнальных молекул апоптоза (церамида и сфингозина), а также сфигозин-1-фосфата, обладающего антиапоптотическими свойствами [18—20]. Изменение баланса этих метаболитов сфингомиелина чрезвычайно важно как для развития заболевания, так и для его лечении.

В настоящей работе показано, что уровень сфингомиелина практически не отличается от контроля как до лечения aМКС, так и после него. Возможно, что при МКС организм способен управлять биосинтезом сфингомиелина, сохраняя его на контрольном уровне, в то время как при развитии БА происходит его снижение [22]. Этот механизм может реализовываться на генетическом уровне. У здоровых экспрессия гена кислой сфингомиелиназы находится на низком уровне и этот процесс, по-видимому, резко активируется в ходе заболевания. При лечении церетоном экспрессия гена, определяющего ферментативную деградацию сфингомиелина, снижается, а через 3 мес после окончания курса терапии вновь возвращается к уроню, зафиксированному у нелеченых пациентов (см. рис. 5). Это свидетельствует о том, что процесс чувствителен к действию церетона. Возможно, это свойство позволяет контролировать уровень сфингомиелина при aМКС, и именно оно защищает клетки мозга от гибели, которая наблюдается при БА.

Экспрессия гена кислой церамидазы ведет себя аналогичным образом (см. рис. 6). Накопление церамида в ходе лечения церетоном (в течение 3 мес) может определяться резким снижением экспрессии гена церамидазы и, следовательно, снижением его ферментативной деградации. В процессе накопления церамид может вновь превращаться в сфингомиелин или в антиапоптотический продукт сфингозин-1-фосфат. Чтобы понять точный смысл такого тонкого реагирования экспрессии генов метаболизма сфингомиелина при действии церетона и других нейропротекторов, в том числе и при лечении БА, необходимо проведение дальнейших исследований.

Тестирование уровня экспрессии генов метаболизма церамидов в процессе лечения препаратами, влияющими на метаболизм сфинголипидов, можно использовать в качестве объективных маркеров эффективности терапии при лечении пациентов с синдромом aМКС и других нейропатологий.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.