Мальцев А.В.

ГУЗ "Городская клиническая больница №12" ДЗ Москвы

Бородина Ю.В.

ФГБУЗ «Больница Научного центра РАН», Черноголовка, Россия

Скуратовская Л.Н.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», Москва, Россия

Кухарский М.С.

ФГБУ "Институт физиологически активных веществ" РАН, Черноголовка, Московская обл.

Овчинников Р.К.

ФГБУ "Институт физиологически активных веществ" РАН, Черноголовка, Московская обл.;
ФГБУ "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" РАН, Москва

Разинская О.Д.

Смирнов А.П.

Ковражкина Е.А.

Российский государственный медицинский университет;
НИИ цереброваскулярной патологии и инсульта, Москва

Устюгов А.А.

Связь наличия аутоантител к гамма-синуклеину с полиморфизмом в 4-м экзоне кодирующего гена

Авторы:

Мальцев А.В., Бородина Ю.В., Скуратовская Л.Н., Кухарский М.С., Овчинников Р.К., Разинская О.Д., Смирнов А.П., Ковражкина Е.А., Устюгов А.А.

Подробнее об авторах

Просмотров: 804

Загрузок: 10


Как цитировать:

Мальцев А.В., Бородина Ю.В., Скуратовская Л.Н., и др. Связь наличия аутоантител к гамма-синуклеину с полиморфизмом в 4-м экзоне кодирующего гена. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2018;118(9):68‑70.
Mal'tsev AV, Borodina YuV, Skuratovskaya LN, et al. The association of gamma-synuclein autoantibodies with the polymorphism in exon 4 of the coding gene. S.S. Korsakov Journal of Neurology and Psychiatry. 2018;118(9):68‑70. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/jnevro201811809168

Белки семейства синуклеинов вовлечены в ряд патогенетических каскадов. Альфа-синуклеин и гамма-синуклеин в силу своих физико-химических свойств способны агрегировать и формировать цитоплазматические включения как амилоидного, так и неамилоидного типа [1—3]. Травматические повреждения мозга часто сопровождаются посттрансляционными модификациями гамма-синуклеина [4]. Существует предположение, что при нарушении гематоэнцефалического барьера проникновение в кровоток гамма-синуклеина и особенно его аберрантных форм может служить тригером механизмов, приводящих к развитию нейродегенеративного процесса [5, 6]. Для расположенного в локусе 10q23.2—q23.3 гена гамма-синуклеина (SNCG) человека описано несколько полиморфных форм белка гамма-синуклеина, которые являются следствием единичных нуклеотидных замен в кодирующей части [7]. Так, замена нуклеотида A на T в 371-м (из 701) положении транскрипта в 4-м экзоне гена SNCG приводит к замене глутаминовой кислоты на валин в 110-м положении (из 127) кодируемой белковой молекулы [8]. Такая замена существенно меняет физико-химические свойства белка и его способность агрегировать и подвергаться посттрансляционным модификациям. Ранее было показано, что в крови пациентов с различными неврологическими расстройствами в ряде случаев выявляются антитела к гамма-синуклеину [9]. До настоящего времени остается неясным, существует ли корреляция между наличием в геноме полиморфных вариантов белка к гамма-синуклеину и склонностью к развитию определенных патологических процессов. Исследования происхождения таких антител не проводились, как и работы по изучению возможных ассоциаций полиморфизма гена SNCG с развитием заболеваний.

Цель исследования — анализ полиморфизма в 4-м экзоне гена гамма-синуклеина (SNCG) у пациентов, в крови которых были выявлены антитела к белку гамма-синуклеина.

Материал и методы

Для анализа были отобраны пациенты, которые наблюдались неврологом больницы Научного центра Российской академии наук и у которых были обнаружены антитела против белка гамма-синуклеина. Всего выявлено 5 пациентов, все женщины славянской этнической группы в возрасте от 56 до 65 лет (средний возраст 61±5 лет). Больные не являются родственниками. Две пациентки обратились с жалобами на несистемное головокружение, головные боли умеренной интенсивности, снижение фона настроения, нарушения памяти на текущие события, рассеянность внимания. В неврологическом статусе наблюдалась рассеянная неврологическая симптоматика в виде рефлексов орального автоматизма, ослабления конвергенции и аккомодации, осевой диссоциации рефлексов. После лабораторного и функционального исследований установлен диагноз хронической ишемии мозга. В 3 случаях пациентки жаловались на боли в верхних конечностях и шее, ощущения непостоянного онемения пальцев рук, утомляемость. При осмотре определялись признаки рефлекторно-тонических проявлений. Пирамидных знаков, нарушений чувствительности, снижения силы в верхних конечностях не выявлено. Рентгеновские снимки шейного отдела позвоночника выявили дегенеративно-дистрофические изменения шейного отдела (остеохондроз) позвоночника.

Для генетического исследования выделяли геномную ДНК методом фенольной экстракции из венозной крови, как описано ранее [10]. Кратко, 1 мкг ДНК использовали для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) 4-го экзона гена SNCG с помощью пары праймеров 5’-TTGAGGCCAGGGTAGACAAG-3’ и 5’-CCACTCAGGTTCAGGGTTAG-3’ по программе: 94 °C 2 мин 1 цикл; затем 45 циклов: 94 °C 15 с, 58 °C 30 с, 72 °C 40 с и получали фрагмент размером 330 пар нуклеотидов (п.н.). Реакцию расщепления ДНК рестрикционной эндонуклеазой HphI проводили в той же ПЦР-смеси после добавления буфера, рекомендованного для HphI производителем, и анализировали фрагменты ДНК в 3% агарозном геле. Для определения первичной последовательности нуклеотидов в ДНК проводили очистку амплифицированных при ПЦР фрагментов с помощью наборов Cleanup Mini («Евроген») и выполняли секвенирование в компании «Евроген».

Результаты и обсуждение

Наличие в сыворотке крови антител к белку гамма-синуклеину наблюдается менее чем в 10% случаев [9]. Из всех известных полиморфизмов в гене SNCG наиболее выраженные различия во вторичной структуре гамма-синуклеина и, возможно, в кинетике его агрегации и посттрансляционных модификаций получаются вследствие неконсервативной замены валина на глутамин в 110-м положении белковой молекулы, обусловленной заменой нуклеотида Т нa A (T371A) в 4-м экзоне гена SNCG. Поэтому нами было исследовано распределение аллелей T371 и А371 у 5 больных с выявленными антителами к этому белку. Выделенные из венозной крови препараты ДНК были использованы в качестве матрицы для ПЦР-амплификации 4-го экзона гена SNCG с последующим расщеплением полученного фрагмента рестрикционной эндонуклеазой HphI. Сайтом узнавания этой эндонуклеазой является последовательность GGTGA (8/7)^, и замена, А на Т в GGTG (A/T)GGCAT участке 4-го экзона приводит к утере сайта узнавания HphI. В случае аллеля Т371 полученный при ПЦР фрагмент размером 330 п.н. не расщепляется. В случае же аллеля А371 выявляются два продукта расщепления HphI размером 193 и 137 п.н. (рис. 1).

Рис. 1. Анализ полиморфных форм 4-го экзона гена SNCG у больных с антителами против гамма-синуклеина: фрагменты ДНК, амплифицированные при ПЦР, после расщепления эндонуклеазой HphI; разделение в 2% агарозном геле. К — контрольная ДНК здорового донора; 15, 19, 20, 22, 23 — ДНК пациентов с антителами против гамма-синуклеина. Нативный фрагмент размером 330 п.н. соответствует аллелю Т371 (Val110), фрагменты 193 п.н. и 137 п.н. — аллелю А371 (Gln110). ПЦР — полимеразная цепная реакция.
Проведенный анализ показал, что все 5 пациентов оказались носителями аллеля А371 в гомозиготном состоянии. В качестве контроля использована ДНК здорового донора, который является носителем обоих аллелей, поэтому продукты реакции расщепления амплифицированного 4-го экзона содержат фрагменты размером 193 и 137 п.н., характерные для аллеля А371, и не расщепляемый рестрикционной эндонуклеазой HphI фрагмент размером 330 п.н., характерный для аллеля Т371 (см. рис. 1). В европейской популяции частота аллеля А371 составляет 77%, при этом гомозиготный вариант А371/А371 обнаруживается в 59% случаев [11]. Проведенное в целях подтверждения установленных генотипов и выявления других возможных вариаций структуры 4-го экзона SNCG у обследованных больных секвенирование 4-го экзона, амплифицированного при ПЦР, подтвердило гомозиготность аллеля А371 в ДНК всех 5 пациентов (рис. 2).
Рис. 2. Результаты анализа первичной последовательности 4-го экзона у пациентов с антителами к гамма-синуклеину. Участок полиморфных вариантов в положении 371 (обозначен серым цветом). В ДНК всех 5 пациентов детектирован единственный вариант аллеля А371, соответствующий глютамину в 110-м положении белковой молекулы гамма-синуклеина.
Других мутаций и известных полиморфизмов в 4-м экзоне гена SNCG выявлено не было, все последовательности оказались идентичными. По-видимому, появление антител не связано с наличием в геноме более редкой полиморфной формы этого белка. Небольшой размер выборки не позволяет строго утверждать, что наличие антител к белку гамма-синуклеину характерно только для носителей аллеля А371 в гомозиготном состоянии, а наличие другого варианта белка снижает риск выработки антител, по крайней мере, до титра, определяемого методом иммуноблоттинга. Однако полученный нами результат является достаточным основанием для углубленного и расширенного исследования полиморфных вариантов гена SNCG у больных с различными заболеваниями, сопровождающимися поражением нейронов, поскольку именно в нейронах обнаруживается наиболее высокое содержание гамма-синуклеина.

Работа выполнена в рамках государственного задания ИФАВ РАН. Секвенирование образцов проведено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 16−34−00530). Для анализа ДНК пациентов использовано оборудование ЦКП ИФАВ РАН. Группа больных — носителей антител против гамма-синуклеина была отобрана по результатам ранее проведенного в 2015—2016 гг. совместного исследования, поддержанного Соглашениями с Федеральным государственным бюджетным учреждением здравоохранения «Больница Научного центра» РАН, Черноголовка, 142432.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: maltsevandro@mail.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.