Болезнь Фридрейха (БФ) — самая распространенная аутосомно-рецессивная атаксия, в большинстве случаев обусловленная гомозиготным носительством GAA-экспансии (более 33 повторов) в 1-м интроне гена фратаксина (FXN). Примерно в 1—5% случаев заболевание связано с компаунд-гетерозиготным носительством GAA-экспансии и точковой мутации либо делеции в кодирующей области гена [1]. Распространенность заболевания в различных популяциях Западной Европы составляет от 1:20 000 до 1:125 000, частота гетерозиготного носительства — от 1:60 до 1:120 [2]. В российской популяции БФ встречается в 34,7% среди всех случаев атаксий с аутосомно-рецессивным типом наследования [3].
Фратаксин представляет собой белок (23 кДа), состоящий из 81—210 аминокислотных остатков, локализованный в митохондриальном матриксе и связанный с внутренней мембраной митохондрий [4]. Фратаксин играет важную роль в обмене железа и формировании железосерных кластеров, защите клетки от окислительного стресса, регуляции энергетического обмена, кальциевого и нейротрансмиттерного гомеостаза, поддержании мембранного потенциала, участвует в аксональном транспорте и фолдинге нейрональных белков. Показано, что нарушение структуры фратаксина приводит к митохондриальной дисфункции вследствие нарушения работы дыхательной цепи митохондрий и окислительного фосфорилирования [5]. Таким образом, по своей патофизиологии БФ является митохондриальным заболеванием.
Клиническая картина БФ характеризуется широким спектром неврологических и экстраневральных проявлений. Чаще болезнь дебютирует в возрасте 5—25 лет, ведущим симптомом является смешанная (мозжечковая и сенситивная) атаксия, реже первыми проявлениями становятся ранний прогрессирующий сколиоз и бессимптомные изменения на электрокардиограмме (ЭКГ). Клиническое течение вариабельно, но, как правило, спустя 10—15 лет после дебюта заболевания утрачивается способность ходить, стоять, сидеть без поддержки. Первыми гибнут нейроны спинальных ганглиев, затем развивается вторичная дегенерация задних канатиков спинного мозга, ядер Голля и Бурдаха, спиноцеребеллярных и пирамидных путей, гибель нейронов зубчатых ядер и коры мозжечка. В связи с этим клиническая картина БФ характеризуется прогрессирующей статико-локомоторной атаксией, мозжечковой дизартрией, глазодвигательными и вестибулярными нарушениями, потерей проприоцептивной и вибрационной чувствительности, арефлексией в сочетании с пирамидными симптомами и парезами. Возможно также поражение других проводящих путей (например, слухового, зрительного и др.) [6]. При магнитно-резонансной томографии головного мозга атрофия мозжечка выявляется лишь на поздних стадиях, однако раньше и четче отмечается умеренная атрофия ствола головного мозга и спинного мозга. С течением заболевания, как правило, развиваются экстраневральные проявления: гипертрофическая кардиомиопатия (КМП), сахарный диабет (СД), сколиоз, деформации стоп.
КМП является основной причиной смерти пациентов с БФ вследствие декомпенсации сердечной недостаточности и/или развития жизнеугрожающих аритмий с внезапной сердечной смертью. При морфологическом исследовании обнаруживают гипертрофию кардиомиоцитов с очагами некроза, диффузный фиброз миокарда, а также воспалительную инфильтрацию, рубцевые изменения и агрегаты железа [7]. Проявления КМП мало коррелируют с тяжестью неврологической симптоматики, однако выявлена положительная корреляция выраженности КМП с возрастом дебюта БФ и длиной GAA-экспансии [8]. Стоит отметить, что развитие неврологических расстройств характеризуется более последовательным вовлечением структур и неуклонным прогрессированием, чего нельзя сказать о поражении сердца. Кардиальная симптоматика может манифестировать как совместно с неврологическими расстройствами, так и быть значительно отсроченной, она может быстро прогрессировать до летального исхода, а может и длительное время оставаться в стабильном состоянии [9]. Таким образом, можно предположить мультифакторный генез развития КМП при БФ.
Другим жизнеугрожающим и инвалидизирующим проявлением БФ является СД. В крупном исследовании Ashley McCormick СД был выявлен у 9% взрослых и 3% детей с БФ [10]. В исследовании А. Durr и соавт. признаки нарушения углеводного обмена (СД и нарушение толерантности к глюкозе) были выявлены у 32% пациентов [11]. Ключевым звеном патогенеза СД является гибель бета-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы вследствие митохондриальной дисфункции, однако обсуждается и развитие инсулинорезистентности [12]. Выявлена положительная корреляция вероятности развития СД с числом повторов в составе аллеля GAA1 (аллель с меньшей степенью GAA-экспансии), длительностью и тяжестью заболевания [13]. Однако, как и в случае с КМП, только эти факторы не могут объяснить избирательность развития СД при БФ.
Ранее неоднократно была описана связь фенотипа БФ с величиной GAA-экспансии в гене FXN: показана обратная корреляция меньшего по длине аллеля GAA1 с возрастом дебюта, положительная корреляция с тяжестью полинейропатии и толщиной миокарда левого желудочка [14]. Также известна обратная корреляция длины GAA1 аллеля с экспрессией фратаксина [15]. По нашим данным, не менее чем в 24% всех случаев БФ может манифестировать в виде разнообразных атипичных фенотипов — с поздним началом, медленным прогрессированием, отсутствием КМП, сохранностью глубоких рефлексов, спастичностью и т. п., что связывают с относительно небольшой степенью тяжести генетического дефекта (число GAA-повторов менее 350 копий) [16]. Тем не менее длина экспансии может объяснить лишь 50% вариабельности фенотипа, что свидетельствует о наличии других факторов, определяющих клиническую картину заболевания. Обсуждается роль генов-модификаторов, стабилизирующих гексануклеотидных GAGGAA-вставок, соматического мозаицизма, нестабильности экспансии в течение жизни, однако в последние годы все большее значение придается эпигенетическим механизмам, осуществляющим регуляцию экспрессии генов без изменений нуклеотидной последовательности ДНК [17].
Наиболее распространенными эпигенетическими механизмами являются метилирование ДНК, модификация гистонов и регуляция с помощью некодирующих РНК. Значительный фенотипический полиморфизм БФ, широкий спектр экстраневральных проявлений и наличие атипичных форм нельзя объяснить исключительно тяжестью мутации в гене FXN. Таким образом, представляется актуальным изучение роли эпигенетических механизмов и, в частности, метилирования ДНК, в формировании клинической картины БФ.
Цель данной работы — изучение профиля метилирования гена FXN и его влияния на формирование клинической картины БФ.
Материал и методы
Для проведения клинико-эпигенетических сопоставлений были обследованы 17 пациентов с БФ — носителей патологической GAA-экспансии в 1-м интроне гена FXN в гомозиготном состоянии (7 мужчин, 10 женщин), наблюдавшихся в ФГБНУ «Научный центр неврологии» в 2013—2018 гг.
Пациентам был проведен подробный неврологический осмотр с оценкой степени тяжести атаксии по стандартной шкале SARA (Scale for the Assessment and Rating of Ataxia). Для оценки степени выраженности экстраневральных проявлений БФ использовали инструментальные методы: ЭКГ, холтеровский мониторинг ЭКГ, эхокардиографию (ЭхоКГ), также проводили исследование углеводного обмена (уровень глюкозы натощак, пероральный глюкозотолерантный тест, уровень гликированного гемоглобина) с использованием коммерческих наборов согласно инструкции производителя. Для оценки состояния периферической нервной системы всем пациентам была выполнена стимуляционная электромиография (ЭМГ) на аппарате Keypoint (США).
Молекулярно-генетические методы. Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega USA). Наличие экспансии GAA-повторов в гене FXN оценивали методом полимеразной цепной реакции соответствующей области с последующим разделением ампликонов в агарозном геле.
Паттерн метилирования определяли методом прямого секвенирования соответствующих участков ДНК после бисульфитной обработки, в результате которой 5-метилцитозин остается неизмененным и амплифицируется как цитозин, тогда как неметилированный цитозин в результате сульфонирования и последующего гидролитического дезаминирования преобразуется в урацил, который амплифицируется как тимин. Бисульфитную конверсию проводили с помощью набора EZ DNA Methylation Kit («Zymo Research», США) согласно методике производителя.
Была проанализирована промоторная область (524 п.о.) и область 1-го интрона гена FXN, охватывающая 1339 п.о. до GAA-экспансии (UP-GAA) и 736 п.о. после GAA-экспансии (DOWN-GAA). Было суммарно исследовано 45 СрG-сайтов. Для удобства идентификации при дальнейшем анализе все CpG-сайты для каждой области были пронумерованы, начиная от начала каждой области. Степень метилирования в СpG-сайте рассчитывали по отношению высоты синего пика (метилированный цитозин, С) относительно суммарной высоты синего и красного пиков (метилированный и неметилированный цитозин, С+Т) с учетом неэквивалентности нуклеотидного состава секвенированных матриц, модифицированных бисульфитом натрия.
Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании, одобренное локальным этическим комитетом ФГБНУ НЦН.
Статистический анализ осуществляли с помощью программы IBM SPSS Statistics 23 с использованием непараметрических методов статистики.
Результаты
В группе пациентов с БФ медиана возраста на момент обследования составила 28 [22; 33] лет, медиана возраста дебюта 10 [7; 21] лет. Количество GAA-повторов в меньшем аллеле (GAA1) составило 575 [500; 750], в большем (GAA2) — 750 [700; 950]. Положительный семейный анамнез (БФ у сибса) выявлен в одной семье. В целом клиническая картина у большинства пациентов была типичной: статико-локомоторная атаксия смешанного характера (сенситивная и мозжечковая), дизартрия, центральный вестибулярный синдром, снижение или отсутствие глубоких рефлексов, вялые парезы и гипотрофии различной степени выраженности (больше в ногах), рефлекс Бабинского, снижение вибрационной и проприоцептивной чувствительности (преимущественно в ногах), реже — гипестезия по полиневритическому типу. Лишь у 1 пациента отмечена атипичная форма БФ — с сохранными глубокими рефлексами (фенотип FARR). У 2 пациентов заболевание дебютировало в возрасте старше 20 лет (21 год и 24 года). Медианное значение оценки по шкале SARA составило 22/40 [16; 30] баллов, использовать инвалидное кресло на момент исследования были вынуждены 7 пациентов.
У всех пациентов по данным стимуляционной ЭМГ выявлены признаки аксональной сенсорной полинейропатии, у 2 пациентов с наибольшей длительностью заболевания отмечены негрубые признаки демиелинизации сенсорных волокон. В результате комплексного обследования признаки КМП были обнаружены у 6 (35,3%) пациентов. По данным ЭхоКГ выявлены концентрическая гипертрофия левого желудочка и межжелудочковой перегородки с признаками фиброза миокарда (4 пациента из 6), расширение камер сердца (1 пациент из 6). Нарушения ритма и проводимости сердца выявлены у 3 из 6 пациентов и были представлены сочетанием трепетания и фибрилляции предсердий (2 пациента), синоатриальной блокады III степени с атриовентрикулярной блокадой II степени 1-го типа (1), частой желудочковой экстрасистолией (2). Нарушения углеводного обмена выявлены у 3 (17,6%) пациентов (нарушение гликемии натощак — 2 пациента, нарушение толерантности к глюкозе — 1 пациент). Случаев С.Д. выявлено не было. Другими экстраневральными проявлениями были деформации стоп и сколиоз, которые в различной степени выраженности наблюдали у всех пациентов.
Проводили геноэпигенетические корреляции между степенью метилирования CpG-сайтов и количеством GAA-повторов в обоих экспандированных аллелях FXN у пациентов с Б.Ф. Выявлены корреляции для ряда CpG-сайтов в UP-GAA и DOWN-GAA областях обоих аллелей (р<0,05). Данные представлены в табл. 1.
При клинико-эпигенетическом анализе выявлено более раннее начало и более тяжелое течение (оценка суммы баллов по шкале SARA) при гиперметилировании нескольких CpG-сайтов в UP-GAA области гена (р<0,05), данные представлены в табл. 2.
Для выявления предикторов возраста дебюта БФ и тяжести заболевания был проведен линейный регрессионный анализ. В этот анализ были включены такие факторы, как длина экспансии GAA1 и процент метилирования по всем исследуемым сайтам, а также длительность заболевания. Результаты анализа представлены в табл. 3.
Как выявил проведенный анализ, предикторами возраста дебюта явились показатели уровней метилирования 51-го и 55-го СpG-сайтов UP-GAA области. В совокупности эти факторы объясняют 75% дисперсии возраста дебюта БФ (R2=0,75). Предикторами тяжести атаксии по шкале SARA являлись метилирование 51-го сайта UP-GAA и длительность заболевания. Эти факторы объясняют 84% дисперсии балла по шкале SARA (R2=0,84).
В работе оценивали взаимосвязь метилирования и наличия экстраневральных проявлений Б.Ф. Наличие КМП было более вероятно при гипометилировании 5-го CpG-сайта промоторной области (р=0,037) (рис. 1).
Обсуждение
Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических механизмов играет ключевую роль в развитии некоторых неврологических заболеваний, таких как миотоническая дистрофия 1-го типа, синдром ломкой Х-хромосомы и синдром тремора/атаксии, ассоциированный с ломкой Х-хромосомой (FXTAS), синдром Ретта, а также болезней геномного импритинга [18]. В последние годы отмечается увеличение интереса к изучению процесса метилирования ДНК при ряде других нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезней, обусловленных экспансией тандемных повторов.
Необходимо отметить, что исследования, посвященные клинико-эпигенетическим сопоставлениям при БФ, немногочисленны. В работе I. Castaldo и соавт. были исследованы образцы геномной ДНК 67 пациентов с БФ и выявлена прямая корреляционная связь между степенью метилирования пяти СрG-сайтов в UP-GAA области гена FXN и длиной GAA-экспансии, что согласуется с полученными нами данными. В этом же исследовании впервые проведены клинико-эпигенетические сопоставления, при этом выявлена обратная корреляция между метилированием 58-го CpG-сайта UP-GAA и возрастом дебюта заболевания [19]. В крупном исследовании М. Evans-Galea и соавт., включавшем 84 пациента с БФ, были описаны обратные корреляции между степенью метилирования отдельных сайтов UP-GAA области, экспрессией гена FXN и тяжестью заболевания [20]. Выявленные нами корреляции между степенью метилирования нескольких CpG-сайтов, расположенных преимущественно в UP-GAA области, с величиной GAA-экспансии, а также клиническими параметрами (тяжесть атаксии и возраст дебюта) также подтверждают важность гиперметилирования UP-GAA области в формировании фенотипа БФ, однако нуждаются в проверке на большем количестве образцов с оценкой уровня экспрессии фратаксина.
Тем не менее в нашем исследовании впервые продемонстрировано влияние степени метилирования отдельных CpG-сайтов гена фратаксина на развитие экстраневральных проявлений БФ — КМП и нарушений углеводного обмена. В исследовании S. Al-Mahdawi и соавт. изучали степень метилирования нескольких областей гена FXN в образцах миокарда 2 пациентов с БФ и также выявили гиперметилирование некоторых CpG-сайтов UP-GAA области, что может приводить к снижению экспрессии фратаксина, однако малое число пациентов не позволяет проводить каких-либо клинико-эпигенетических корреляций [21]. В другом исследовании, посвященном изучению влияния эпигенетических механизмов на развитие КМП при БФ, была выявлена гиперэкспрессия микроРНК вида miR-132 в фибробластах пациентов с БФ [22]. Ранее была показана роль miR-132 в развитии гипертрофии кардиомиоцитов у крыс [23]. Таким образом, изменение экспрессии miR-132 может быть связано с развитием КМП при Б.Ф. Исследования, посвященные изучению влияния степени метилирования FXN на развитие экстраневральных проявлений, ранее не проводились.
Ключевая роль гиперметилирования 51-го и 55-го CpG-сайтов UP-GAA в формировании клинической картины БФ подтверждена данными линейного регрессионного анализа, что, вероятнее, связано с влиянием именно этих сайтов на уровень экспрессии фратаксина. При этом стоит отметить, что длина экспансии, которая является известным сильным предиктором как дебюта, так и тяжести атаксии, не была установлена в качестве предиктора в данной модели.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о значительном вкладе эпигенетических модификаций гена FXN, кодирующего белок фратаксин, в формирование клинической картины Б.Ф. Результаты исследования могут иметь важное значение для оценки прогноза заболевания, и, возможно, для разработки таргетной терапии, направленной на изменение метилирования ДНК при данном заболевании.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ, номер проекта 17−75−20211.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Сведения об авторах
Нужный Е.П. — https://orcid.org/0000-0003-3179-7668
Абрамычева Н.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-9419-1159
Николаева Н.С. — https://orcid.org/0000-0002-4813-9912
Ершова М.В. — https://orcid.org/0000-0002-8188-5140
Клюшников С.А. — https://orcid.org/0000-0002-8752-7045
Иллариошкин С.Н. — https://orcid.org/0000-0002-2704-6282
Федотова Е.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-8070-7644
Автор, ответственный за переписку: Федотова Екатерина Юрьевна — e-mail: ekfedotova@gmail.com, e-mail: fedotova@neurology.ru