Клинико-генетическое описание нейронального цероидного липофусциноза 6 типа в якутской семье

Читать метаданные

Нейрональный цероидный липофусциноз 6 типа (НЦЛ 6 типа) — это редкое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, относящиеся к группе лизосомных болезней накопления. Проведено клинико-генетическое описание НЦЛ 6 типа в якутской семье. У пробанда и ее сибса наблюдались характерные клинические признаки, включая миоклоническую эпилепсию, атаксию, регресс психомоторного развития, деменцию и нарушение зрения. Дебют болезни в возрасте от 3—4 лет. Заболевание вызвано мутацией c.396dupT (p.Val133CysfsTer18) в 4 экзоне гена CLN6 в гомозиготном состоянии, приводящей к сдвигу рамки считывания, которая была обнаружена с помощью массового параллельного секвенирования. Диагностика НЦЛ затруднена в связи с выраженной генетической гетерогенностью заболевания, а также сходством с другими наследственными метаболическими заболеваниями по клиническим проявлениям. В практику медико-генетического консультирования внедрена методика ДНК-диагностики НЦЛ 6 типа методами массового параллельного секвенирования и прямого секвенирования по Сэнгеру.

Ключевые слова:

нейрональный цероидный липофусциноз

CLN6

массовое параллельное секвенирование

якутская семья

Авторы:

Голикова П.И.

ФГАОУ ВО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»

Петухова Д.А.

ФГАОУ ВО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»

Сухомясова А.Л.

ФГАОУ ВО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»;
ГАУ Республики Саха (Якутия) «Республиканская больница №1 — Национальный центр медицины»

Николаева Т.Я.

ФГАОУ ВО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»

Гуринова Е.Е.

ГАУ Республики Саха (Якутия) «Республиканская больница №1 — Национальный центр медицины»

Иванова Р.Н.

Максимова Н.Р.

ФГАОУ ВО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»

Дата поступления:

06.11.2020

Дата принятия в печать:

22.12.2020

Список литературы:

Guerreiro R, Bras JT, Vieira M, Warrier V, Agrawal S, Stewart H, Anderson G, Mole SE. CLN6 disease caused by the same mutation originating in Pakistan has varying pathology. Eur J Paediatr Neurol. 2013;17:657-660. https://doi.org/10.1016/j.ejpn.2013.04.011
Sheth J, Mistri M, Bhavsar R, Pancholi D, Kamate M, Gupta N, Kabra M, Metha S, Nampoothiri Sh, Thakker A, Jain V, Shah R and Sheth F. Batten disease: biochemical and molecular characterization revealing novel PPT1 and TPP 1 gene mutations in Indian patients. BMC Neurology. 2018;18(203):1-11. https://doi.org/10.1186/s12883-018-1206-1
Ren X-T, Wang X-H, Ding Ch-H, Shen X, Zhang H, Zhang W-H, Li J-W, Ren Ch-H. and Fang F. Next-Generation Analysis Reveals Novel Pathogenic Variants in Four Chinese Siblings with Late-Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis. Fronters in Genetics. 2019;10:1-10. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00370
Kozina AA, Okuneva EG, Baryshnikova NV, Kondakova OB, Nikolaeva EA, Fedoniuk ID, Mikhailova SV, Krasnenko AY, Stetsenko IF, Plotnikov NA, Klimchuk OI, Popov YV, Surkova EI, Shatalov PA, Rakitko AS, Ilinsky VV. Neuronal ceroid lipofuscinosis in the Russian population: Two novel mutations and the prevalence of heterozygous carriers. Mol Genet and Genomic Med. 2020;8(7):1-11. https://doi.org/10.1053/mgg3.1228
Kollman K, Uusi-Rauva K, Scifo E, Tyynelä J, Jalanko A, Braulke Th. Cell biology and function of neuronal ceroid lipofuscinosis-related proteins. Biochim Biophys Acta. 2013;1832;1866-1881. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aac6191
Warrier V, Vieira M and Mole S. Genetic basis and phenotypic correlations of the neuronal ceroid lipofuscinoses. Biochim Biophys Acta. 2013;1832:1827-1830. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2013.03.017
Haltia M, Goebel HH. The neuronal ceroid-lipofuscinoses: A historical introduction. Biochimica et Biophysica Acta. 2013;1832:1795-1800. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2012.08.012
Canelli N, Garavaglia B, Simonati A, Aiello Ch, Barzaghi Ch, Pezzini F, Cilio MR, Biancheri R, Morbin M, Bernardina BD, Granata T, Tessa A, Invernizzi F, Pessagno A, Boldrini R, Zibordi F, Grazian L, Claps D, Carrozzo R, Mole SE, Nardocci N, Santorelli FM. Variant late infantile ceroid lipofuscinoses associated with novel mutations in CLN6. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009;379:892-897. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2008.12.159
Cárcel-Trullols J, Kovács AD, Pearce DA. Cell biology of the NCL proteins: What they do and don’t do. Biochimica et Biophysica Acta. 2015;1852:2242-2255. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2015.04.027
Mole S, Cotman SL. Genetics of the neuronal ceroid lipofuscinoses (Batten disease). Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2015;1852:2237-2241. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2015.05.011
Sharp JD, Wheeler RB, Parker KA, Gardiner RM, Williams RE, Mole SE. Spectrum of CLN6 mutations in variant late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Hum Mutat. 2003;22:35-42. https://doi.org/10.1002/humu.10227
Sato R, Inui T, Endo W, Okubo Y, Takezawa Y, Anzai M, Morita H, Saitsu, Matsumoto N, Haginoya K. First Japanese variant of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis caused by novel CLN6 mutations. Brain Dev. 2016;38:852-856. https://doi.org/10.1016/j.braindev.2016.04.007
Sun G, Yao F, Tian Z, Ma T, Yang Z. A first CLN6 variant case of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis caused by a homozygous mutation in a boy from China: a case report. BMC Med Genet. 2018;19:177. https://doi.org/10.1186/s12881-018-0690-x
Moore SJ, Buckley DJ, MacMillan A, Marshall HD, Steele L, Ray PN, Nawaz Z, Bashkin B, Frecker M, Carr SM, Ives E, Parfrey PS. The clinical and genetic epidemiology of neuronal ceroid lipofuscinosis in Newfoundland. Clin Genet. 2008;74:213-222. https://doi.org/10.1111/j.1399-0004.2008.01054.x
Siintola E, Topcu M, Kohlschütter A, Salonen T, Joensuu T, Anttonen A-K, A-E Lehesjoki. Two novel CLN6 mutations in variant late-infantile neuronal ceroid lipofuscinosis patients of Turkish origin. Clin Genet. 2005;68:167-173. https://doi.org/10.1111/j.1399-0004.2005.00471.x
Lavrov A, Ilyna E, Zakharova E, Boukina A, Tishkanina S. The first three Russian cases of classical, late-infantile, neuronal ceroid lipofuscinosis. European Journal of Paediatric Neurology. 2002;6(3):161-164. https://doi.org/10.1053/ejpn.2002.0584
Рыжкова О.В., Кардымон О.Л., Прохорчук Е.Б., Коновалов Ф.А., Масленников А.Б., Степанов В.А., Афанасьев А.А., Заклязьминская Е.В., Ребриков Д.В., Савостьянов К.В., Глотов А.С., Костарева А.А., Павлов А.Е., Голубенко М.В., Поляков А.В., Куцев С.И. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового папалелльного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика. 2019;2:3-23. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.02.3-23
Mole S, Williams R, Goebel H, editors. The Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (Batten Disease). Oxford: Oxford University Press; 2012. https://doi.org/10.1093/med/9780199590018.001.0001
Haines JL, Boustany, R-MN, Alroy J, Auger KJ, Shook KS, Terwedow H, Lerner TJ. Chromosomal localization of two genes underlying late-infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Neurogenetics. 1998;1:217-222. https://doi.org/10.1007/s100480050032
Maksimova N, Hara K, Miyashia A, Nikolaeva I, Shiga A, Nogovicina A, Sukhomyasova A, Argunov V, Shvedova A, Ikeuchi T, Nishizawa, Kuwano R and Onodera O. Clinical, molecular and histopathological features of short stature syndrome with novel CUL7 mutation in Yakuts: new population isolate in Asia. J Med Genet. 2007;44:772-778. https://doi.org/10.1136/jmg.2007.051979
Cain JT, Likhite S, White KA, Timm DJ, Davis SS, Johnson TB, Dennys-Rivers CN, Rinaldi F, Motti D, Corcoran S, Morales P, Pierson Ch, Hughes SM, Lee SY, Kaspar BK, Meyer K and Weimer JM. Gene therapy corrects brain and behavioral pathologies in CLN6-Batten Disease. Mol Ther. 2019;27:1836-1847. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2019.06.015

Закрыть метаданные

Нейрональный цероидный липофусциноз (НЦЛ) представляет собой наиболее распространенную группу нейродегенеративных заболеваний детского возраста, характеризующихся накоплением аутофлуоресцентных липопигментов в различных тканях [1]. Частота встречаемости НЦЛ в мире составляет от 1 до 8 на 100 000 новорожденных [2]. В настоящее время идентифицировано 14 типов НЦЛ (НЦЛ1-НЦЛ14), среди них в мире наиболее часто встречаются типы НЦЛ 1 типа, НЦЛ 2 типа и НЦЛ 3 типа [3]. В России наиболее распространенными являются НЦЛ 2 типа и НЦЛ 7 типа [4]. Всего описано 13 генов, которые вызывают НЦЛ (CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN4/DNAJC5, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8, CLN8, CLN10/CTSD, CLN11/GRN, CLN12/ATP13A2, CLN13/CTSF и CLN14/KCTD7) [5,6]. Большинство типов НЦЛ — это аутосомно-рецессивные заболевания, за исключением типа, вызванного мутацией в гене CLN4/DNAJC5, при котором заболевание имеет аутосомно-доминантный характер наследования [7]. В этих идентифицированных генах выявлены более 500 патогенных вариантов, которые являются причиной заболевания [2, 3].

НЦЛ 6 типа (OMIM 601780) относится к поздним инфантильным формам НЦЛ, вызван мутациями в гене CLN6. Ген CLN6 расположен на хромосоме 15q22-23 и кодирует белок, состоящий из 311 аминокислотных белков с 7 трансмембранными доменами [8]. В гене CLN6 согласно базе данных «NCL Mutation and Patient Database» (https://www.ucl.ac.uk/ncl-disease/mutation-and-patient-database) было установлено более 130 патогенных мутаций в разных популяциях, ответственных за причину широкой генетической гетерогенности заболевания. Белок CLN6 участвует в эндоцитозе лизосомальных белков, селективном транспорте липидов и белков, связанных с функцией и подкислением лизосом, и аутофагии [5, 9]. Возраст начала заболевания при НЦЛ 6 типа варьирует от 18 мес до 8 лет. Тип наследования заболевания аутосомно-рецессивный. Клинически дебютирует в виде прогрессирующей неврологической симптоматики — атаксии, эпилептических приступов, задержки психомоторного развития, нарушения зрения [10]. Пациенты с НЦЛ 6 типа были зарегистрированы в нескольких странах, в таких как Чешская Республика, Хорватия, Португалия, Америка, Европа, Индия, Пакистан, Турция, Китай и Япония [11—15]. В отечественной литературе исследований, посвященных НЦЛ, немного [4, 16]. В Якутии до настоящего времени данное заболевание не изучалось.

В статье представлены клинические, молекулярно-генетические характеристики больных — членов одной якутской семьи с НЦЛ 6 типа, причиной которого является мутация в гене CLN6.

Обследование семьи начиналось с осмотра врачом-генетиком и заполнения специально составленного протокола, включающего сроки проявления признаков заболевания, данные неврологического осмотра, функциональных и инструментальных методов исследования, генеалогическую карту.

Для молекулярно-генетического исследования использована ДНК пробанда и членов семьи, выделенная из образцов цельной крови. Кровь была взята с письменного согласия у родителей пациентов и членов семьи с заполнением информированного согласия. ДНК выделяли из 9 мл периферической крови стандартным методом с использованием протеиназы K и последующей фенольно-хлороформной экстракцией. В качестве консерванта использовали 0,5М ЭДТА. Все этапы пробоподготовки для парно-концевых ДНК библиотек и непосредственного секвенирования проведены согласно инструкции производителя Illumina (Illumina Inc., США). Молекулярно-генетический анализ был проведен у пробанда III-4 и ее родителей II-2, II-3 на секвенаторе MiSeq (Illumina Inc., США) с использованием панели Trusight Inherited Diseases Sequencing Panel (Illumina Inc., США), которая включает 552 целевых гена, ответственных за развитие тяжелых наследственных заболеваний детского возраста с аутосомно-рецессивным типом наследования.

Исследование проведено на базе научно-исследовательской лаборатории «Молекулярная медицина и генетика человека» Медицинского института ФГАОУ ВО «Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова» и Медико-генетического центра ГАУ РС(Я) Республиканской больницы №1 — Национального центра медицины. Настоящее исследование было одобрено локальным этическим комитетом Медицинского института ФГАОУ ВО «Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова» (Протокол №22 от 26.02.20).

Клиническое наблюдение

Пробанд (III-4): 8-летняя девочка, рожденная от неродственного брака. Родители пробанда якутской этнической группы, здоровые. Родословная представлена на рис. 1. Пробанд родилась от четвертой беременности, от вторых естественных родов, с весом при рождении 4120 г, ростом 56 см. Оценка по шкале Апгар — 8/9 баллов. До 3 лет ребенок развивался без особых отклонений, но отмечалась некоторая задержка речевого развития. В возрасте 3 года 9 месяцев ребенок стал часто падать, особенно на ягодичную область, появилась слабость в ногах. В 4 года больная не могла приседать из-за слабости в ногах, перестала ходить, начала передвигаться на четвереньках, возникли нарушения мелкой моторики, трудности с засыпанием, появились частые миоклонические приступы. МРТ головного мозга выявила атрофию полушарий и червя мозжечка. Видео-ЭЭГ-мониторинг регистрировал эпилептическую активность в виде комплексов пик-волна по морфологии доброкачественные эпилептиформные паттерны детства в правой центрально-височной области. Была назначена вальпроевая кислота. Молекулярно-генетические исследования на частые атаксии не выявили патологии. На основании неврологических симптомов и данных исследований головного мозга был установлен клинический диагноз лейкодистрофия. В возрасте 6 лет пациентка госпитализирована в отделение психоневрологии с жалобами на нарушение походки, частые падения, задержку психоречевого развития. МРТ головного мозга выявила атрофию коры, двустороннюю перивентрикулярную лейкоэнцефалопатию и атрофию мозжечка (рис. 2). По электроэнцефалограмме на фоне замедленной корковой активности с частотой 6 Гц регистрировалась пароксизмальная медленноволновая активность с включением множественных нечетких эпилептиформных комплексов по типу острая-медленная волна и двухфазных острых волн без четкой локализации. Исследование с помощью тандемной масс-спектрометрии не выявило данных за наследственные аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального бета-окисления. Больная была выписана с диагнозом «нейродегенеративное заболевание неясного генеза». В возрасте 8 лет окулистом была выявлена субатрофия зрительного нерва обоих глаз, в неврологическом статусе при осмотре продуктивному контакту была недоступна из-за выраженных когнитивных нарушений, больная самостоятельно не могла сидеть и ходить, наблюдались миоклонические приступы.

Рис. 1. Родословная пациента с НЦЛ 6 типа (НЦЛ 6 типа).

Стрелка указывает на пробанда (III-4); родители здоровые, являются гетерозиготными носителями мутации (II-2, II-3); сибс (III-5) тоже больна НЦЛ 6 типа.

Рис. 2. МРТ головного мозга пробанда в возрасте 6 лет.

а — сагиттальное T1-взвешенное изображение: видны атрофия мозжечка, атрофия коры головного мозга; б — коронарное T2-взвешенное изображение: наблюдается гиперинтенсивность перивентрикулярного белого вещества, атрофия мозжечка; в — аксиальное T2-взвешенное изображение FLAIR: корковая атрофия, наблюдается повышенная интенсивность МР-сигнала в перивентрикулярном белом веществе.

У младшей сестры пробанда (III-5), девочки 5 лет, наблюдались сходные симптомы и прогрессирующее течение, которые дебютировали в возрасте 4 лет. МРТ головного мозга выявила изменение интенсивности МР-сигнала в перивентрикулярной области белого вещества головного мозга с обеих сторон. Кроме того, у пациентки на первом году жизни была диагностирована гепатобластома в правой доле печени с метастазами в легкие, по поводу которой она получала комплексное лечение в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина (Москва). На момент данного исследования у нее наблюдается ремиссия рака печени; однако неврологические симптомы продолжают прогрессировать, больная не может самостоятельно сидеть и ходить. Офтальмоскопия выявила признаки ангиопатии сетчатки.

В результате молекулярно-генетического анализа у пробанда была обнаружена мутация c.396dupT (p.Val133CysfsTer18) в 4 экзоне гена CLN6, приводящая к сдвигу рамки считывания (референсный транскрипт: NM_017882.2) в гомозиготном состоянии, а также у ее родителей в гетерозиготном состоянии. Данный вариант ранее не был описан в ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) и отсутствовал в базах данных вариантов dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), HGMD (http: //www.hgmd. cf.ac.uk/), LOVD (https://www.lovd.nl/). Вариант c.396dupT был предсказан как патогенный на основе анализа биоинформатических программ SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg/; оценка 0,000), PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/; Оценка HumDiv 1.000, оценка HumVar 0.998) и MutationTaster (https://www.mutationtaster.org/; оценка 1.000). Биоинформатический анализ и интерпретация найденных вариантов проведены согласно «Руководству по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученными методами массового параллельного секвенирования» [17].

Для подтверждения результатов полноэкзомного секвенирования проведено прямое секвенирование по Сэнгеру на генетическом анализаторе ABI 3500 (Life Technologies, USA), с использованием олигонуклеотидных праймеров (см. таблицу).

Праймеры и условия проведения ПЦР участков гена CLN6

Ген	Экзон	Последовательность праймеров	T отжига, C°	Количество циклов
CLN6	4	F: 5’-GACAGTGCCCTCACCTAGC-3’ R: 5’-CTGGCCTGCTAAAGGGACC-3’	60	34

Результаты были аннотированы с использованием программного пакета SeqScape 3.0 Software (Applied Biosystems, USA), где подтвердилось наличие мутации c.396dupT в гене CLN6 у пробанда в гомозиготном состоянии (рис. 3, а). У сибса (III-5) также был обнаружен гомозиготный вариант выявленной мутации путем прямого секвенирования.

Множественное выравнивание последовательностей с помощью программы MUSCLE Sequence Alignment Tool (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) показало, что аминокислота валин в позиции 133 (Val133) высоко консервативна в процессе эволюции у семи позвоночных видов: Homo sapiens, Canis lupus, Bos Taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Gallus и Xenopus tropicals (рис. 3, б).

Рис. 3. Результаты молекулярно-генетического исследования.

а — результаты секвенирования по Сэнгеру якутской семьи, показывающие гомозиготный вариант c.396dupT в 4 экзоне гена CLN6 у больных сибсов и их родителей; б — анализ аминокислотной последовательности гена CLN6 с использованием инструмента MUSCLE Sequence Alignment Tool показывает, что Val133 высоко консервативен среди позвоночных. Выровненные гомологичные последовательности были получены от HomoloGene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/).

Обсуждение

НЦЛ 6 типа — рецессивно наследуемое нейродегенеративное заболевание, вызывающее эпилепсию, нарушение когнитивных функций, потерю зрения, регресс психомоторного развития [18]. Мутации в гене CLN6 были первоначально идентифицированы и картированы на хромосоме 15q21-23 у пациентов из Коста-Рики и Венесуэлы [19]. На сегодняшний день зарегистрировано более 130 патогенных вариантов CLN6, и о большинстве из них сообщается в базе данных «NCL Mutation and Patient Database» (https://www.ucl.ac.uk/ncl-disease/mutation-and-patient). С помощью массового параллельного секвенирования нами выявлена гомозиготная мутация c.396dupT (p.Val133CysfsTer18) в гене CLN6, приводящая к сдвигу рамки считывания и явившаяся причиной НЦЛ 6 типа в якутской семье. Данная мутация также была обнаружена в другой семье [4], вероятно, якутской национальности.

Якуты — это восточноазиатский народ, проживающий в северо-восточной части Сибири в Российской Федерации. В якутском населении часто встречаются некоторые редкие моногенные наследственные заболевания. Было доказано воздействие эффекта основателя, хорошо описанного в некоторых популяциях, который также был подтвержден в якутской популяции N. Maksimova и соавт. [20]. Таким образом, весьма вероятно, что данная мутация встречается с высокой частотой среди якутских больных, что требует дальнейшего изучения.

НЦЛ 6 типа характеризуется быстро прогрессирующим течением, приводящим к тяжелой инвалидизации пациентов. В приведенном случае у пробанда было поражение зрения, типичное для НЦЛ 6 типа, однако в недавних публикациях сообщается, что нарушение зрения не всегда возникает при этом заболевании [20]. В настоящее время проводятся клинические исследования генной терапии детей с НЦЛ 6 типа с использованием серотипа аденоассоциированного вируса 9 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02725580) [21]. Поэтому ранняя диагностика этого заболевания может быть целесообразной для подобной терапии в будущем.

В заключение следует отметить, что диагностика НЦЛ вызывает трудности ввиду выраженной генетической гетерогенности заболевания, а также из-за сходства по клиническим проявлениям с другими наследственными метаболическими заболеваниями. Введение в клиническую практику новых технологий ДНК-диагностики, таких как метод массового параллельного секвенирования (МПС, NGS) с использованием таргетных панелей, позволило сократить время исследования и, главным образом, выявить молекулярно-генетическую причину заболевания.

Работа поддержана Государственным заданием Министерства науки и высшего образования РФ (проект №FSRG-2020-0014 «Геномика Арктики: эпидемиология, наследственность и патология»).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.