Материал и методы

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом НЦ РВХ СО РАМН. Забор материала проводился интраоперационно, были отобраны три группы проб для оценки изменений ткани МПД на уровне L_III—L_IV, L_IV—L_V, L_V—S_I. В основу разделения на группы положена классификация остеохондроза по А.И. Осна (1971).

Группу 1 (начальные проявления дегенерации) составили 15 проб тканей (фрагменты объемом до 0,1—0,3 см³), полученных при механической перкутанной нуклеотомии и аспирации зондом Decompressor (Stryker) [1]. Возраст пациентов составлял 25—45 лет, в клинико-неврологическом статусе превалировала стойкая болевая и мышечно-тоническая симптоматика. Инструментальные методы диагностики демонстрировали начальные проявления остеохондроза [3, 4, 6]: 1-я и 2-я рентгенологическая стадия по А.И. Осна, наличие протрузий МПД от 2 до 5 мм. Таким образом, строение полученных образцов ткани считали наиболее близким к нормальному.

Группа 2, состоящая из 30 проб, представлена образцами (фрагменты 0,1—0,9 см³), полученными при традиционной микродискэктомии по Caspar. В этой группе процесс дегенерации имел наибольшую степень проявлений, что соответствовало 3-й и 4-й рентгенологической стадии остеохондроза по А.И. Осна, и проявлялся грыжами МПД подвязочной и интраканальной локализации (экструзия и секвестрация МПД) [3, 4, 6].

Фиксация тканей на стекле происходила естественным образом, после высушивания приготовленного среза с использованием стандартной гистологической техники. Размеры предметных стекол были стандартизированы, все образцы подписывались, имели краткую характеристику. Исследование микропрепаратов проводилось на участках, топологически соответствующих друг другу. Обеспечивалась гистологическая верификация области МПД для наноструктурного анализа путем цветной маркировки.

Исследования образцов тканей проводились с помощью зондовой нанолаборатории Ntegra Prima. Краткая спецификация прибора:

— максимальная область сканирования 75×90×10 мкм;

— видеомикроскоп с регулировкой увеличения и тонкой фокусировкой;

— система активной виброзащиты;

— широкий диапазон рабочих методик изучения, включая магнитные и электрические методики;

— система активных датчиков устранения артефактов, вызванных определенными особенностями пьезоэлектроники.

Все измерения проводились в лаборатории зондовой микроскопии при комнатных условиях на воздухе:

— температура окружающей среды 20±5 оС;

— дрейф температуры не превышал 1 оС/ч;

— относительная влажность не более 30%;

— атмосферное давление 760±30 мм рт.ст.;

— в отсутствие прямого света, акустических волн, с включенной активной системой подавления вибраций.

Ввиду достаточной прочности составляющих частей ткани МПД для исследования применялись методики контактной силовой микроскопии. В связи с тем, что исследование проводилось на свежих препаратах хряща, нами также использовалась техника полуконтактной микроскопии с целью максимального сохранения изначального рельефа поверхности и минимизации упругих деформаций образца жесткими режимами исследований [8].

В исследованиях использовались кантилеверы типа NSG-01, CSG-10, применялись стандартные параметры сканирования полуконтактного и контактного режимов.

При полуконтактном режиме применялся метод сканирования «Метод отображения фазы» для лучшего контраста разных по свойствам компонентов, а также актуализации мелких составляющих частей хряща. До начала сканирования проводилась амплитудная спектроскопия с целью предварительной оценки возможности сканирования данного участка, а также для предварительного исследования его жесткости и решения о правильности подобранных параметров сканирования. Частота развертки сканирования 0,98—1,03 Гц, разрешение 1024×1024 точки, ускорение и шаг сканирования устанавливались по умолчанию. Для минимизации эффектов задержки системы обратной связи устанавливали поперечное направление сканирования.

Для контактного режима сканирования применялись следующие параметры. Использовался кантилевер типа CSG-10, из-за своих специфических характеристик более подходящий для сканирования в контактном режиме. Применялся метод сканирования «Метод отображения распределения латеральных сил». При исследовании гистологических проб данная методика позволяет отображать механические характеристики разных участков поверхности. До начала сканирования проводилась силовая спектроскопия пьезоотклика с целью предварительной оценки возможности сканирования данного участка, а также для предварительного исследования его жесткости и определения правильности подобранных параметров сканирования. Частота развертки сканирования 0,80—0,98 Гц, разрешение 1024×1024 точки, ускорение и шаг сканирования устанавливались по умолчанию. Для минимизации эффектов задержки системы обратной связи также устанавливали поперечное направление сканирования.

Все исследования проходили при включенной активной системе виброизоляции и включенных емкостных датчиках, устраняющих артефакты, вызванные особенностями пьезоэлементов сканера.

Результаты

Применение метода АСМ позволило получить количественные признаки, характеризующие поверхность изученных образцов (см. таблицу)

с различной выраженностью дегенеративного процесса [3, 4, 6].

Группа 1 — начальные проявления дегенерации (рис. 1, 2).

Группа 2 — выраженные проявления дегенеративного процесса 3—4-й стадии остеохондроза (рис. 3, 4).

В результате проведенного исследования получен ряд параметров, важных для разработки математической модели развития дегенеративных процессов в МПД.

1. Параметр среднеквадратичной шероховатости — играет важную роль в характеристике оптических свойств поверхности (степень поглощения, рассеяния и отражения электромагнитного излучения).

2. Параметр асимметрии поверхности — может быть использован как одно из средств диагностики степени выраженности происходящих дегенеративных изменений. Математический смысл данного параметра заключается в том, что он является характеристикой графика гистограммы высот, построенного на основании полученных при АСМ результатов. Исходя из этого, в работе употреблен термин «асимметрия поверхности», т.е. насколько симметричным является статистическое выражение полученных данных на гистограмме распределения высот.

3. Мера эксцесса — характеризует отклонения гистограммы высот от формы кривой Гаусса, характеризует амплитуду колебания высот исследуемого образца поверхности.

На основании анализа этих параметров получены характеристики поверхности МПД при начальных и финальных проявлениях дегенеративного процесса.

При начальной степени дегенерации выявляются меньшие значения показателей шероховатости с изменением параметра от 200,032 до 400,014 нм с характерной большей однородностью поверхности. Показатели асимметрии поверхности изменяются от 0,12 до 0,22.

При значительной степени дегенерации зарегистрирована максимальная разнородность показателей асимметрии от 0,04 до 0,31. Размеры и форма распределения высот, характеризующие меру эксцесса (степень энтропии), также изменяются в сторону уменьшения упорядоченности при 3—4-й стадии остеохондроза.

При изучении меры эксцесса в группе 2 выявлено, что она демонстрирует значительные отклонения гистограммы высот при 3-й рентгенологической стадии остеохондроза, но при 4-й — отклонения гистограммы уменьшаются, а параметры шероховатости на некоторых участках близки к таковым у образцов с начальной степенью дегенерации в группе 1.

Исследование полученных образцов позволило выявить новые, наноструктурные признаки дегенерации МПД. Использование для этих целей АСМ представляется оптимальным по следующим причинам. Невысокая прочность живых тканей в состоянии in vivo обусловливает необходимость выбора методик, которые вносят наименьшее искажение в результаты за счет упругих и неупругих взаимодействий с поверхностью образца. Так, согласно закону сохранения импульса, при упругом взаимодействии происходит соударение кантилевера и поверхности с сохранением значений импульса. При неупругом взаимодействии соответственно при соударении происходит обмен энергией импульса, и его значение меняется для участвующих в процессе объектов. Характер исследуемого образца не позволяет исследовать его достаточно эффективно на приборах сканирующей туннельной микроскопии, так как биологические ткани обладают невысокой естественной проводимостью, и добиться удовлетворительных результатов исследований становится очень сложно [7—9]. В этом смысле вариативность используемых в АСМ методов исследования предоставляет выгодное преимущество. Объем получаемых методом АСМ данных позволяет проводить математическое моделирование стохастических процессов, т.е. процессов, поведение которых не является детерминированным, а последующее состояние системы, в которой они происходят, описывается величинами, которые могут быть как предсказаны, так и случайными.