Как известно, гистологическая верификация опухолей ЦНС имеет некоторые ограничения: морфолог, анализируя операционный материал, может получить данные, не совпадающие с данными МРТ. В настоящее время активно развивается новое направление в современной медицине — молекулярно-генетическая диагностика, результаты которой, в частности, нашли отражение и в новой классификации опухолей ЦНС ВОЗ, где выделена особая форма, объединяющая астроцитарные опухоли Grade II—IV — диффузная срединная глиома, характеризующаяся наличием мутации К27М в гене Н3F3A [1, 2]. Также в новой классификации впервые произошло объединение диффузных глиом Grade II—IV с астроцитарными и олигодендроглиальными гистологическими особенностями в одну группу в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена IDH1 [2]. Таким образом, исследование генетики опухолей дополняет гистологическую верификацию, что позволяет более точно определять диагноз и прогноз заболевания.

Принимая во внимание, что опухоли ЦНС характеризуются множеством генетических и эпигенетических нарушений, поиск и идентификация генов, непосредственно вовлеченных в канцерогенез, позволит совершенствовать дифференциальную диагностику заболевания и соответственно улучшить результаты лечения.

Цель настоящей работы — сравнительное молекулярно-генетическое исследование двух типов злокачественных глиом: анапластической астроцитомы и анапластической олигодендроглиомы и сопоставление выявленных изменений с клинико-морфологическими данными. Для этого были проанализированы следующие молекулярно-генетические параметры: точковые мутации в 132 кодоне гена IDH1, точковые мутации в 5—8 экзонах гена TP53, точковые мутации в 9, 14 и 29 экзонах гена ATRX, коделеция 1p19q, статус метилирования гена MGMT.

Материалом для исследования послужили образцы опухолевой ткани, полученные от 43 пациентов с диагнозами «анапластическая астроцитома» или «анапластическая олигодендроглиома». Все пациенты были оперированы в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко и затем прошли лучевую терапию в РНЦ рентгенорадиологии в период с 2005 по 2015 гг. В 2016 г. в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко совместно с коллегами из НГМУ был проведен повторный пересмотр и обсуждение биопсий, установленные ранее гистологические диагнозы подтверждены. Клинические данные по включенным в исследование пациентам представлены в табл. 1.

Образцы опухолевой ткани были предварительно депарафинизированы с помощью ксилола и спирта. Выделение ДНК проводили с помощью комплекта реагентов Ускоренная пробоподготовка (ООО «Лаборатория Изоген», Россия).

Амплификацию методом ПЦР 132 кодона гена IDH1, 5—8 экзонов гена TP53, 9, 14, 29 экзонов гена ATRX проводили с помощью набора реактивов GenPak PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген», Россия). Для секвенирования методом Сенгера полученных пцр-продуктов использовали набор реактивов Big Dye Terminator v 3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», США), непосредственно анализ проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer.

Для оценки статуса метилирования промоутерной области гена MGMT использовали набор ЭпиГенТест-MGMT (ЗАО «Евроген», Россия).

Определение коделеции 1p/19q в гистологических образцах опухолей проводили с помощью набора ДНК-зондов Vysis LSI 1p36/LSI 1q25 и LSI 19q13/19p13 Dual Color Probe. Для оценки результатов анализа применяли критерии, рекомендованные ASCO в 2013 г.

Мутации гена TP53 выявлены в 16 (37%) образцах опухолей: в экзоне 5 выявлено 3 мутации — c. 488A>G (p.Tyr163Cys); c.428T>G (p. V143G) и с. 376_378 delTAC (p. 126 delY); в экзоне 6 выявлено также 3 мутации — c. 652 G>A (p. V218M); c. 668 C>T (p. P223L) и с. 652_654 GTG (p. 218delV); в экзоне 7 выявлено 2 мутации: c. 733G>A (p. G245S) и c. 735G>A (p. G245D); в экзоне 8 выявлено больше всего мутаций —7 мутаций c. 817C>T (p. R273C) и по одной мутации c. 810T>G (p. F270L), с. 799C>T (p. R267W), c. 817C>T (p. R273C), с. 843С>G (p. D281E) и с. 844C>T (p. R282W) (рис. 1).

Мутации гена IDH1 выявлены в 25 образцах опухолей (58%): преимущественно выявлен вариант p. R132H (c. G395A) – 22 случая; в двух образцах была выявлена мутация p. R132S (c. C394A) и в 1 случае - p. R132G (c. C394G) (рис. 2).

Мутация гена ATRX выявлена в 9 (21%) случаях: в одном образце выявилось 2 мутации, затрагивающие экзоны 9 и 14 — в экзоне 9 вариант c. 2648_2649delAA и в экзоне 14 — вариант c. 4261C>T (p. Q1421X); помимо этого в экзоне 9 выявлена мутация с. 1149_1152delCAG, а в экзоне 14 — c. 4276С>T (p. R1426X). В экзоне 29 было выявлено 6 мутаций: 2 мутации c.6338_6341delTTAT и по одной мутации с. 6491G>A (p. R2164K), с. 6467A>G (p.Q2156R), с. 6338T>C (p. F2113S), c. 6470 C>G (p. T2157S) c. 6488A>C (p. Y2163S).

Метилирование промоутера гена MGMT выявлено в 20 (46%) образцах опухолей.

Коделеция 1p19q была обнаружена в 8 (17%) образцах опухолей.

В табл. 2 представлены

В исследование были включены две гистологические разновидности злокачественных диффузных глиом — анапластическая астроцитома и анапластическая олигодендроглиома. Мы не включили в работу случаи смешанных олигоастроцитарных опухолей, пытаясь найти четкие генетические различия между астроцитарными глиомами и олигодендроглиальными опухолями.

Исходя из собственного опыта, мы можем утверждать, что привычка морфологов к гипердиагностике олигоастроцитом достаточно распространена и слегка варьирует от одного диагностического центра к другому. Данная ситуация нашла свое отражение в новой классификации ВОЗ опухолей ЦНС, содержащей четкое определение, согласно которому участок олигодендроглиальной гистологии среди диффузной астроцитомы вполне совместим с диагнозом «диффузная астроцитома» или «анапластическая астроцитома» при отсутствии коделеции 1p19q [2]. Кроме того, некоторые исследователи [3], опираясь на молекулярные особенности диффузных глиом, склоняются к мысли о том, что нозологическая единица «олигоастроцитома» не существует, что за астроцитарную часть «олигоастроцитомы» принимается реактивный астроцитарный компонент.

Исследовав мутационный статус, эпигенетические события и количественные изменения на хромосомах в 29 анапластических астроцитомах и 14 анапластических олигодендроглиомах, мы увидели четкую связь этих опухолей с возрастом, локализацией и выявленными нарушениями. Обращает на себя внимание отсутствие изучаемых нарушений в опухолях неполушарной локализации, в то время как в литературе [2, 4] описаны единичные случаи злокачественных IDH1-мутантных диффузных глиом с локализацией в мозжечке. Большинство из выявленных нами генетических нарушений возникали в опухолях у молодых людей 30—40-летнего возраста, преимущественно поражавших лобные доли. Кроме того, нередко были сочетания нескольких генетических нарушений в одном образце опухоли. Имелись некоторые различия в частоте возникновения генетических нарушений в анапластических астроцитомах и в анапластических олигодендроглиомах: в олигодендроглиальных опухолях чаще возникали мутации генов IDH1 (64% против 55% в анапластических астроцитомах), причем возраст пациентов с мутантными опухолями в этом случае был гораздо старше — можно было видеть мутации в анапластических олигодендроглиомах у пациентов старше 50—60 лет, среди IDH1-мутантных анапластических астроцитом возраст пациентов не превышал 50 лет; метилирование гена MGMT также чаще встречалось в анапластических олигодендроглиомах (71% по сравнению с 34% в анапластических астроцитомах); в то время как мутация гена TP53 чаще развивалась в анапластических астроцитомах (41%) и только приблизительно в 1/3 (28%) всех анапластических олигодендроглиом.

Наблюдались и существенные молекулярные отличия анапластических астроцитом от анапластических олигодендроглиом: коделеция 1p19q была выявлена в олигодендроглиальных опухолях, в то время как мутация гена ATRX (за единственным исключением) — только в анапластических астроцитомах. Единственный необъяснимый случай сочетания мутации ATRX и коделеции 1p19q был выявлен в анапластической олигодендроглиоме, развившейся в височной доле у женщины 66 лет с длительным дооперационным периодом, которая в течение 2 лет наблюдалась по поводу внутримозговой опухоли. Также в опухоли этой пациентки были выявлены мутация в гене IDH1 и метилированный ген MGMT. Повторно пересматривая гистологические препараты на предмет наличия астроцитарного компонента, мы подтвердили диагноз «анапластическая олигодендроглиома», не найдя гистологических признаков астроцитарной дифференцировки в присланном на исследование материале. На сегодняшний день мы не готовы объяснить сочетание мутации ATRX и коделеции 1p19q в геноме опухоли, что, возможно, или является артефактом, или это опухоль, имеющая гистологическое строение, совместимое с диагнозом «анапластическая олигодендроглиома», но с молекулярными особенностями все же существующей олигоастроцитомы?

За исключением вышеописанного случая, полученные нами данные вполне согласуются с данными, полученными другими авторами [5—10], которые рекомендуют иммуногистохимическое исследование мутантного протеина ATRX с помощью коммерчески доступных антител (HPA001906, SigmaAldrich; anti-human ATRX antibody ab97508, Abcam в разведении 1:800) как простой и надежный способ не только исследования мутационного статуса данного гена, но и для отличия олигодендроглиальных опухолей от астроцитом [5, 6, 11—15], что представляется более удобным, чем кропотливое исследование гена ATRX, повреждение которого может затрагивать большое количество экзонов.

Иммуногистохимическое исследование также может быть рекомендовано и как первый этап поиска мутаций в гене IDH1. Ранее мы уже рекомендовали использовать для этого исследования коммерчески доступное антитело Anti-Human IDH1 R132H astrocytoma and oligodendroglioma tumor cell marker mouse monoclonal antibody фирмы «Dianova» клон H09 в разведении 1:20 [16], с помощью которого можно отлично выявлять мутацию гена IDH1 — R132H, на долю которой приходится приблизительно 90% от общего количества выявляемых мутаций в гене IDH1. Для выявления оставшихся 10% необходимо выполнять прямое секвенирование кодона 132 гена IDH1: в нашем исследовании мутация с заменой аргинина в позиции 132 на гистидин (R132H) выявлена в 88%; мутации с другими заменами — аргинин в позиции 132 на серин (R132S) и аргинин в позиции 132 на глицин (R132G) были обнаружены в 12% случаев. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, желательно исследовать кодон 172 гена IDH2 [2].

Что касается выявления мутации гена TP53, то здесь речь может идти только о секвенировании. Иммуногистохимическая ядерная экспрессия TP53 нечетко коррелирует с выявлением мутации гена TP53 [9]. Предпочтительными методами исследования статуса метилирования промотора гена MGMT и коделеции 1p19q являются соответственно метилспецифическая полимеразная цепная реакция (МПЦР), бисульфидное пиросеквенирование, требующее 0,5—1 мкг ДНК и флуоресцентная гибридизация in situ и микросателлитный анализ потери гетерозиготности [17].

При гистологической картине смешанной олигоастроцитомы (анапластическая олигоастроцитома) для уточнения гистологического диагноза рекомендуется проводить исследование мутации гена ATRX и коделеции 1p19q с применением зондов Vysis («Abbott») или Kreatech. Исследование мутационного статуса генов IDH1 и ATRX целесообразнее начинать с иммуногистохимического исследования; при отрицательной экспрессии IDH1 желательно выполнить исследование мутации этого гена в кодоне 132 методом прямого секвенирования для выявления точковых мутаций, отличных от R132H. Также необходимо исследовать и кодон 172 гена IDH2. В алгоритм диагностики полушарных злокачественных глиом следует включить изучение мутационного статуса генов BRAF и H3F3A, что, безусловно, улучшит качество молекулярно-гистологической диагностики опухолей и дальнейшего лечения с использованием таргетных препаратов [18, 19]. Согласно рекомендациям [17, 20], при злокачественных полушарных опухолях у взрослых при возможности необходимо изучать статус метилирования промоутера гена MGMT. Вероятно, что в ближайшее время список включенных в исследование генов при диффузных глиомах может пополниться генами TERT, CIC и FUBP1, диагностическое и прогностическое значение которых широко изучается в настоящее время [10, 11, 13, 15, 18, 20—24].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: mrizhova@nsi.ru

Статья посвящена одной из актуальных проблем современной онкологии — дифференциальной диагностике опухолей головного мозга. Авторы проанализировали молекулярно-генетические особенности анапластических астроцитом и олигодендроглиом в серии из 43 наблюдений. Анализ включал исследование точковых мутаций в 132 кодоне гена IDH1, точковых мутаций в 5—8 экзонах гена TP53, точковых мутаций в 9, 14 и 29 экзонах гена ATRX, коделецию 1p19q, статус метилирования гена MGMT. Полученные авторами на небольшом материале, но очень убедительные данные позволили рекомендовать при уточнении диагноза проведение молекулярно-генетического анализа с применением данных маркеров, причем с учетом гистологических и иммуногистохимических особенностей опухоли согласно предложенному алгоритму исследования. По мнению авторов, дальнейшие исследования могут внести определенные коррективы, связанные в первую очередь с включением других молекулярно-генетических маркеров, диагностическое и прогностическое значение которых широко изучается в настоящее время.

Работа выполнена на современном уровне с применением высокочувствительных методов исследования (ПЦР, секвенирование по Сенгеру), которые в то же время вполне доступны для использования лабораториями учреждений практического здравоохранения.

Текст статьи написан хорошим научным языком, иллюстрирован двумя таблицами и двумя рисунками. Результаты представлены четко и понятно. Хорошо представлен раздел «Обсуждение», в котором авторы излагают свое видение рассматриваемой в статье проблемы, касающейся сложности диагностики опухолей головного мозга. Библиографический список вполне достаточен, включает 23 работы, обращает на себя внимание то, что все статьи изданы за последние 5 лет.

Представленная работа, несомненно, актуальна и имеет большое научно-практическое значение.

А.Х. Бекяшев ( Москва)